虎七散含药血清对食管癌细胞Ec9706糖酵解的影响及AMPK/FOXO3a通路的调节作用研究

目的研究虎七散含药血清对食管癌细胞Ec9706糖酵解的影响及对磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)/叉头框蛋白O3a(FOXO3a)通路的调节作用。方法收集Ec9706细胞,接种于细胞培养皿中,分别设置空白对照组、虎七散低、中、高剂量组及顺铂组,虎七散各剂量组分别加入虎七散含药血清,顺铂组加入2μg·mL^(-1)的顺铂,空白对照组加入新鲜DMEM培养液,四噻唑蓝(MTT)法测定Ec9706细胞增殖率,酶联免疫吸附法(ELISA)测定Ec9706细胞葡萄糖摄取量、乳酸生成量、己糖激酶(HK)及乳酸脱氢酶(LDH)活性,划痕实验测定Ec9706细胞24h迁移率,Transwell实验测定Ec9706细胞侵袭率,流式细胞术测定Ec9706细胞凋亡率,实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)测定Ec9706细胞FOXO3a、B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤2(Bcl-2)及乳酸脱氢酶A(LDHA)mRNA水平,免疫印迹法(Western blot)测定Ec9706细胞p-AMPK、FOXO3a、Bax、Bcl-2及LDHA蛋白水平。结果与空白对照组比较,虎七散各剂量组及顺铂组Ec9706细胞24 h、48 h及72 h增殖率、葡萄糖摄取量、乳酸生成量、HK活性及LDH活性,Ec9706细胞24 h迁移率、侵袭率、Bcl-2及LDHA mRNA及蛋白水平、p-AMPK/AMPK水平显著降低(P<0.05),Ec9706细胞凋亡率、FOXO3a、Bax mRNA及蛋白水平显著升高(P<0.05),且随着虎七散剂量的增加,Ec9706细胞各项指标变化更优。结论虎七散能够显著抑制食管癌Ec9706细胞糖酵解过程,进而抑制Ec9706细胞增殖、迁移及侵袭过程,促进Ec9706细胞凋亡,其机制可能与调节AMPK/FOXO3a通路有关。

槲皮素调控AKT1/AMPK/Foxo3a信号通路抑制C2C12细胞凋亡

目的:基于AKT1/AMPK/Foxo3a信号通路探讨槲皮素对C2C12细胞增殖、成肌分化和凋亡的影响。方法:体外培养C2C12细胞进行成肌诱导,分别采用CCK8法(Cell Counting Kit-8)、ATP染色法及TUNEL法检测槲皮素对C2C12细胞增殖活力、成肌能力和凋亡的影响;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)分别检测MyoD1和Myogenin基因和蛋白表达,筛选合适浓度。再采用合适浓度的槲皮素或AKT1通路抑制剂(LY294002)干预成肌诱导后的C2C12细胞,ATP法和TUNEL法分别检测C2C12细胞成肌能力和凋亡水平,Western blot检测p-AKT1、p-AMPK和p-Foxo3a蛋白表达水平。结果:①在一定范围内,槲皮素呈浓度依赖性促进C2C12增殖,12.5μmol/L的槲皮素显著促进C2C12细胞成肌分化,能显著提高成肌标志物MyoD1和Myogenin基因和蛋白表达,因此本研究选择12.5μmol/L的槲皮素用于后续研究。②10μmol/L LY294002显著抑制C2C12细胞成肌分化,促进细胞凋亡,抑制p-AKT1和p-AMPK蛋白表达,促进p-Foxo3a蛋白表达;12.5μmol/L槲皮素联合10μmol/L LY294002显著促进C2C12细胞成肌分化,抑制细胞凋亡,促进p-AKT1和p-AMPK蛋白表达,抑制p-Foxo3a蛋白表达。结论:槲皮素通过调控AKT1/AMPK/Foxo3a信号通路的磷酸化促进C2C12细胞增殖和分化,抑制细胞凋亡。

骨疏方调节FoxO3a/Wnt信号通路对H_(2)O_(2)诱导成骨细胞损伤的影响

目的探讨骨疏方调节FoxO3a/Wnt信号通路对过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导成骨细胞损伤的影响。方法CCK-8法检测不同浓度(0.01、0.1、1、10、100μmol/L)的骨疏方对H_(2)O_(2)诱导的MC3T3-E1细胞活力。随后设置对照组、H_(2)O_(2)(150μmol/L H_(2)O_(2))组、骨疏方组、骨疏方+空载体组、骨疏方+FoxO3a过表达组。CCK-8法、ELISA分别检测细胞活力、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA);成骨诱导分化后,碱性磷酸酶(ALP)试剂盒及茜素红分析ALP活性、细胞骨矿化结节;qRT-PCR检测成骨相关基因OPN mRNA、Runx2 mRNA以及FoxO3a mRNA表达水平;Western blot检测通路相关蛋白FoxO3a、Wnt2、β-连环蛋白(β-catenin)表达水平。结果与对照组比较,H_(2)O_(2)组MDA、FoxO3a表达显著增加,细胞活力、SOD、ALP活性、骨矿化结节数量、OPN mRNA、Runx2 mRNA、Wnt2、β-catenin表达显著降低(P<0.05);与H_(2)O_(2)组比较,骨疏方组MDA、FoxO3a表达显著降低,细胞活力、SOD、ALP活性、骨矿化结节数量、OPN mRNA、Runx2 mRNA、Wnt2、β-catenin表达显著增加(P<0.05);与骨疏方+空载体组比较,骨疏方+FoxO3a过表达组MDA、FoxO3a表达显著增加,细胞活力、SOD、ALP活性、骨矿化结节数量、OPN mRNA、Runx2 mRNA、Wnt2、β-catenin表达显著降低(P<0.05)。结论骨疏方可改善H_(2)O_(2)诱导成骨细胞损伤,可能与抑制FoxO3a/Wnt信号通路有关。

扶正解毒方对病毒性心肌炎大鼠氧化应激及Sirt1/FoxO3a通路的影响

目的 基于沉默信息调节因子2相关酶1(Sirt1)/叉头蛋白O3a(FoxO3a)通路探究扶正解毒方对病毒性心肌炎(VMC)大鼠的影响。方法 大鼠腹腔注射柯萨奇B3病毒(CVB3)法建立VMC模型,随机分为模型组、扶正解毒方低剂量组(28 g/kg)、扶正解毒方高剂量组(112 g/kg)、EX527组(Sirt1抑制剂,1μg/kg)、扶正解毒方(28 g/kg)+EX527(1μg/kg)组,每组15只,另取未造模的正常大鼠15只为正常组,连续给药10 d。检测大鼠超声心动图Tie指数,HE染色观察心肌组织病理损伤情况,ELISA法检测血清心肌损伤标志物、氧化应激水平,TUNEL法检测心肌组织细胞凋亡率,免疫组化法检测心肌组织Sirt1表达,Western blot法检测心肌组织FoxO3a、磷酸化FoxO3a(p-FoxO3a)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、过氧化氢酶(CAT)、细胞周期抑制蛋白p27、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(caspase3)表达。结果 与正常组比较,模型组大鼠心肌细胞坏死加重,大鼠出现死亡,Tie指数、血清心肌损伤标志物、氧化应激指标水平均升高(P<0.05),Sirt1/FoxO3通路蛋白及其介导的抗氧化应激、抗凋亡相关蛋白表达降低(P<0.05);与模型组比较,扶正解毒方各剂量组大鼠无死亡,心肌组织损伤得以缓解,Tie指数、血清心肌损伤标志物、氧化应激指标水平均降低(P<0.05),Sirt1/FoxO3通路蛋白及其介导的抗氧化应激、抗凋亡相关蛋白表达升高(P<0.05);EX527可加重VMC大鼠的死亡及心肌细胞氧化损伤等症状,并逆转扶正解毒方对抗病毒性心肌炎的作用(P<0.05)。结论 扶正解毒方可通过激活Sirt1/FoxO3a通路缓解VMC大鼠心肌氧化应激损伤。

川陈皮素调节AMPK/NLRP3信号通路对脂多糖诱导的肾小球系膜细胞炎性损伤的影响

目的探讨川陈皮素(Nobiletin)调节AMP激活的蛋白激酶(AMPK)/NOD样受体蛋白3(NLRP3)信号通路对脂多糖(LPS)诱导的肾小球系膜细胞HBZY-1炎性损伤的影响。方法将HBZY-1细胞分为5组:正常组、LPS组(100 ng·m L^(-1)LPS)、川陈皮素组(100 ng·m L^(-1)LPS+40μmol·L^(-1)川陈皮素)、AMPK/NLRP3信号通路抑制剂雷帕霉素组(100 ng·m L^(-1)LPS+0.5μmol·L^(-1)雷帕霉素)、川陈皮素+雷帕霉素组(100 ng·m L^(-1)LPS+40μmol·L^(-1)川陈皮素+0.5μmol·L^(-1)雷帕霉素)。MTT法检测HBZY-1细胞毒性和增殖;ELISA法检测HBZY-1细胞白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)含量;流式细胞术检测细胞凋亡;Western Blot法检测AMPK/NLRP3信号通路蛋白水平。结果与正常组比较,LPS组CAT、SOD、GSH水平、细胞OD值以及AMPK蛋白水平明显降低(P<0.05),细胞凋亡率、IL-1β、IL-6、TNF-α含量以及NLRP3蛋白水平明显升高(P<0.05)。与LPS组比较,川陈皮素组CAT、SOD、GSH水平、OD值以及AMPK蛋白水平明显升高(P<0.05),细胞凋亡率、IL-1β、IL-6、TNF-α含量以及NLRP3蛋白水平明显下降(P<0.05);而雷帕霉素组以上指标均呈现与川陈皮素组相反的趋势(P<0.05)。与川陈皮素组比较,川陈皮素+雷帕霉素组以上指标均呈现与川陈皮素组相反的趋势(P<0.05)。结论川陈皮素可能通过上调AMPK/NLRP3信号通路减轻LPS诱导的肾小球系膜细胞细胞炎性损伤。下调AMPK/NLRP3信号通路可消除川陈皮素对LPS诱导的肾小球系膜细胞细胞炎性损伤的改善作用。

木糖醇通过调节PI3K/Akt/FoxO1/NF-κB通路改善2型糖尿病小鼠肾损伤

目的探究木糖醇改善2型糖尿病(T2DM)肾损伤的作用机制。方法将小鼠随机分为正常对照组(NC组)、糖尿病对照组(DC组)、10%木糖醇组(DX10组)、20%木糖醇组(DX20组),每组6只。除NC组外,其余各组小鼠均用链脲佐菌素(40 mg/kg)构建T2DM模型。造模成功后,在正常饲料中加入不同比例的木糖醇连续喂养8周。通过试剂盒检测小鼠空腹血糖(FBG);采用ELISA法测定血清中白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量;比色法检测肾组织过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)和总抗氧化能力(T-AOC);苏木精-伊红(H-E)染色观察肾组织的形态学变化;Western-blot法检测小鼠肾组织p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-FoxO1、FoxO1、NF-κB、ICAM-1、Bcl-2和Bax蛋白的表达情况。结果(1)与NC组比较,DC组FBG升高(P<0.01),木糖醇干预后下降,且DX20组下降更显著(P<0.05);(2)与NC组比较,DC组IL-6和TNF-α分泌增加(P<0.0001),木糖醇干预后均下降,且DX20组下降更显著(P<0.0001);(3)与NC组比较,DC组CAT和T-AOC活性下降、MDA含量升高(P<0.01),木糖醇干预后,CAT和T-AOC活性升高而MDA含量降低(P<0.05),且DX20组变化更显著(P<0.05);(4)H-E染色显示,木糖醇干预可改善小鼠糖尿病肾损伤,且DX20组效果更佳(P<0.05);(5)Western-blot检测显示,与NC组比较,DC组小鼠肾组织中p-PI3K、p-Akt、p-FoxO1和Bcl-2/Bax均降低(P<0.0001,P<0.001,P<0.01,P<0.001)、NF-κB入核增多(P<0.0001)、ICAM-1升高(P<0.01);与DC组比较,木糖醇干预可逆转相关蛋白的变化,且DX20组变化更显著(P<0.05)。结论木糖醇可通过活化PI3K/Akt/FoxO1及抑制NF-κB通路改善T2DM小鼠肾损伤。

甲基莲心碱通过调节AMPK/mTOR/NLRP3信号通路减轻慢性皮肤溃疡大鼠的炎症反应

目的:探讨甲基莲心碱(Nef)调节AMP活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)信号通路对慢性皮肤溃疡(CSU)大鼠炎症反应的影响。方法:将90只大鼠随机分为空白对照组(NC组)、CSU组、Nef组、AMPK抑制剂(Compound C)组、Nef+Compound C组,每组18只大鼠。除NC组外的其他各组大鼠通过剪开创口注射氢化可的松以及喷洒金黄色葡萄球菌构建CSU大鼠模型。造模完成后,Nef组和Compound C组分别将20%Nef、10μmol·L^(-1) Compound C与50 mL的20%高渗盐水凝胶混合敷在伤口处,Nef+Compound C组将20%Nef和10μmol·L^(-1) Compound C一起添加到20%高渗盐水凝胶中敷在伤口处,持续治疗2周,NC组、CSU组用等量盐水凝胶处理伤口。观察大鼠皮肤创面愈合情况;ELISA法检测血清白细胞介素(IL)-1β、IL-8、TNF-α水平;水解法检测创面肉芽组织中羟脯氨酸(HyP)水平;HE染色检测肉芽组织病理学变化;Western blotting检测CCL4、CCL2、CXCL12以及AMPK/mTOR/NLRP3信号通路蛋白表达水平。结果:CSU组大鼠可看到新生肉芽组织,并且有大量炎症细胞浸润现象,CSU组较NC组IL-1β、IL-8、TNF-α含量显著升高(P<0.05);与CSU组相比,Nef组创面愈合率、HyP含量、p-AMPK/AMPK蛋白水平显著增加(P<0.05),IL-1β、IL-8、TNF-α含量、CCL2、CXCL12、CCL4、mTOR、NLRP3蛋白水平显著下降(P<0.05),而Compound C组趋势相反(P<0.05);Compound C消除了Nef对CSU大鼠炎症反应的减轻作用。结论:Nef可能通过调控AMPK/mTOR/NLRP3信号通路减轻CSU大鼠炎症反应。

PI3K/Akt/FoxO1信号通路对人源肺动脉平滑肌细胞及肺动脉高压大鼠细胞凋亡的影响

目的探究磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/叉头框蛋白O1(FoxO1)信号通路对人源肺动脉平滑肌细胞(hPASMC)及肺动脉高压大鼠细胞凋亡的影响。方法细胞实验部分,将hPASMC分为4组:(1)空白对照组;(2)血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)组;(3)PDGF-BB+LY294002组;(4)PDGF-BB+紫杉醇(paclitaxel)组。采用TUNEL检测细胞凋亡,采用蛋白质印迹法检测Bcl-2、裂解的胱天蛋白酶-3(cleaved caspase-3)和PI3K/Akt/FoxO1信号通路相关蛋白表达水平。动物实验部分,将12只SD大鼠随机分为4组:(1)空白对照组;(2)野百合碱(MCT)组;(3)MCT+LY294002组;(4)MCT+paclitaxel组。采用Western blot检测Bcl-2、cleaved caspase-3和PI3K/Akt/FoxO1信号通路相关蛋白表达水平。结果细胞实验部分:相比于PDGF-BB组,PDGF-BB+LY294002组与PDGF-BB+paclitaxel组的Bcl-2表达水平下降(P<0.01),cleaved caspase-3表达水平上升(P<0.01);相比于空白对照组,PDGF-BB+LY294002组与PDGF-BB+paclitaxel组的凋亡率增加(P<0.01)。动物实验部分:相比于MCT组,MCT+LY294002组与MCT+paclitaxel组Bcl-2、磷酸化Akt与磷酸化FoxO1表达水平下降(P<0.01),cleaved caspase-3与FoxO1表达水平上升(P<0.01)。各组之间PI3K表达水平无显著差异。结论PI3K/Akt/FoxO1信号通路抑制hPASMC与肺动脉高压大鼠肺组织的细胞凋亡。

右美托咪定经STAT3/FoxO3a信号转导通路对减轻H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤的作用

目的建立大鼠心肌细胞系H9C2细胞缺氧/复氧模型,探究STAT3/FoxO3a信号转导通路在右美托咪定(Dex)保护心肌缺氧/复氧损伤中的作用。方法实验时间:2023年7月至11月,地点:香港大学深圳研究院实验室。使用对数生长期的H9C2心肌细胞进行实验,将其分为不同组别:对照组(C组)、缺氧/复氧组(H/R组,缺氧6 h/复氧12 h)、Dex预处理后缺氧/复氧组(D组),以及添加STAT3抑制剂Stattic+Dex预处理后缺氧/复氧组(S组)。通过CCK8试剂盒检测细胞活力,乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测细胞损伤,丙二醛(MDA)试剂盒检测氧化应激水平,使用蛋白免疫印迹法检测相关蛋白的表达。统计学方法采用单因素方差分析。结果H/R组H9C2细胞活力、Bcl-2和P62蛋白水平均低于C组,LDH、MDA、Bax、CC-3、LC3和Beclin-1蛋白水平均高于C组(均P<0.05)。Dex组细胞活力、P-STAT3/STAT3比值及Bcl-2、P62、FoxO3a蛋白水平均高于H/R组,LDH、MDA含量及Bax、CC-3、LC3、Beclin-1蛋白水平均低于H/R组(均P<0.05)。STAT3抑制剂可减弱Dex对心肌细胞损伤的保护作用。结论Dex预处理通过STAT3/FoxO3a信号转导通路,抑制心肌细胞的凋亡和自噬,降低氧化应激水平,减轻缺氧/复氧H9C2细胞损伤,从而减轻心肌缺血再灌注损伤。

基于SIRT3/AMPK通路探讨齐墩果酸对病毒性心肌炎小鼠炎症及纤维化损伤的影响

目的探究齐墩果酸对病毒性心肌炎(VMC)小鼠炎症及纤维化损伤的影响。方法采用腹腔注射柯萨奇B3病毒(CVB3)构建VMC小鼠模型,并随机分为模型组、齐墩果酸组、SIRT3抑制剂(3-TYP)组、齐墩果酸+3-TYP组,每组15只;另取15只小鼠作为正常组,各组给予相应药物处理7d。采用超声心动图检测心功能,ELISA法检测血清心肌损伤标志物[肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌钙蛋白(cTnI)]、炎症因子[白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)]水平,流式细胞术检测外周血辅助性T细胞17(Th17)/调节性T细胞(Treg)比例以评价免疫功能,HE、Masson及TUNEL染色观察心肌组织炎症、纤维化、凋亡等病理损伤,免疫荧光法、免疫组化法分别检测心肌组织SIRT3、转化生长因子-β(TGF-β)阳性表达,蛋白印迹法检测SIRT3/AMPK通路及下游相关蛋白表达。结果与正常组比较,模型组小鼠饮食减少,萎靡、耸毛、弓背蜷缩行为增多,出现死亡,心肌细胞病理损伤严重,心率、左心室射血分数、心肌组织SIRT3阳性表达、SIRT3、p-AMPK/AMPK蛋白表达降低(P<0.05),左心室收缩末期内径、左心室舒张末期内径、血清CK-MB、cTnI、IL-1β、IL-6水平、外周血Th17/Treg比例、心肌胶原容积分数、心肌细胞凋亡率、TGF-β阳性表达、p-NF-κB/NF-κB、Bax、TGF-β、p-Smad3/Smad3、α-SMA、FN蛋白表达升高(P<0.05);与模型组比较,齐墩果酸可缓解小鼠VMC病理症状,上调SIRT3/AMPK通路相关蛋白表达(P<0.05),下调其介导的炎症、凋亡、纤维化反应(P<0.05),而3-TYP可逆转齐墩果酸的上述作用(P<0.05)。结论齐墩果酸可能通过激活SIRT3/AMPK通路,抑制CVB3感染引起的VMC小鼠心肌组织炎症、凋亡及纤维化反应,从而改善VMC小鼠心功能。

半硫丸调控AMPK/PPARγ/GPAT3信号通路对甲减模型大鼠脂质代谢异常的保护作用

目的探讨半硫丸调控AMPK/PPARγ/GPAT_(3)信号通路,改善甲减模型大鼠脂质代谢异常的作用及其机制。方法60只SD雄性大鼠随机分为正常组、模型组、优甲乐组、半硫丸低剂量组、半硫丸高剂量组、联合用药组,每组10只,除正常组外,其余各组大鼠灌胃给予10 mg/kg丙硫氧嘧啶4周制备甲减模型,造模成功后干预6周,ELISA法检测血清甲状腺功能及血脂水平,RT-qPCR法检测肾周脂肪组织PPARγ、GPAT_(3)mRNA表达,Western Blot法检测肾周脂肪组织TSHR、AMPK、PPARγ、GPAT_(3)蛋白表达。结果与正常组比较,模型组大鼠血清FT3、FT4降低(P<0.01),TSH、TG、TC、LDL-C水平升高(P<0.01),肾周脂肪组织PPARγ、GPAT_(3)mRNA表达以及TSHR、PPARγ、GPAT_(3)蛋白表达升高(P<0.01),p-AMPK蛋白表达降低(P<0.01)。与模型组比较,各给药组大鼠血清TC、LDL-C水平降低(P<0.01),优甲乐组和联合用药组TG水平降低(P<0.01),半硫丸各组肾周脂肪组织PPARγmRNA表达以及TSHR、PPARγ蛋白表达降低(P<0.01),p-AMPK蛋白表达升高(P<0.01),各给药组GPAT_(3)mRNA及蛋白表达降低(P<0.01)。结论半硫丸可能通过调控TSHR介导的AMPK/PPARγ/GPAT_(3)信号通路改善甲减导致的脂质紊乱,这种机制与优甲乐不同。

咖啡酸苯乙酯通过AMPK/FOXO3a信号通路缓解猪精液常温保存氧化应激的作用机制

【目的】探究咖啡酸苯乙酯(caffeic acid phenethyl ester,CAPE)通过AMPK/FOXO3a信号通路缓解氧化应激对猪精液的影响及其分子机制。【方法】选取8头成年(1—2岁)、健康状况良好长白种公猪进行鲜精采集,将质检合格的样品混池待用。试验设计如下:首先,在常温基础稀释液中分别添加0、0.02、0.04、0.06、0.08和0.10 g·L^(-1)浓度的CAPE,将精液样品与各个浓度组依次混合后放置室温平衡,随即转入17℃电子恒温冰箱进行常温保存。全自动精子分析仪(CASA)测定1—5 d精子运动学参数(总活率与渐进性活力),筛选出最佳适宜浓度为0.06 g·L^(-1)。其次,将0.06 g·L^(-1) CAPE与400μmol·L^(-1)的H_(2)O_(2)建立氧化胁迫模型,在第1、3、5天分别采用CASA测定精子总活率与渐进性活力,荧光探针技术评估质膜完整性与顶体完整性,抗氧化试剂盒检测过氧化氢酶(catalase,CAT)与超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性,在第5天利用实时荧光定量PCR技术测定AMPK/FOXO3a信号通路下游靶向基因(AMPK、FOXO3a、SOD1、SOD2、CAT)及凋亡基因BAX的mRNA表达水平,蛋白免疫印记技术测定AMPK、p-AMPK蛋白表达。【结果】(1)浓度筛选试验中,0.06 g·L^(-1)的CAPE在保存第3天显著提高精子的总活率并维持至第5天(P<0.05),不仅如此,精子的渐进性活力在第1天显著高于其他处理组(P<0.05)。(2)氧化胁迫试验中,H_(2)O_(2)处理组的精子质膜完整性、顶体完整性、总活率、渐进性活力、SOD与CAT活性在保存的第5天均显著低于空白组与CAPE+H_(2)O_(2)混合组(P<0.05),而空白组与CAPE+H_(2)O_(2)混合组的总活率、顶体完整性、CAT与SOD活性不存在显著差异(P>0.05)。与CAPE+H_(2)O_(2)混合组相比,H_(2)O_(2)处理组AMPK、FOXO3a、SOD1、SOD2、CAT的mRNA表达水平显著降低(P<0.05),BAX的表达水平显著升高(P<0.05),而空白组与CAPE+H_(2)O_(2)混合组的AMPK、SOD1、CAT与BAX不存在显著差异(P>0.05)。在蛋白表达水平中,CAPE+H_(2)O_(2)混合组与H_(2)O_(2)组相比,AMPK、p-AMPK与p-AMPK/AMPK比率显著提升(P<0.05)。【结论】在常温基础稀释液中添加0.06 g·L^(-1)CAPE可通过促进磷酸化AMPK的表达,诱导AMPK/FOXO3a信号下游抗氧化分子的转录,继而缓解H_(2)O_(2)介导的氧化危害对精液品质产生的影响,延长精液的保存时间,但CAPE保护精子氧化损伤更为深入的分子机制仍需作进一步探究。

红花提取物通过调节PI3K/Akt/FoxO信号通路改善酒精性肝病

目的探讨红花提取物(Carthamus tinctorius L.extract,CTLE)对酒精诱导的肝损伤小鼠氧化应激、脂质代谢和凋亡水平的影响及其作用机制。方法采用慢性酒精喂养加急性酒精灌胃的酒精性肝病小鼠模型造模。小鼠被随机分为4组,造模期间每天观察小鼠状态变化并记录体质量。造模结束后,收集各组小鼠血液和肝脏组织。对小鼠血液进行生化分析。HE染色和油红O染色进一步评价小鼠肝脏病理损伤程度。应用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)和Western blot法检测p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR、p-FoxO1、FoxO1、p-FoxO3a、FoxO3a、p-FoxO4、FoxO4、BCL-2和BAX因子的mRNA和蛋白表达水平。结果与模型组相比,CTLE给药组小鼠肝脏病理损伤程度和脂质沉积有所改善;小鼠血清及肝脏中的生化相关指标,如ALT、AST、TG、TC、MDA水平有所降低,GSH、SOD水平有所升高。并且通过调控PI3K/Akt/FoxO通路产生了更多的SOD,减少了活性氧(reactive oxygen species,ROS)对机体的损伤和细胞凋亡。结论CTLE可以通过PI3K/Akt/FoxO通路发挥抗氧化应激和抗凋亡作用,减轻小鼠的酒精性肝损伤,为治疗酒精性肝病和开发相关药物提供新的思路。

灯盏细辛总咖啡酰奎宁酸调控PI3K/Akt/FoxO3a通路延缓衰老的作用机制研究

研究灯盏细辛总咖啡酰奎宁酸(caffeoylquinic acid from Erigeron breviscapus,EBCQA)的抗衰老作用,并探讨其潜在作用机制。以线虫为模型,观察EBCQA对其寿命、氧化抗性、热抗性、运动能力、DAF-16入核、以及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、过氧化氢酶(catalase,CAT)活性和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量的影响。腹腔注射D-半乳糖构建衰老大鼠模型,检测EBCQA对大鼠学习记忆能力、胸腺和脾脏系数、肝脏中磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B(Akt/protein kinase B,Akt)、磷酸化Akt(phosphp-Akt,p-Akt)、叉头框蛋白O3a(forkhead box class O3a,FOXO3a)、磷酸化FOXO3a(phosphp-FOXO3a,p-FOXO3a)表达,以及肝脏和血清中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量的影响。结果显示,EBCQA能够延长野生型线虫寿命,并提升其氧化抗性、热抗性和运动能力,但对线虫PI3K、Akt、FoxO3a同源体突变株寿命没有显著影响;EBCQA能促进DAF-16入核,通过DAF-16提升线虫的SOD、GSH-Px、CAT活性,降低MDA水平。在D-半乳糖诱导衰老大鼠中,EBCQA给药显著改善大鼠的学习记忆功能,提升胸腺和脾脏系数,降低PI3K、Akt、p-Akt、p-FoxO3a表达和MDA含量,增强SOD、GSH-Px、CAT活性。以上结果表明,EBCQA具有延缓衰老的作用,其机制可能与抑制PI3K和Akt激活、降低FOXO3a磷酸化、促进FOXO3a入核和转录活性、提升抗氧化酶活性和抑制氧化应激相关。

连翘酯苷B抑制小鼠脑缺血/再灌注引起的氧化应激损伤:基于激活AAMPK/DAF-16/FOXO3通路

目的 研究连翘酯苷B(FB)对脑缺血/再灌注(I/R)引起的氧化应激损伤的保护作用及作用机制。方法 将90只C57BL/6小鼠随机分为5组,假手术组(Sham),模型组(model),FB低、中、高剂量组(10、20、40 mg/kg),采用大脑中动脉阻塞(MCAO)2 h,再灌注24 h,制备脑I/R模型。试剂盒检测小鼠脑组织ROS、MDA、PCO、8-OhdG、SOD、GSTα4、CAT、GPx水平,Western blot检测小鼠脑组织AMPK、P-AMPK、DAF-16、FOXO3、P-FOXO3蛋白表达。在此基础上,采用AMPK抑制剂Compound C(CC)验证FB是否通过AMPK发挥抑制氧化应激损伤作用,将36只C57BL/6小鼠随机分为,Sham组、model组、FB(40 mg/kg)组、FB(40 mg/kg)+CC(10 mg/kg)组。TTC染色检测脑梗死体积,试剂盒检测ROS、SOD水平,Western blot检测小鼠脑组织AMPK、P-AMPK、DAF-16、FOXO3、P-FOXO3蛋白表达。结果 与model组比较,FB可降低小鼠脑组织ROS、MDA、PCO、8-OHdG水平,升高小鼠脑组织中抗氧化酶SOD、GSTα4、CAT、GPx活性,提高AMPK、FOXO3磷酸化及DAF-16蛋白表达水平(P<0.01)。与FB组比较,FB+CC组AMPK和FOXO3磷酸化水平降低,DAF-1表达减少,脑梗死体积增加,ROS水平升高,SOD水平降低(P<0.01)。结论 FB能够抑制I/R引起的脑组织氧化应激损伤,作用机制是通过促进AMPK磷酸化、其下游DAF-16蛋白表达及FOXO3磷酸化,促进抗氧化酶的表达,清除过量ROS,从而发挥治疗缺血性脑卒中的作用。

阻断PI3K/AKT通路通过激活FoxO1抑制猪骨骼肌卫星细胞分化

【目的】在骨骼肌生长或损伤刺激下,骨骼肌卫星细胞被激活、增殖分化形成肌管,促进骨骼肌的生长发育或修复组织创伤。FoxO1负调控骨骼肌的生成,但在骨骼肌卫星细胞分化过程中的作用未见报道。因此,笔者探索FoxO1对猪骨骼肌卫星细胞分化的影响,希望为深入研究FoxO1调控骨骼肌生长发育的作用机理奠定基础。【方法】以1—3日龄健康大白猪为材料,采用单根肌纤维法分离培养猪骨骼肌卫星细胞,接种第2天、第4天和第6天在倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。在细胞分化第8天,用免疫荧光染色方法染肌管,DAPI染核,并在荧光倒置显微镜下观察拍照。待细胞汇合至70%—80%时,将培养基换成含50 nmol·L-1渥曼青霉素(wortmannin,WM)的分化培养基,分别于细胞分化第0天、第4天和第8天收集细胞,提取总RNA和总蛋白,采用real-time qPCR和Western blotting方法检测WM对FoxO1以及骨骼肌卫星细胞分化标志基因表达的影响。【结果】猪骨骼肌卫星细胞在接种第2天开始贴壁,呈梭形。第4天细胞数量增加,部分发生融合。第6天时细胞呈方向性生长。第8天细胞进一步融合形成肌管。WM处理组的FoxO1 mRNA表达水平未发生显著变化(P>0.05),非磷酸化的FoxO1蛋白表达显著高于对照组(P<0.05),而p-FoxO1蛋白表达较对照组显著下降(P<0.05)。WM处理组的细胞在分化第8天,虽然也出现了蜂窝状生长,但是与对照组相比细胞未呈方向性生长并形成肌管。Western blotting结果显示,WM明显抑制猪骨骼肌卫星细胞分化早期标志基因MyoD、中后期标志基因MyoG和末期标志基因MyHC蛋白的表达。【结论】以WM阻断PI3K信号通路能使FoxO1去磷酸化,抑制猪骨骼肌卫星细胞的分化,延迟肌管的形成,并降低成肌分化标志基因MyoD、MyoG和MyHC的表达。总之,阻断PI3K信号通路通过激活FoxO1抑制猪骨骼肌卫星细胞分化。

PI3K/Akt/FoxO3a信号通路对人鼻咽癌CNE-1、CNE-2细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨FoxO3a对体外培养的人鼻咽癌CNE-1、CNE-2细胞增殖及凋亡的影响是否是通过PI3K/Akt信号通路。方法通过使用LY294002特异性抑制PI3K的活性,免疫印迹法检测FoxO3a及p-Akt蛋白在人鼻咽癌CNE-1、CNE-2细胞的表达,免疫荧光化学检测FoxO3a在鼻咽癌细胞中的亚细胞定位,实时荧光定量PCR检测FoxO3a的mRNA表达水平,MTT法检测鼻咽癌细胞的增殖抑制率,流式细胞术检测鼻咽癌细胞的凋亡率。结果通过使用PI3K特异性抑制剂LY294002,FoxO3a在实验组人鼻咽癌CNE-1、CNE-2细胞中的蛋白和mRNA表达水平均高于对照组(P<0.05),且在CNE-1(P=0.004)、CNE-2(P=0.001)细胞核内的表达量高于对照组,FoxO3a的上调可抑制人鼻咽癌CNE-1、CNE-2细胞的增殖(P<0.05),促进其凋亡(P<0.01)。结论通过抑制PI3K/Akt信号通路的活性可上调人鼻咽癌CNE-1、CNE-2细胞FoxO3a基因的表达,抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡,其机制可能与其对FoxO3a的调控有关。

AMPK对心肌细胞FOXO3a转录因子活性以及泛素连接酶MAFbx表达的影响

【目的】研究5-氨基-4甲酰胺咪唑核糖核苷酸(AICAR)对心肌细胞转录因子FOXO3a的活性以及泛素连接酶MAFbx蛋白表达的影响,探讨AMP激活的蛋白激酶(AMPK)在心肌细胞蛋白质降解中所起的作用。【方法】用不同浓度AICAR干预培养的新生大鼠心肌细胞6h,观察AICAR对心肌细胞AMPK的激活作用。再将培养的心肌细胞分成3组:对照组,AICAR组,AICAR+CompoundC组。用Western blot检测AMPK激活对心肌细胞FOXO3a转录因子活性,以及MAFbx蛋白表达的影响。【结果】①与对照组比较,0.25mmol/L与0.5mmol/LAICAR处理6h后心肌细胞AMPK活性升高(P<0.05),而1.0mmol/L与2.0mmol/LAICAR组AMPK活性增加更明显(P<0.01)。②与对照组比较,AICAR激活AMPK后显著增加FOXO3a转录活性(P<0.01),促进MAFbx蛋白表达(P<0.01),而特异性的AMPK抑制剂Compound C则明显抑制了该作用。【结论】AMPK可能通过激活心肌细胞FOXO3a的转录活性,上调MAFbx蛋白表达,参与心肌细胞蛋白质降解的调控。

基于PI3K/Akt/FoxO1通路探讨大黄酸对2型糖尿病大鼠肾损伤的作用

目的 通过PI3K/Akt/FoxO1信号传导通路探讨大黄酸对链脲佐菌素诱导的2型糖尿病大鼠肾脏损伤的作用。方法 通过高脂饮食+小剂量STZ(35 mg/kg)造模,将2型糖尿病大鼠随机分为大黄酸低、高(75、150 mg/kg)剂量组,二甲双胍组(300 mg/kg),模型组,另设正常对照组。连续给药12周后,检测各组大鼠的血糖、体质量、肾脏指数、MDA水平、SOD和GSH-Px活性,HE染色观察各组大鼠肾组织病理形态学改变,Masson三色染色观察胶原表达,免疫组化法与Western blot法检测大鼠肾脏PI3K、Akt与FoxO1蛋白表达。结果 与正常组比较,模型组大鼠体质量、SOD和GSH-Px活性、FoxO1蛋白表达降低(P<0.05),血糖、肾脏指数、肾组织MDA水平和PI3K、Akt蛋白表达升高(P<0.05),肾脏有明显病变损伤;与模型组比较,大黄酸各剂量组体质量、SOD和GSH-Px活性、FoxO1蛋白表达升高(P<0.05),血糖、肾脏指数、肾组织MDA水平和PI3K、Akt蛋白表达降低(P<0.05),肾脏病理损伤得到改善。结论 大黄酸对2型糖尿病大鼠肾脏有保护作用,其机制可能与减轻肾脏氧化应激及调节肾脏PI3K/Akt/FoxO1信号转导通路有关。

卵巢颗粒细胞自噬与PI3K/AKT/FOXO3a信号通路的相关性

细胞自噬是哺乳动物细胞物质代谢的一个重要机制,与细胞凋亡共同参与卵巢卵泡的发育和闭锁,并发挥重要的作用。近年研究发现,磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B,PI3K/AKT)信号通路参与卵巢疾病的发生。PI3K和AKT的过度激活可使原始卵泡过早发育以及卵泡过快凋亡,卵巢颗粒细胞作为卵泡发育重要的支持细胞,其功能的减退或凋亡很可能引发一系列女性内分泌方面的疾病。FOXO3a转录因子是PI3K/AKT信号通路下游的重要靶蛋白之一,参与抗增殖和凋亡。本文就关于卵巢颗粒细胞自噬与PI3K/AKT/FOXO3a信号通路的相关进展加以综述。