基于转录组测序筛选蒙古冰草抗旱相关基因

为挖掘蒙古冰草(Agropyron mongolicum Keng)抗旱相关基因并探究蒙古冰草响应干旱胁迫分子机制,本研究以蒙古冰草为材料进行转录组测序。首先将不同生长期及干旱胁迫处理后的盆栽蒙古冰草组织按照根、茎、叶、花(穗)4类分别进行混样并利用三代全长转录组测序技术建立蒙古冰草转录本参考序列数据库,共获得26027条转录本,包含25578个基因,利用BlastX在KEGG,KOG,Nr,Swissprot等数据库中进行比对注释,共有25453个转录本得到注释。其次利用二代转录组测序技术对干旱胁迫处理前后水培蒙古冰草幼苗进行测序,发现干旱胁迫处理2 h,6 h后与处理前相比分别有2669个,3668个差异表达基因。此外,根据转录组及荧光定量PCR验证结果,发现基因ERF053,ERF055,NAC100,bZIP23,ERF5和NAM-B1在干旱处理后表达量较高且均上调可能是抗旱调控关键基因,为后续蒙古冰草抗旱相关候选基因克隆及功能验证奠定了基础。

蒙古冰草脱水素基因生物信息学识别及表达分析

为挖掘蒙古冰草(Agropyron mongolicum Keng)干旱胁迫响应的脱水素基因,本研究在转录组测序数据的基础上,利用生物信息学方法对蒙古冰草脱水素基因进行理化性质、亚细胞定位、保守基序、系统发育进化分析,对不同干旱处理的脱水素基因进行差异表达分析。结果表明:共筛选到6个具有脱水素蛋白保守结构域的蒙古冰草脱水素基因,蛋白大小在81~275个氨基酸残基之间;分子量在0.83~2.75 kD之间;理论等电点在5.14~10.00之间;6个脱水素基因预测均位于细胞核;AmDHNs基因编码的蛋白均包括motif1和motif2;系统进化树发现DN14936_c0_g6,DN18948_c1_g4与已知具有抗旱功能的基因具有较高同源性。qRT-PCR分析与对照(CK)相比5个基因在干旱处理下显著差异表达,1个基因的表达量差异不显著,综合转录组测序数据和qRT-PCR分析表明6个基因的表达量随干旱处理时间延长总体呈上升趋势。本研究可为蒙古冰草抗旱相关脱水素基因的生物学功能验证提供理论基础。

蒙古冰草×航道冰草杂种F1代组织培养再生体系建立

以蒙古冰草×航道冰草种间杂种F1代幼穗为外植体,对影响愈伤组织诱导、分化和生根的激素浓度进行筛选,并建立了完整植株的再生体系。结果表明,杂种F1代的最适愈伤组织诱导培养基为MS+2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)1.5 mg/L+6-苄氨基嘌呤(6-BA)0.3 mg/L,出愈率为81.7%;愈伤组织分化的培养基为6-BA 2.5 mg/L+萘乙酸(NAA)0.4 mg/L,分化率为71.7%;生根培养基为1/2 MS+NAA 0.2 mg/L,生根率为88.3%。经炼苗后,各基质移栽成活率大于90%。本研究通过建立蒙古冰草×航道冰草杂种F1代组织培养再生体系,为有效保存冰草杂种F1代新种质,并为后期秋水仙碱诱导其染色体加倍恢复育性奠定基础。

两种珍稀沙生植物草麻黄和沙芦草种子催芽技术研究

草麻黄和沙芦草是我国重点保护野生植物,然而由于自身发芽率低和生境被破坏等原因,导致种群数量减少,为保护并提高两种珍稀植物的数量,本研究通过室内试验进行了两种珍稀植物的种子繁育技术研究。研究结果表明,不同生长激素对于草麻黄和沙芦草种子发芽影响不同。30mg/L的IAA处理可以明显促进草麻黄种子发芽;10mg/L浓度以上的6-BA和100mg/L的GA3均会明显抑制草麻黄种子发芽及活力。同样GA3浓度高于100mg/L均会抑制沙芦草种子发芽,20mg/L的细胞分裂素可以促进沙芦草种子发芽,40mg/L的IAA可以显著提高沙芦草发芽率。DMSO浸泡10min对种子发芽无影响;浸泡20min时,1%浓度DMSO促进效果最佳;当浸泡30min时,0.5%浓度的效果最佳。因此使用30mg/L和40mg/L的IAA分别有助于草麻黄和沙芦草种子发芽,提高种子活力,同时0.5%的DMSO浸泡30min更适合用于沙芦草种子发芽处理。

蒙古冰草Lhcb1基因克隆及干旱胁迫下的表达分析

利用同源序列从蒙古冰草(Agropyron mongolicum Keng)克隆得到1个光合作用叶绿体结合a/b基因,命名为MwLhcb1。MwLhcb1基因cDNA全长1 138bp,包含801bp开放阅读框,编码267个氨基酸,蛋白分子量为28.21kD,等电点4.92。该蛋白二级结构中具有Lhcb基因家族的保守结构域。MwLhcb1蛋白氨基酸序列与其他物种同类蛋白相似性均在87%以上,其中与小麦同类蛋白相似性程度最高达99%。实时荧光定量PCR结果显示,MwLhcb1基因主要在茎叶中表达,在根中表达量极少,干旱胁迫影响MwLhcb1基因表达。该研究结果为进一步研究MwLHcb1在蒙古冰草光合作用与抗旱性中的功能奠定了基础,并从基因遗传进化角度证实了蒙古冰草是小麦野生近缘种的观点,从而提出蒙古冰草是小麦抗性改良的理想基因供体。

PEG-6000干旱胁迫对沙芦草种子萌发特性的影响及其抗旱性评价

采用不同浓度PEG-6000模拟干旱胁迫的方法对7份不同来源的沙芦草种质的种子萌发特性及其抗旱性进行鉴定和评价。结果表明:不同浓度PEG-6000胁迫对沙芦草种子的相对发芽率、相对发芽势、相对抗旱指数、相对活力指数、相对幼苗长、相对幼苗重均有明显抑制作用;低浓度PEG-6000干旱胁迫对相对幼根长具有促进作用,高浓度具有抑制作用。在PEG干旱胁迫下,7份沙芦草种子的相对发芽率、相对发芽势、相对幼苗长和相对根长差异较大,而相对抗旱指数、相对活力指数和幼苗重差异较小。通过隶属函数法综合评价认为,7份沙芦草种质材料的抗旱性顺序依次为3号>7号>2号>4号>6号>1号>5号材料。

不同播种因素对蒙古冰草种子产量和品质的影响

2002-2003年在内蒙古正蓝旗草籽繁殖场进行了田间试验，旨在探索当地自然气候和生产条件下，蒙古冰草种子田的适宜播种技术。经播种行距、种肥量和播种量三因子三位级正交试验结果表明：条播行距是影响蒙农1号蒙古冰草种子产量和品质的主要因子，种肥量和播种量为次要因子。建植蒙农1号蒙古冰草种子田时，条播的最适行距为38cm；用撒可富作种肥的适宜施用量为157．8kg／hm^2；播种量13．3-52．6kg／hm^2为宜。

蒙古冰草肌动蛋白基因(MwACT2)克隆与表达分析

本研究应用RT-PCR和RACE技术,从蒙古冰草(Agropyron mongolicum Keng)中分离到1个肌动蛋白基因,命名为MwACT2。序列分析表明:MwACT2基因全长1506bp,含有1个1131bp的开放型阅读框,MwACT2蛋白长度为376个氨基酸残基,分子量为41.606KDa,理论等电点为5.29,含有actin保守位点,属于actin家族成员。该基因编码的氨基酸序列与Genebank中乌拉尔图(Triticum_urartu)肌动蛋白(登录号:EMS62134.1)氨基酸具有99%的一致性,属于非跨膜蛋白。利用半定量RT-PCR技术分析MwACT2基因的表达,结果表明该基因表达稳定,经高盐、干旱、低温处理后的表达强度无显著差异。

蒙古冰草Actin基因片段的克隆及序列分析

旨在利用同源序列法分离蒙古冰草(Agropyron mongolicumKeng)Actin基因同源片段,为研究其他基因在蒙古冰草中的表达和调控提供内标参照。根据禾本科植物小麦Actin基因(AB181991)的保守序列设计2对引物A4和A5,采用RT-PCR扩增蒙古冰草的Actin基因片段,分别得到656 bp和848 bp的片段,使用DNAman和DNAuser等分子生物学软件进行序列分析,将2个片段的重复序列合并后获得一段长度为962 bp的基因片段,编码237个氨基酸,将克隆的Actin基因片段命名为MwACT。该序列与其它植物Actin基因核苷酸序列的同源性均在80%以上,其中与小麦、大麦的同源性达到94%;与氨基酸序列的同源性均在90%以上。

蒙古冰草Lea3抗旱基因片段的分离与鉴定

研究旨在利用同源序列法分离蒙古冰草抗旱基因同源片段。根据已知禾本科植物抗旱基因Lea第3组的保守区段设计一对简并引物,采用PCR方法对蒙古冰草幼苗的基因组DNA进行扩增。获得了1个蒙古冰草的抗旱基因Lea3基因片段,长度为497 bp,包含124 bp的非翻译区,共编码124个氨基酸。核苷酸序列分析表明,该序列与小麦抗旱基因LEA第3组的Wrab19同源性为93%,与小麦受ABA诱导的WRAB1基因同源性为93%;与一个来源于玉米mRNA的逆境胁迫基因克隆9124同源性为96%;与大麦受ABA诱导的pHVA1基因同源性为94%;与大麦HVA1基因同源性为91%。Southern杂交表明该基因在蒙古冰草基因组中以基因家族形式存在。

蒙古冰草苗期抗旱相关microRNA的差异表达分析及靶基因预测

为明确蒙古冰草抗旱相关microRNA(miRNA)的表达特征及其靶基因,利用实时荧光定量PCR技术,对前期测序筛选到的4个miRNA(amo-miR21、amo-miR44、amo-miR62、amo-miR82)在干旱胁迫下的苗期差异表达情况进行了定量验证,用Target Finder软件和psRNATarget数据库在线预测其靶基因,并用MegAlign软件对预测的靶基因进行了同源性比对分析。结果表明,干旱胁迫下,蒙古冰草中amo-miR21、amo-miR82和amo-miR62的表达量呈上调趋势,而amo-miR44的表达呈下调趋势,与前期测序结果相符;4个miRNA共预测出32个靶基因,其中,amo-miR44在玉米、水稻和小麦数据库中未发现同源的靶基因,在拟南芥、大麦、蒺藜苜蓿中发现的靶基因相似性较低;而amo-miR21、amo-miR82和amo-miR62的靶基因均与小麦中预测的靶基因存在较高同源性(68.6%~95.6%),推测这3个靶基因是参与干旱逆境胁迫响应的基因。

蒙古冰草基因组类反转录转座子基因同源序列的克隆与序列分析

以蒙古冰草DNA为模板,采用PCR扩增的方法从蒙古冰草（Agropyron mongolicumKeng）中分离得到了一个类反转录转座子基因序列,命名为MwRRT（GenBank：GQ855806.1）。序列分析结果表明：该序列长为1 005 bp,包含780 bp的开放阅读框,编码260个氨基酸。经GenBank中BLAST程序分析表明,该片段98~255处氨基酸与水稻（Oryza sativa）预测逆转录转座子蛋白Ty3-gypsy亚类、预测种属特异抗原—聚合酶（Gag-Pol）前体和预测聚合酶氨基酸同源性为47%;与高粱（Sorghum bicolor）的预测GAG-POL前体氨基酸同源性为52%。

荒漠草原区灌溉和旱作条件下蒙古冰草和新麦草产草量的构成因素

对荒漠草原区灌溉和旱作条件下蒙古冰草和新麦草的适应性、单株产草量构成因子及其贡献率进行了研究。结果表明:灌溉条件下蒙古冰草和新麦草单株产草量及其各构成因子产量或数值皆大于旱作条件下;旱作条件下蒙古冰草产草量构成因子对单株产草量的贡献率大小顺序为,茎重>株高>穗重>分蘖数>叶重,新麦草为茎重>分蘖数>株高>叶重>穗重;灌溉条件下蒙古冰草产草量构成因子对单株产草量的贡献率大小顺序为,茎重>分蘖数>株高>穗重>叶重,新麦草为茎重>株高>分蘖数>叶重>穗重。

蒙古冰草半胱氨酸蛋白酶基因MwCP1的克隆

利用RACE技术从蒙古冰草中分离到1个半胱氨酸蛋白酶基因序列,命名为MwCP1,Genbank注册号为KJ534636。序列分析表明:MwCP1基因全长1042bp,含有1个579bp的开放型阅读框,编码192个氨基酸,含有1个CP保守区,属于CP1家族成员。基因编码蛋白的分子量为20.908KD,理论等电点为5.339,属于亲水性、非跨膜蛋白。其编码的氨基酸序列与Genbank中粗山羊草半胱氨酸蛋白酶蛋白(登录号:EMT10192.1)具有较高的氨基酸一致性。

干旱胁迫下蒙古冰草的蛋白质组学分析

蒙古冰草(Agropyron mongolicum Keng)是禾本科冰草属多年生草本植物,对干旱、寒冷及风沙具有很强的抵抗力,是干旱草原和荒漠地带的重要牧草。iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantification)技术即同位素相对标记与绝对定量技术,是近年来最新开发的一种新的蛋白质组学定量研究技术,具有分离能力强、定量结果可靠、灵敏度高、可检测出低丰度蛋白等特点。以蒙古冰草为材料进行干旱处理12d后复水处理,分别在处理0,4,8,12,16d取样,利用iTRAQ技术分析蒙古冰草叶片在干旱胁迫及复水处理下蛋白质组学的变化,并进行生物信息学分析,研究结果表明:在干旱情况下持续上调的蛋白15个,持续下调的蛋白6个,在干旱复水处理中发现有1个基因(Q40001)是在干旱处理中处于下调状态,但是在复水处理后处于上调状态,通过查询蛋白的注释信息发现,该蛋白是一种镁离子螯合酶,其含量的变化与叶绿素的变化趋势相符。

蒙古冰草PLD基因cDNA克隆及生物信息学分析

以蒙古冰草（Agropyron mongolicumKeng）叶片为材料。根据已报道的醉酒毒麦PLD基因片段设计特异引物,通过RT-PCR和RACE技术,获得蒙古冰草PLD基因的全长cDNA（GenBank登录号为EU333811）。该基因cDNA全长2 966 bp,包含2 439 bp的完整开放读码框,编码813个氨基酸。BlastP搜索结果显示,该基因推测的氨基酸序列与已克隆的醉酒毒麦、玉米、水稻PLD基因氨基酸序列的一致性为80%-89%。利用生物信息学软件在线分析其序列结构、氨基酸组成及编码氨基酸的性质和结构,结果表明：该基因编码的蛋白为可溶性蛋白,其相对分子量为92 079.2 Da,理论等电点为5.24,无跨膜域、无信号肽;其二级结构主要以无规卷曲为主;三级结构显示紧靠N端处为C2域,在中间和靠近C端处存在PLD的标志序列,即HKD基序。系统进化树显示,蒙古冰草PLD与醉酒毒麦的亲缘关系最近。

氮磷钾多元复合肥对蒙古冰草种子生产效应研究

2002—2006年在内蒙古正蓝旗进行了田间追肥试验,旨在探索 NPK 多元复合肥对蒙古冰草种子生产效应。结果表明:不同施肥期以及同期一次性不同施肥量水平处理对蒙古冰草生长发育及种子产量构成因子均有较大影响。蒙古冰草种子田经过3年连续产种后,第四年表现种子产量急剧下降,仅为第一年的35.9%。如果第三年种子收获后及时追施 NPK 多元复合肥150kg/hm^2,可使次年种子产量大幅度提高,达到1165.4kg/hm^2,为不追肥的5.2倍。

蒙古冰草茎尖愈伤组织及其再生植株诱导

试验通过对蒙古冰草不同部位的离体培养,筛选出了茎尖为诱导愈伤的适宜外植体,并通过MS基本培养基添加不同激素配比试验,建立了一套以蒙古冰草茎尖为外植体的再生体系,其中最适愈伤诱导培养基为MS+1.5 mg/L 2,4-D+0.1 mg/L 6-BA,诱导率达到84.9%;最适分化培养基MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA,分化率为53.2%;生根培养基MS+0.5 mg/L NAA,生根率为100%。这是首次建立以蒙古冰草营养体为外植体的再生体系,为蒙古冰草的遗传转化奠定了基础。

内蒙古冰草属(禾本科)一新变种——毛稃沙芦草

报道了内蒙古冰草属一新变种———毛稃沙芦草(Agropyron mongolicumKeng var.helini-cumL.Q.Zhao et J.Yang)。该变种外稃密被长柔毛,颖光滑无毛不同于沙芦草(A.mongolicumKeng)和毛沙芦草(A.mongolicumKeng var.villosumH.L.Y ing)

蒙古冰草有丝分裂及染色体核型分析

以蒙古冰草为材料,研究其染色体核型,并观察其有丝分裂过程。结果表明,蒙古冰草的核型公式为2n=2x=12m+2sm(2SAT),核型分类为2A。在有丝分裂中期可以观察到1～2条B染色体,形态为圆点状和短棒状。