p38MAPK信号通路在雨蛙素诱导的胰腺AR42J细胞炎症反应中的作用

目的:探讨p38 MAPK信号通路在急性胰腺炎体外模型中的作用。方法:AR42J细胞随机分为3组:正常对照组、雨蛙素组(10-8mol/L雨蛙素)和SB203580组(10μmol/L SB203580+10-8mol/L雨蛙素)。于3h收集细胞,检测淀粉酶分泌率;免疫荧光染色观察p-p38 MAPK核移位;Western blotting印迹检测p-p38 MAPK和TNF-α蛋白表达;EMSA检测NF-κB活性。结果:与正常对照组比较,雨蛙素组淀粉酶分泌率和TNF-α蛋白水平增高(P<0.01),p-p38 MAPK表达及NF-κB活性表达增加(P<0.01);免疫荧光示雨蛙素组p-p38MAPK发生了核移位。而与雨蛙素组相比,SB203580组明显降低淀粉酶分泌率和TNF-α蛋白表达(P<0.01),p-p38 MAPK和NF-κB的活性表达也下降(P<0.05);SB203580还抑制了p-p38 MAPK核移位。结论:p38MAPK通路参与了胰腺细胞内的炎症反应,其机制可能涉及NF-κB通路的活化。

Ang 1-7对雨蛙素刺激的胰腺腺泡AR42J细胞p38 MAPK/NF-κB信号通路的影响

目的探讨血管紧张素1-7(Ang 1-7)干预雨蛙素(caerulein,CAE)刺激的胰腺腺泡细胞AR42J后,p38MAPK/NF-κB信号蛋白的表达变化。方法将AR42J细胞随机分为3组:对照组、雨蛙素组(10 nmol/L,CAE组)、Ang1-7组(10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L Ang 1-7+10 nmol/L雨蛙素)。对照组为正常生长的AR42J细胞,CAE组用10 nmol/L的雨蛙素刺激AR42J于2 h、6 h、12 h、24 h及48 h收集细胞,Ang 1-7组为不同浓度Ang 1-7作用30 min后再用雨蛙素刺激24 h收集细胞,Western blot技术检测各组细胞中ACE2、Mas受体、p38 MAPK、p-p38 MAPK及NF-κB的蛋白表达。结果 AR42J细胞中可见ACE2-Ang 1-7-Mas受体轴表达;与对照组相比,CAE组ACE2和Mas受体的表达呈先增多后减少的趋势,均于24 h达高峰(P<0.05);p38 MAPK、p-p38 MAPK及NF-κB的表达亦是24 h达峰值(P<0.05);Ang 1-7(10-7mol/L、10-6mol/L及10-5mol/L)上调Mas受体的表达,下调p38 MAPK、p-p38MAPK、NF-κB蛋白的表达,Ang 1-7的浓度为10-5mol/L时,后三者的表达水平与CAE组比较,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论雨蛙素刺激的AR42J细胞中,Ang 1-7可通过Mas受体抑制p38MAPK/NF-κB信号通路的活性。

不同胆汁酸诱导AR42J细胞凋亡与坏死的作用

目的:探讨7种不同胆汁酸对AR42J胰腺腺泡细胞的损伤作用,检测在各种胆汁酸作用下胰腺腺泡细胞的存活率和凋亡/坏死的改变.方法:以大鼠AR42J胰腺腺泡细胞系为研究对象,应用MTT法检测7种不同胆汁酸对细胞存活率的影响和剂量与时间依赖性,采用光学显微镜和荧光显微镜观察细胞形态学改变与凋亡/坏死的变化,流式细胞术AV/PI双染法检测细胞的凋亡/坏死率.结果:CA,GCA和GDCA在0.1-1.0mmol/L内对AR42J细胞不具有损伤作用;而DCACDCA和LCA分别从0.3mmol/L开始,TDCA从0.4mmol/L开始,呈剂量依赖性对AR42J细胞产生损伤作用.0.8mmol/LCA组细胞凋亡率与坏死率同CON组无明显区别(1.2%vs0.9%;1.0%vs1.0%,均P>0.05);0.4mmol/LDCA组细胞凋亡率和坏死率分别为45.2%和8.9%;0.8mmol/LDCA组细胞凋亡率和坏死率分别为18.6%和45.4%.

IRF9基因沉默对雨蛙素诱导的大鼠胰腺腺泡细胞AR42J细胞凋亡的影响

目的探讨干扰素调节因子IRF9基因沉默对雨蛙素诱导的大鼠胰腺腺泡细胞AR42J细胞凋亡的影响,阐述IRF9在急性胰腺炎(AP)发生发展中的作用。方法 AR42J细胞培养至对数期,分为空白对照组、阴性对照组及IRF9沉默组。成功转染siRNA后应用雨蛙素诱导AR42J细胞构建体外急性胰腺炎模型。采用qRT-PCR和Western blot方法检测AR42J细胞中IRF9基因、Caspase 3及Caspase 9的mRNA及蛋白的表达水平;流式细胞术检测AR42J细胞凋亡率。结果①雨蛙素诱导24 h后,各组中的IRF9基因的mRNA及蛋白水平均较雨蛙素诱导前升高,Caspase 3及Caspase 9的mRNA及蛋白的表达水平亦明显升高,说明发生AP时IRF9及凋亡相关基因的表达水平均上调。②与空白对照组相比,雨蛙素诱导后IRF9沉默组AR42J细胞的凋亡率有明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论发生AP时IRF9、Caspase 3及Caspase 9的表达水平均上调,细胞凋亡率增加,IRF9基因沉默降低了雨蛙素诱导的体外AP细胞模型的细胞凋亡。

LncRNA H19对大鼠胰腺腺泡细胞AR42J细胞凋亡的影响

目的研究长链非编码RNA(LncRNA)H19对雨蛙素刺激的大鼠胰腺腺泡细胞AR42J细胞凋亡的影响。方法在体外通过用雨蛙素刺激AR42J细胞建立AP模型,采用qRT-PCR和Western blot检测沉默以及过表达H19后凋亡相关基因Caspase 3及Caspase 9的mRNA和蛋白表达水平;流式细胞术检测各组细胞的凋亡率。结果H19沉默后,凋亡相关基因Caspase 3及Caspase 9的mRNA和蛋白水平下降,细胞凋亡率也相对减少(P<0.05);而过表达H19后,Caspase 3及Caspase 9的mRNA和蛋白水平增加,细胞凋亡率也是升高的(P<0.05)。结论沉默LncRNA H19可减少雨蛙素诱导的胰腺腺泡细胞凋亡,提示其可能成为治疗急性胰腺炎的潜在有效靶点。

棕榈酸对大鼠胰腺腺泡细胞AR42J细胞凋亡的影响

目的探讨棕榈酸(palmitic acid,PA)对大鼠胰腺腺泡细胞AR42J的凋亡率的改变及凋亡相关基因bcl-2、bax、caspase-3mRNA表达的影响。方法 PA浓度分别为0 mmol/L(正常对照组)、0.1 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L刺激AR42J细胞后,应用流式细胞术AV/PI双染法检测细胞的凋亡率,荧光定量PCR法检测凋亡相关基因bcl-2、bax、caspase-3 mRNA的表达水平。结果与正常对照组(0 mmol/L)相比,PA在0.1mmol/L低浓度时对AR42J细胞不具损伤作用,从0.5 mmol/L开始,PA对AR42J细胞的凋亡率呈浓度、时间依赖性增强,组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。荧光定量PCR结果显示PA下调抗凋亡基因bcl-2 mRNA的表达,同时上调促凋亡基因bax、caspase-3 mRNA的表达。结论不同浓度PA对AR42J细胞的损伤作用不同,主要表现为凋亡与剂量、时间相关,其机制可能是抑制bcl-2 mRNA的表达及促进bax、caspase-3 mRNA的表达。

miR-423-5p靶向水通道蛋白1对雨蛙肽诱导的急性胰腺炎AR42J细胞损伤的影响

目的:研究miR-423-5p对雨蛙肽诱导的胰腺AR42J细胞损伤的影响及其分子作用机制。方法:通过雨蛙肽处理AR42J细胞建立胰腺炎损伤模型,qRT-PCR检测AR42J细胞中miR-423-5p的表达,Western blot检测水通道蛋白1(aquaporin 1,AQP1)、Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表达,ELISA法检测培养上清中IL-6和TNF-α的分泌水平,流式细胞术测定细胞凋亡率,双荧光素酶报告系统验证miR-423-5p与AQP1间的调控关系。结果:在雨蛙肽诱导的AR42J细胞中miR-423-5p表达上调,AQP1表达下调;抑制miR-423-5p和过表达AQP1均可减轻雨蛙肽诱导的AR42J细胞损伤,抑制细胞凋亡;双荧光素酶报告系统结果显示miR-423-5p靶向负调控AQP1的表达;抑制AQP1逆转了抑制miR-423-5p对雨蛙肽诱导的胰腺AR42J细胞损伤的作用。结论:miR-423-5p通过靶向AQP1减轻雨蛙肽诱导的胰腺AR42J细胞损伤,抑制细胞凋亡。

大黄素减轻胰腺腺泡AR42J细胞内质网应激的研究

目的：探讨大黄素对胰腺腺泡AR42J细胞内质网应激的影响。方法：AR42J细胞以1×105个／mL接种于6孔培养板中，分为正常对照组、模型组（雨蛙素终浓度为1×10-7mol·L-1，脂多糖终浓度为10mg·L-1）、大黄素组（终浓度为lO，20，40μmol·L-1），每组设3个复孔，培养24h待细胞贴壁后弃上清，对照组加入单培、模型组加入用单培配置的造模液、治疗组在加入造模液前15—20min分别加入不同浓度大黄素。37℃，5％CO：条件下继续培养3h后，试剂盒检测细胞内蛋白酶、脂肪酶表达水平；光学显微镜观察细胞形态；激光共聚焦显微镜检测内质网钙离子水平；Westernblot方法分析内质网应激相关信号分子的蛋白表达情况。结果：大黄素能显著抑制AR42J细胞合成蛋白酶、脂肪酶，减少细胞内钙离子水平，抑制内质网应激。结论：大黄素能够减轻雨蛙素联合脂多糖导致的胰腺腺泡细胞损伤，其作用机制与抑制细胞内钙超载及内质网应激有关。

核因子-κB对胰腺AR42J细胞肿瘤坏死因子-α表达的调控

目的探讨脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）对胰腺腺泡AR42J细胞细胞因子表达的影响及其可能机制，进一步阐明急性胰腺炎的发病机制。方法用不同质量浓度的LPS（0．001，0．01，0．1，1，10，100mg／L）刺激AR42J细胞18h，同时用10mg／L的LPS刺激AR42J细胞不同时间（2，6，12，18，24h），RT-PCR检测核因子－κB（NF-κB）P65和肿瘤坏死因子－α（TNF-α）mRNA表达的变化，放射免疫法（RIA）检测培养液上清TNF-α蛋白浓度的改变。对NF-κB（P65）mRNA的表达与TNF-αmRNA的表达进行相关和回归分析。结果RT-PCR结果表明0．001mg／L的LPS处理AR42J细胞时即可出现TNF-α及NF－κB（P65）mRNA表达的明显上调，且呈量效关系；用10mg／L的LPS处理后，在2h后即可出现TNF-α及NF-κB（P65）mRNA表达的明显上调，并且呈时效关系。RIA结果表明用0．01mg/L的LPS处理AR42J细胞后即可出现TNF-α蛋白表达的明显上调，且呈量效关系；用10mg／L的LPS处理后，在6h后即可出现TNF-α蛋白表达的明显上调，并且呈时效关系。TNF-αmRNA的表达与P65mRNA的表达呈正相关。结论LPS可以以时间剂量依赖方式地刺激AR42J细胞NF-κB（P65）和TNF-α的表达，NF-κB（P65）mRNA的表达与TNF-αmRNA的表达呈正相关。针对NF-κB靶点，抑制其活性，可为包括AP的治疗提供一条新的途径。

核因子-κB在脂多糖诱导的大鼠胰腺腺泡细胞AR42J炎性效应中的作用

目的探讨核因子-κB(NF-κB)在急性胰腺炎体外模型中的作用。方法以10 mg／L脂多糖刺激AR42J细胞构建急性胰腺炎的体外模型,设2 h、6 h、12 h、18 h和24 h共5个时间点,每时间点设3个复孔,逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)半定量法观察细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和NF-κB p65亚单位mRNA表达的改变;链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法(SABC)检测p65蛋白在AR42J细胞中的表达;人工碘比色法观察培养液上清中淀粉酶的改变。结果脂多糖刺激后,AR42J细胞以时间依赖方式上调ICAM-1 mRNA和p65 mRNA的表达,24 h达最高值;二者之间具有直线相关性(P< 0．01),同时p65蛋白亦呈时间依赖方式表达增强,24 h表达最强;各组间淀粉酶无明显改变(P>0．05)。结论在脂多糖诱导的胰腺腺泡细胞AR42J炎性效应中,NF-κB调控致炎细胞因子ICAM-1的表达。

下调PKR基因对胰腺细胞AR42J增殖、凋亡的影响及机制

目的:探讨下调PKR基因对大鼠胰腺腺泡细胞AR42J增殖、凋亡的影响及机制。方法:利用雨蛙素作用AR42J细胞建立急性胰腺炎细胞模型,在细胞模型中通过慢病毒载体下调PKR基因为实验组,对照病毒转染组为对照组。平板克隆形成和CCK-8法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡情况,qRT-PCR及流式细胞术分别检测核因子-κB (nuclear factor-κB,NF-κB)通路关键基因表达变化。结果:相较于对照组,实验组中NF-κB通路关键基因NF-κB、肿瘤坏死因了-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)、iNOS相对表达量为0.45±0.08、0.26±0.05、0.51±0.25、0.38±0.04,相对表达下降(t=7.64,t=16.41,t=6.67,t=10.15,均P<0.05);实验组细胞克隆数为(275.33±7.02)个,对照组克隆数为(36.00±4.00)个,克隆形成能力明显增强(t=51.29,P=0.00);CCK-8数据:在24 h、48 h、72 h,实验组细胞增殖率为(25.00±3.00)%、(50.33±4.04)%、(62.33±4.51)%,对照组为(12.33±1.53)%、(17.00±1.00)%、(24.00±2.00)%,实验组增殖能力明显增强(t=6.52,t=13.87,t=13.46,均P<0.05)。实验组和对照组中细胞早期凋亡率分别为(6.2±0.6)%和(13.4±0.9)%,实验组凋亡明显减少(t=11.53,P=0.00);晚期凋亡率分别为(4.1±0.2)%和(12.2±0.5)%,实验组凋亡明显减少(t=26.05,P=0.00)。结论:下调PKR基因可以抑制NF-κB通路减缓细胞炎症反应,致AR42J细胞凋亡减少、增殖能力增强。

脂多糖对AR42J细胞Toll样受体7、9表达的影响

目的探讨Toll样受体（TLR）7、9在急性胰腺炎（AP）发病机制中的作用。方法用含1、10、100mg／L脂多糖的培养基处理正常大鼠胰腺腺泡细胞株AR42J，构建AP体外细胞模型，以不加脂多糖处理的细胞作为对照组。培养24h后收集细胞及培养上清液。采用RT-PCR法和蛋白质印迹法分别检测细胞TLR7、TLR9mRNA及蛋白的表达，ELISA法检测培养上清液中TNF-α、IL-10含量。结果对照组及1、10、100mg／L脂多糖处理组细胞TLR7mRNA表达量分别为0．12±0．09、0．28±0．06、0．49±0．04、0．78±0．04；TLR9mRNA表达量为0．06±0．02、0．32±0．03、0．56±0．14、0．84±0．12；TLR7蛋白表达量为0．04±0．01、0．26±0．05、0．49±0．04、0．77±0．16；TLR9蛋白表达量为0．10±0．14、0．62±0．23、1．21±0．26、1．75±0．13。培养上清液中TNF-α含量分别为（8．01±5．32）、（25．64±8．71）、（49．06±10．23）、（75．83±6．65）ng／L；IL-10含量分别为（155．54±25．47）、（105．16±10．49）、（69．36±8．19）、（14．07±9．06）ng／L。细胞TLR7和TLR9的mRNA及蛋白表达量、培养上清液中TNF-α含量均随脂多糖浓度升高而逐渐升高，而培养上清液中IL-10含量随脂多糖浓度增加逐渐下降，各组间的差异均具有统计学意义（P值均〈0．01）。结论脂多糖处理AR42J细胞后细胞的TLR7、TLR9基因表达明显上调，提示两者在AP疾病发展中可能发挥重要作用。

基于JAK2/STAT3信号通路探讨大黄素保护AR42J胰腺腺泡细胞损伤的作用机制

目的基于JAK2/STAT3信号通路探讨大黄素保护AR42J胰腺腺泡细胞损伤的作用机制。方法将AR42J细胞以1×105/mL铺于6孔板,分为对照组、雨蛙素组(雨蛙素10-8 mol/L)、大黄素组(终浓度0.25、0.5、1.0mg/L),通过碘-淀粉比色法淀粉酶(AMS)试剂盒测定细胞上清淀粉酶活力水平,确定雨蛙素刺激AR42J胰腺腺泡细胞损伤的收样时间;ELISA法检测TNF-α活力;Western blot法分析JAK2/STAT3通路相关蛋白的表达情况。结果①与对照组比较,雨蛙素组中的AMS、TNF-α、JAK2/STAT3通路相关蛋白表达量显著提高,差异有统计学意义(P<0.05)。②与雨蛙素组比较,大黄素各干预组可显著降低雨蛙素诱导的胰腺腺泡细胞损伤的淀粉酶活力、TNF-α含量、JAK2和STAT3的mRNA相对表达量,差异有统计学意义(P<0.01)。③大黄素0.5、1.0 mg/L干预组的作用优于0.25 mg/L干预组,差异有统计学意义(P<0.001)。结论大黄素能够减轻雨蛙素诱导的胰腺腺泡细胞损伤,其作用机制可能与调控JAK2/STAT3信号通路有关。

稳定表达EGFP-LC3的AR42J细胞系的建立

目的 建立稳定表达增强型GFP （EGFP）-LC3的AR42J细胞.方法 利用慢病毒过表达载体Lentiviral-EGFP-LC3包装成慢病毒,感染大鼠胰腺腺泡细胞AR42J.以Lentiviral-EGFP感染作为阴性对照.通过倒置荧光显微镜观察及流式细胞分析仪检测病毒感染效率,蛋白质印迹法检测稳定传代细胞株的LC3蛋白表达.用毒胡萝卜素处理细胞建立内质网应激模型,采用蛋白质印迹法检测应激的AR42J细胞的LC3、PERK蛋白表达.结果 AR42J细胞的Lentiviral-EGFP-LC3感染效率＞85％,并能稳定传代.Lentiviral-EGFP-LC3感染的AR42J细胞的LC3 mRNA表达量为未感染细胞的（9.14±0.32）倍;LC3蛋白阳性表达并有EGFP-LC3融合蛋白的表达.Lentiviral-EGFP感染的AR42J细胞的LC3 mRNA表达量为未感染细胞的（1.08 ±0.07）倍,无LC3蛋白表达,仅有GFP表达.与未感染组比较,EGFP-LC3组的LC3 mRNA表达显著升高,差异有统计学意义（P＜0.05）,而EGFP组的差异无统计学意义.结论 成功构建了稳定表达EGFP-LC3的大鼠胰腺外分泌细胞AR42J,为进一步研究急性胰腺炎与自噬的关系提供了新的细胞模型.

Tat—NBD多肽抑制胰腺腺泡细胞AR42J细胞的核因子-κB相关性炎症反应

目的通过脂多糖在体外刺激大鼠胰腺腺泡细胞AR42J，诱导胰腺腺泡细胞发生炎性效应，探讨NF-KB必需调节蛋白结合域多肽对脂多糖诱导的炎性效应的干预作用与机制，为急性胰腺炎的治疗机制和研究提供新的途径。方法以脂多糖（0．1mg／L，1mg／L，10mg／L，100mg／L）刺激大鼠胰腺腺泡细胞AR42J构建急性胰腺炎的体外模型。不同浓度的免疫缺陷性病毒的Tat多肽的蛋白转导功能区和野生型NBD多肽融合成Tat-NBD多肽对AR42J细胞进行预处理，突变型Tat-NBD（MT）多肽，Tat，NBD作为对照。半定量逆转录-多聚酶链反应法观察TNF-α的mRNA表达的改变；定量酶联免疫吸附法检测培养液上清中TNF-α蛋白浓度的改变。链酶亲和素一生物素．过氧化物酶复合物免疫细胞化学法观察NF-κB-p65蛋白的合成和核转移的情况。结果Tat-NBD（WT）多肽可以抑制LPS诱导的AR42J炎症细胞因子TNFoamRNA和蛋白的表达，且抑制NF-κB—p65蛋白表达与移位，呈剂量依赖方式（P〈0．05）。对照的单纯NBD多肽、突变型Tat-NBD（MT）多肽、Tat均不能抑制TNF-RmRNA和蛋白的表达，且不能抑制NF-κB-p65蛋白的向核内转移。结论TAT-NBD（WT）多肽可以呈剂量依赖方式地抑制LPS诱导的AR42J促炎细胞因子TNF-α mRNA和TNF-α蛋白的表达，可能与阻止NF-κBp65蛋白表达及核移位有关。本研究的结果可为急性胰腺炎的治疗与研究提供新的途径。

miR-19b-3p促进胰腺腺泡AR42J细胞增殖

为探讨miR-19b-3p对胰腺腺泡AR42J细胞增殖的影响,本研究采用脂质体介导转染方法将miR-19b-3p模拟物转染到大鼠胰腺腺泡AR42J细胞,q PCR检测miR-19b-3p基因过表达,CCK8试剂盒检测细胞的增殖能力,Western blotting检测表达的STAT3蛋白情况。CCK8结果显示,与对照组相比,miR-19b-3p转染组AR42J细胞的吸光度值明显升高(P<0.01);Western blotting结果显示,miR-19b-3p转染组细胞内STAT3蛋白上调。表明miR-19b-3p过表达促进AR42J细胞增殖,其分子机制可能与STAT3蛋白上调有关。本研究为理解胰腺外分泌细胞发育和功能调控机理提供理论参考依据。

基于PI3K/AKT信号通路探讨miR-26a对急性胰腺炎细胞凋亡与增殖的影响

基于磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶A(AKT)信号通路探讨miR-26a对急性胰腺炎细胞AR42J凋亡与增殖的影响。将细胞分为4组:正常组、模型组(100 nmol/L雨蛙素)、miR-26a NC组(100 nmol/L雨蛙素+miR-26a NC)和miR-26a inhibitor组(100 nmol/L雨蛙素+miR-26a inhibitor)。MTT法检测细胞活力,AnnexinV-PI流式双染法检测细胞凋亡率,ELISA法检测IL-6、TNF-α水平,Western blot检测细胞中Bax、Bcl-2、cleaved caspase 3、PI3K及p-AKT蛋白表达。与正常组比较,模型组及miR-26a NC组细胞活力降低(P<0.01),细胞早期凋亡率、晚期凋亡率、IL-6、TNF-α水平、Bax、Cleaved caspase 3、PI3K、p-AKT表达量均升高(P<0.01),Bcl-2表达量降低(P<0.01);与模型组及miR-26a NC组比较,miR-26a inhibitor组细胞活力升高(P<0.01),细胞早期凋亡率、晚期凋亡率、IL-6、TNF-α水平、Bax、Cleaved caspase 3、PI3K、p-AKT表达量均降低(P<0.01),Bcl-2表达量升高(P<0.01)。miR-26a通过调控PI3K/AKT信号通路影响雨蛙素诱导的AR42J细胞的增殖与凋亡。

柴黄清胰活血颗粒对雨蛙素诱导的大鼠胰腺腺泡细胞损伤的保护作用及机制

目的观察柴黄清胰活血颗粒对雨蛙素(caerulein)诱导的大鼠胰腺腺泡细胞损伤的保护作用,并探讨柴黄清胰活血颗粒对JAK2/STAT3信号通路的调控机制。方法取对数生长期的AR42J细胞,通过CCK-8法检测不同浓度柴黄清胰活血颗粒对AR42J细胞活性的影响并筛选最佳药物干预浓度;用雨蛙素刺激细胞6 h构建胰腺炎体外模型;随机分为空白对照组、模型组、柴黄清胰活血颗粒低、中、高剂量组(0.5、1、2 mg/mL);ELISA法测定细胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β的表达;实时荧光定量PCR测定各组细胞JAK2、STAT3基因表达水平;Western blot法检测各组细胞JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3蛋白表达水平。结果CCK-8法检测发现,当药物浓度为0.5、1及2 mg/mL时,平均细胞存活率均大于100%;ELISA检测发现,与空白组相比,模型组炎性细胞因子IL-6、IL-8、TNF-α升高,提示AR42J细胞急性胰腺炎模型的成功建立;与模型组相比,柴黄清胰活血颗粒组(0.5、1、2 mg/mL)IL-6、IL-1β、TNF-α明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05);实时荧光定量PCR检测发现,与模型组相比,柴黄清胰活血颗粒组(0.5、1、2 mg/mL)STAT3 mRNA、柴黄清胰活血颗粒组(2 mg/mL)JAK2 mRNA表达水平显著下降(P<0.05);westen blot测定发现,与模型组相比,柴黄清胰活血颗粒组(0.5、1、2 mg/mL)p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3蛋白相对表达量显著下降(P<0.05)。结论柴黄清胰活血颗粒可能通过调控JAK2/STAT3信号通路中关键分子表达,从而减轻AR42J细胞炎症反应。

雨蛙肽联合脂多糖诱导重度急性胰腺炎体外细胞模型钙通道的变化

目的应用雨蛙肽联合脂多糖诱导AR42J细胞构建重度急性胰腺炎体外细胞模型,研究该模型构建前后细胞内钙通道的变化。方法体外培养大鼠AR42J细胞,实验分组设对照组、雨蛙肽处理组、雨蛙肽+脂多糖处理组。采用RT-PCR检测细胞Cav1.3、Cav2.1、Cav2.2、Cav3.1、Cav3.2 mRNA表达;Western blotting检测细胞Cav1.3、Cav2.1、Cav3.1蛋白表达水平;以荧光探针Fluo-4-AM标记细胞内游离钙,激光共聚焦扫描显微镜观察[Ca2+]i的变化。结果药物处理组Cav1.3、Cav2.1、Cav3.1 mRNA及蛋白表达水平较对照组均明显增高(mRNA:F=23.392,46.85,61.338;蛋白:F=33.798,43.588,79.467;P<0.01),雨蛙肽+脂多糖处理组与雨蛙肽处理组相比较上述检测指标的mRNA表达量也显著增高(P<0.01);药物处理组与对照组Cav2.2、Cav3.2mRNA表达水平无明显差异(F=0.175、0.316;P>0.05);激光共聚焦显微镜观察结果显示药物处理组比对照组[Ca2+]i升高(F=638.984,P<0.01),雨蛙肽+脂多糖处理组较雨蛙肽处理组[Ca2+]i也显著升高(P<0.01)。结论胰腺腺泡细胞内钙超载在雨蛙肽联合脂多糖诱导的重度AP细胞模型发生发展的机制中具有重要作用。

TLR9在脂多糖诱导的急性胰腺炎体外细胞模型中的作用

目的:探讨Toll样受体9(Toll-like receptor 9,TLR9)在急性胰腺炎发病机制中的作用.方法:不同浓度脂多糖(lipopolysaccharide,L P S)(0、1、10、100 m g/L)刺激A R42J细胞后,RT-PCR法与Western blot法分别检测TLR9、核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)P65 mRNA和蛋白质表达的变化,并分析TLR9、P65的相关性;ELISA法检测培养上清液白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)含量.结果:与空白对照组相比,LPS刺激后TLR9、P65 mR N A与蛋白质表达升高,呈浓度依赖性,各组间有显著性差异(mRNA:F=21.594,F=24.449;蛋白质:F=23.193,F=24.891,均P<0.01),相关性分析:r=0.942,r=0.900,均P=0.000,TLR9、P65呈正相关.上清液IL-1β、IL-6含量随LPS浓度增加而上升,组间差异有统计学意义(F=45.459,F=62.493,均P<0.01).结论:LPS刺激AR42J细胞诱导的炎症效应中,TLR9表达上调,可能通过激活NF-κB,从而促进炎症因子合成与分泌,参与急性胰腺炎发病机制.