IDENTIFICATION OF ALTERNARIOL, ALTERNARIOL MONOMETHYL ETHER AND ZEARALENONE BY PARTICLE BEAM LC/MS

A method for simultaneously analyzing altemariol(AOH), altemariol monomethyl ether (AME) and zearalenone(ZEA) by particle beam LC/MS was established, LC separation was accompiished with a solvent system of methanol and water (80:20 v/v). The followed particle beam LC/MS analysis gave searchable spectra of AOH. AME and ZEA. Application of this technique to analysis of an alternaria culture confirmed the presence of AOH and AME.

The Inhibitory Effect of Extracts From Fructus lycii and Rhizoma polygonati on in vitro DNA Breakage by Alternariol

Alternariol caused DNA single-strand breakage. Conversion of the closed circular double-stranded supercoiled DNA (pBR 322) to the nicked circular form and linear form was used to investigate the effect of extracts of some Chinese medical herbs on DNA nicking induced by alternariol. Some substances in the extracts of Rhizoma polygonati (RP) and Fructus lycii (FL) were shown to protect DNA from the attack by alternariol.Some substance in the RP may bind to plasmid DNA, and this binding reduces the electrophoretic mobility of DNA. These results indicate that substances from FL and RP may be used as DNA protectors. It is possible that they play an important role in preventing cancer.

高效液相色谱和高效液相色谱－质谱法测定粮食中互隔交链孢霉醇、互隔交链孢霉醇单甲醚及玉米赤霉烯酮

建立了粮食中互隔交链孢霉醇（ＡＯＨ）、互隔交链孢霉醇单甲醚（ＡＭＥ）和玉米赤霉烯酮（ＺＥＡ）三个毒素的ＨＰＬＣ定性定量分析法和粒子束ＬＣ－ＭＳ／ＥＩ￣＋鉴定方法。采用反相色谱，以８０％的甲醇水溶液作流动相，这三个毒素在Ｃ＿（１８）色谱柱上彼此间均获得较好的分离。方法对粮食中ＡＯＨ，ＡＭＥ两个毒素的回收率均在７９％以上。ＡＯＨ，ＡＭＥ两个毒素的最低检出限为１×１０￣（－９）ｇ。用所建方法对１００多个大骨节病病区、非病区的粮食样品进行了检测，结果为阴性。对７个互隔交链孢霉菌培养物检测的结果表明这些培养物中不同程度地产生了ＡＯＨ，ＡＭＥ两个毒素，含量为１３．０～９５．９ｍｇ／ｋｇ。并用粒子束ＬＣ－ＭＳ技术成功地对这两个毒素进行了鉴定。

超高效液相色谱-串联质谱法测定葡萄中桔青霉素、链格孢酚和链格孢酚甲基乙醚的残留量

采用超高效液相色谱-串联质谱法测定葡萄中桔青霉素、链格孢酚和链格孢酚甲基乙醚的残留量。葡萄样品经乙腈提取,氯化钠和无水硫酸镁除水,C18粉末净化除杂,有机滤膜过滤。以ACQUITY UPLC BEH C_(18)色谱柱为分离柱,以不同体积比的乙腈和5mmol·L^(-1)乙酸铵溶液的混合液为流动相进行梯度洗脱,采用电喷雾正、负离子源多反应监测模式检测。3种化合物的质量浓度均在5~100μg·L^(-1)内与其对应的峰面积呈线性关系,方法的检出限(3S/N)为0.3~0.6μg·kg^(-1)。以空白样品为基体进行加标回收试验,所得回收率为79.0%~97.0%,测定值的相对标准偏差(n=5)为0.80%~5.2%。

EGFr在原发性及交链孢酚诱导的食管癌中的扩增

用ＡＯＨ体外诱导不同时间（２４小时，１周和 ３周）的人胎儿食管上皮组织，提取该组织高分子量的ＤＮＡ．从１０例食管癌组织及癌旁“正常”组织中分别提取 ＤＮＡ，用 ＥｃｏＲＩ酶切，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ转移，与ＥＧＦｒ基因探针杂交。结果显示：ＡＯＨ诱导２４小时人胎儿食管上皮中即有ＥＧＦｒ基因扩增，并一直持续到第三周。２例食管癌组织，１例癌旁“正常”组织也有ＥＧＦｒ基因扩增。因此：ＡＯＨ可以激活ＥＧＦｒ。ＥＧＦｒ基因的激活可能是食管上皮癌变的启动性变化，并在食管癌发生发展中起重要作用；提示肿瘤实际病变区域应超越目前病理学诊断的范围。

互隔交链孢酚通过PKA-CREB信号通路激活NIH3T3细胞中DNA聚合酶β表达

目的:探讨互隔交链孢酚(AOH)诱导小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3中DNA聚合酶β(DNA polβ)表达增高的分子信号通路。方法:①15μmol/L AOH作用NIH3T3细胞16 h,利用Western blotting方法检测细胞中DNA polβ的表达,并利用磷酸化CREB抗体检测AOH作用后NIH3T3细胞中CREB信号分子是否被激活。②利用PKA-CREB信号通路特异性抑制剂H89预处理NIH3T3细胞1 h,再加入AOH作用,分别检测磷酸化CREB和DNA polβ表达的变化。结果:①与溶剂对照组相比,AOH诱导NIH3T3细胞中DNA polβ表达明显增高,而且磷酸化CREB蛋白含量也明显增加,差异均显著。②用PKA特异性抑制剂H89预处理,可部分抑制NIH3T3细胞中CREB蛋白的磷酸化,并且降低了AOH引起的NIH3T3细胞中DNA polβ的表达增加。结论:PKA-CREB信号通路在AOH诱导的NIH3T3细胞中DNA polβ表达起重要作用。

互隔交链孢酚激活EC9706细胞DNA聚合酶β表达的信号通路初探

目的:研究互隔交链孢酚(AOH)对食管癌EC9706细胞株中DNA聚合酶β(DNApolβ)表达的影响.方法:以PKA激活剂Forskolin(40μmol/L)为阳性对照,采用免疫细胞化学,WesternBlot方法检测20μmol/LAOH作用EC9706细胞16h后polβ蛋白水平的表达.以PKA特异性抑制剂H89(10μmol/L)预处理EC9706细胞1h,再以20μmol/LAOH作用细胞16h,观察H89阻断AOH激活polβ蛋白表达的作用.结果:免疫细胞化学结果显示,与溶剂对照组和H89处理组相比较,AOH处理组,Forskolin处理组的细胞中polβ表达增高.WesternBlot结果表明,AOH处理组,Forskolin处理组polβ表达分别是溶剂对照组的2.05和3.12倍(P<0.05),而H89组仅为对照组的1.32倍.结论:AOH可以激活食管癌EC9706细胞中polβ基因表达,这可能是通过PKA信号转导通路介导的.

链格孢霉培养粮拟致雏鸡克山病、大骨节病模型的实验报告

目的:克山病和大骨节病的病因至今都不明了。本文将病区小麦中检出的优势菌链格孢霉产毒株扩增培养,以此培养粮47％的饲料(内含AOH65.19μg/g)致雏鸡模型实验,为该真菌毒素中毒说的评估提供依据。结果:①实验组除体重增长慢、羽毛光泽度差外,它如软骨生化3组分,胫骨上骺软骨增殖层上界至干骺端顶部厚度,股骨重量、长度和横径乃至胫骨上部组织学所见皆与对照组的无明显差异;②实验组肝、心、肾未见浊肿、脂变及坏死等;③实验组肝GSH—Px活性和Cytp-450量未降低、MDA量不增加。结论:以11.6mg.AOH/kg.BW.d染毒剂量实验28天,未能引发出雏鸡任何类似克山病或大骨节病的病变,也未见重要器官明显病变或中毒迹象。链格孢霉素与克、大两病发病是否相关需另做进一步的探讨。

粮油制品中交链孢霉毒素的测定

采用玉米赤霉醇(Zearalanone,Zea)作为内标物,建立了液相色谱串联质谱法(LC/MS-MS)ESI-食品中的3种交链孢霉毒素的测定方法。优化了样品的前处理方法,对比了液液萃取与Micostep226、C18等2种SPE柱对提取液的净化效果,其中液液萃取法对提取液进行萃取回收率最高。方法的线性范围在0.48～480ng/mL之间,检出限在0.12～1.2ng/mL之间。采用所建立的方法对深圳市场销售的大米、花生、植物油等制品进行分析,均未检出3种交链孢霉毒素。对大米与植物油样品2个浓度水平的加标实验,回收率在60.4%～87.2%之间,RSD在7.6%～14.8%之间。

土壤真菌Tolypocladium sp.HU35P-2次级代谢产物化学成分的研究

目的在土壤真菌Tolypocladiumsp.HU35P-2次级代谢产物中,寻找新药以及新的先导化合物。方法采用硅胶柱色谱、SephadexLH-20柱色谱及高效液相色谱等方法,对Tolypocladiumsp.HU35P-2大米固体发酵产物的乙酸乙酯层次级代谢产物进行分离纯化,根据理化性质和波谱数据进行结构鉴定。结果分离得到4个化合物,分别为格链孢酚(alternariol,1)﹑β-adenosine(2)﹑ergosterol(3)﹑β-胡萝卜苷(4)。结论化合物1为首次从弯颈霉属中分离得到。

互隔交链孢酚致DNA聚合酶β基因突变的实验研究

目的观察互隔交链孢酚对NIH/3T3细胞中DNA聚合酶β(DNApolβ)基因突变的影响,研究互隔交链孢酚致癌可能的机制。方法NIH/3T3细胞分为两组:①各正常细胞组;②AOH组,AOH浓度为8μmol·L-1。用RTPCR方法从细胞全RNA中扩增出DNA聚合酶β基因cDNA序列,应用TA克隆技术,克隆至pGEMTeasy载体后进行测序,分析序列变化。结果测序后发现正常组DNA聚合酶β基因序列无任何变化,AOH组中228位点发生TC突变(导致39号氨基酸由Tyr变为His),319位点也有TC突变(导致69号氨基酸由IIe变为Thr)。结论AOH可导致NIH/3T3细胞中的DNA聚合酶β发生点突变,推测AOH的致癌作用可能与引发细胞中DNA聚合酶β基因突变有关。

经交链孢酚处理胎儿食管上皮组织中EGFr、Rb基因的扩增

目的 :探讨互隔交链孢霉诱导食管癌的发生机制。方法 :用交链孢酚 (AOH)体外处理不同时间 (2 4h ,1周和 3周 )胎儿食管上皮组织 ,提取该组织的DNA ,从 10例食管癌组织及 10例癌旁组织中分别提取DNA ,设正常胎儿食管上皮DNA为对照。EcoRI酶切 ,Southern转移 ,与EGFr癌基因 ,Rb抗癌基因探针杂交。结果 :正常对照组中EGFr、Rb无扩增及丢失 ;AOH诱导 2 4h的胎儿食管上皮中即有EGFr癌基因的扩增 ,并一直持续到第 3周 ;而AOH诱导 2 4h ,1周和 3周的胎儿食管上皮未发现抗癌基因Rb的丢失 ;食管癌组织中有 2例EGFr扩增 (2 /10 ) ,2例Rb完全缺失和部分丢失 (2 /10 ) ,癌旁组织中有 4例EGFr扩增 (4/10 ) ,Rb无任何缺失 (0 /10 )。结论 :AOH激活了EGFr癌基因 ,EGFr癌基因的激活可能是食管上皮癌变的启动性变化 ,Rb抗癌基因的丢失在AOH诱导的食管癌发生中可能是一种较晚期的改变。

交链孢酚单甲醚对人胚食管DNA结合作用的研究及其结合键型的鉴别

应用吸收光谱分析法研究了交链孢酚单甲醚(Alterariol Monomethyl Ether,AME)对人胚食管DNA之间的结合作用并对结合的键型作了鉴别。研究表明,AME和DNA在37℃条件下,二者的最大吸收峰向长波方向明显位移。而且在AME和DNA结合之间存在剂量效应关系。AME和人胚食管DNA结合的最大分子比例(以AME:脱氧—磷酸核苷计)为5:1000,结合反应的平衡常数K=2.8×10~6,结合作用发生迅速而稳定。结合部位可能在碱基,无明显的碱基特异性。热变性DNA能结合更多的AME分子,说明二者的结合不需要DNA具有完整的二级结构。盐离子可严重干扰二者的结合,而脲对此则不产生明显影响,提示AME与DNA结合的主要键型为离子键而不是氢键型。AME与人胚食管DNA这种以离子键结合的方式可能在AME的诱变性/致癌性中起重要作用。

交链孢酚单甲醚(AME)特异性抗体研制(Ⅰ)

交链孢霉是污染粮食、蔬菜、烟草等植物的常见霉菌,该霉菌能产生多种毒性代谢物,交链孢酚单甲醚(Alternariol Monomethyl Ether简称AME)是其中主要毒素之一,本文介绍了将AME重氮化,然后将AME偶氮化合物与牛血清白蛋白(BSA)进行交联制成完全抗原,用AME-BSA完全抗原免疫家兔制备抗AME抗体。并将AME标记上半乳糖苷酶,用标准AME与之竞争,通过ELISA竞争试验,绘出标准曲线图,证明所制备的抗AME抗体能与标准AME进行特异性结合,可用于粮食中AME含量的检测。

互隔交链孢酚单甲醚对线粒体超氧化物歧化酶的影响

本文观察了互隔交链孢霉的产物之一——交链孢酚单甲醚(AME)对小鼠体内超氧化物歧化酶(SOD)的影响:①给小鼠腹腔内注射不同浓度的AME,发现AME使肝匀浆CuZnSOD活性显著降低,MnSOD活性全部丧失。线粒体内的MnSOD及CuZnSOD活性伴随着AME浓度的提高,活性逐渐下降,与对照组相比,差异有显著性。②给小鼠腹腔内注射同一浓度的AME(90.9mg/kg),给药10天后CuZnSOD、MnSOD活性降低。提示:AME有降低超氧化物歧化酶活性的作用。

林县互隔交链孢霉素x_4结构鉴定

从林县粮食中分离的优势菌株互隔交链孢霉培养物中提取出七种代谢物,对其中成份之一x_4,经质谱、红外光谱、核磁共振光谱测定,同时与标准品及人工合成品作比较,证明x_4成份是交链孢酚(Alternariol AOH)。

互隔交链孢酚对NIH3T3细胞PKA-CREB信号通路的影响

目的:探讨互隔交链孢酚(Alternariol,AOH)对小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3中PKA-CREB信号通路的影响.方法:20μmol/L AOH作用NIH3T3细胞1 h,或用PKA特异性抑制剂10μmol/L H89预处理1 h,再进行20μmol/L AOH刺激实验,同时设溶剂对照组.用免疫荧光和免疫细胞化学染色法检测磷酸化PKA催化亚基表达情况,用免疫细胞化学染色法检测磷酸化CREB表达水平.结果:与溶剂对照组相比,AOH诱导NIH3T3细胞中磷酸化PKA催化亚基和磷酸化CREB水平明显增加(P<0.05);用PKA特异性抑制剂H89预处理,降低了AOH激活的PKA催化亚基和CREB的磷酸化水平.结论:AOH能够激活NIH3T3细胞中PKA-CREB信号转导通路,这为探讨AOH致癌的分子机制提供依据.

转染野生型DNA聚合酶β对交链孢霉酚致突变作用的影响

目的:观察转染野生型DNA聚合酶β(polymerase beta,polβ)对交链孢霉酚(alternariol,AOH)致突变作用的影响。方法:用pEGFP-C3(空载体)、pEGFP-C3-polβ(野生型polβ重组表达载体)质粒转染NIH3T3细胞;转染后的细胞分别用1.5μmol/L、2.0μmol/L和2.5μmol/L3种浓度的AOH诱导48h,RT-PCR扩增DNA polβ基因,克隆至pEGM-T载体后,转化大肠杆菌JM109,筛选鉴定,进行测序分析。结果:转染pEGFP-C3的NIH3T3细胞DNA polβ基因突变点个数随AOH浓度升高而增多,而转染pEGFP-C3-polβ的NIH3T3细胞DNA polβ基因在1.5μmol/L和2.0μmol/L浓度诱导下未见突变发生,当AOH浓度增大到2.5μmol/L才出现DNA polβ基因突变。结论:高表达野生型DNA polβ能够在一定程度上抵抗霉菌毒素的致突变作用。

中药中的霉菌毒素对细胞内基因修复系统的影响

目的观察中药中霉菌毒素对NIH/3T3细胞中DNA聚合酶β(DNApolβ)表达量的影响,研究中药不良反应的机制和互隔交链孢酚致细胞变异的机制。方法体外培养NIH/3T3细胞,用不同浓度的霉菌毒素——互隔交链孢酚(AOH)加入培养液影响细胞。用RT-PCR方法从细胞全RNA中扩增出DNA聚合酶β基因cDNA序列,同时扩增β-actin进行半定量分析了解其表达量的变化。结果成功从NIH/3T3细胞中扩增了DNA聚合酶β基因cDNA,通过半定量分析发现随着药物浓度的增高,DNA聚合酶β表达量上调。结论霉菌毒素可导致细胞中的DNA聚合酶β表达量上调从而影响基因修复系统的功能,AOH的作用浓度越高,DNA聚合酶β基因表达量越高。

交链孢醇和交链孢醇单甲醚的制备

按Ｓｔｉ等的方法制备交链孢醇和交链孢醇单甲醚，发现当完全按照他们的实验条件操作时，不能每步反应都获得所报道的产率，而且相差颇大，为此改变反应条件以使产率较为满意。本文详细报道这一实验结果。