利用柞蚕核型多角体病毒表达载体系统在柞蚕蛹中表达增强型绿色荧光蛋白

为了探讨外源蛋白在柞蚕蛹-柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)表达系统的表达水平和稳定性,将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因克隆到柞蚕核型多角体病毒转移表达载体pApM748BE中,获得重组质粒DNA,与ApNPV DNA共转染樗蚕(Phi-losamia cynthiam)培养细胞Pc-01后,用末端稀释法筛选获得重组病毒ApNPV-Δph/egfp+。将该重组病毒感染柞蚕蛹,采用SDS-PAGE和Western blot方法检测EGFP在柞蚕蛹中的表达,结果显示:在柞蚕蛹感染重组病毒ApNPV-Δph/egfp+后6 d,EG-FP就有明显的表达;感染后12～18 d,蛹体液中的EGFP含量保持较高水平,以EGFP标准样品定量分析EGFP在柞蚕蛹体液中的表达水平高于1 mg/mL;感染后30～39 d仍可以检测到蛹体液中EGFP的表达,而且蛋白稳定。研究结果表明,利用柞蚕核型多角体病毒作表达载体,可在柞蚕蛹中高效稳定地表达EGFP,并且EGFP在雌雄蛹间的表达水平无明显差异。

柞蚕核型多角体病毒基因表达载体系统的构建与基因表达

柞蚕是一种主要分布在我国东北部山区、野外饲养的经济昆虫,以蛹滞育越冬,其蚕蛹具有个大、容易固定、保存时间长、无须饲养、容易运输等优点。利用柞蚕蛹作为生物反应器生产外来蛋白质,可以进行大规模机械化生产,并可减少操作上的烦琐和劳动力。以柞蚕核型多角体病毒(AnpeNPV)作为基因表达载体,在柞蚕培养细胞(AnPe细胞)和柞蚕蛹中成功地表达了β-半乳糖苷酶基因(LacZ),并利用AnPe细胞筛选、获得了纯化AnpeLacZ重组病毒。该重组病毒在TC-100(含10%FBS)培养的AnPe细胞中,感染后第12天β-半乳糖苷酶达到最高,酶活性为40.9units/ml,在SF-900Ⅱ培养的AnPe细胞中,感染后第18天β-半乳糖苷酶达到最高,酶活性为59.9units/ml,后者表达量稍高,但时间滞后。AnpeLacZ在5℃保存了7个月的柞蚕蛹中,感染后第15天酶活性达到最高,雌蛹为14.3units/g,雄蛹为11.7units/g,雌蛹比雄蛹略高。结果显示,柞蚕核型多角体病毒和柞蚕蛹可以作为一个可以机械化大规模生产的新型杆状病毒基因表达载体系统开发和利用。

柞蚕黄色蛹和黑色蛹的营养成分检测分析

食用柞蚕蛹有黄色蛹和黑色蛹。为了科学评价2种颜色柞蚕蛹的营养价值,对2种蛹的主要营养成分进行测定分析。黄色蛹和黑色蛹鲜质量中的蛋白质质量分数分别为12.42%和12.83%,氨基酸质量分数分别为9.64%和8.61%,均含有8种人体必需氨基酸,必需氨基酸分别占总氨基酸质量的34.34%和34.15%,必需氨基酸与非必需氨基酸的比值分别为0.616 4和0.611 2,依据FAO/WHO推荐模式计算获得的必需氨基酸指数(EAAI)分别为97.53和84.19。黄色蛹和黑色蛹鲜质量中的粗脂肪质量分数分别为5.34%和5.91%,且不饱和脂肪酸所占比率均较高,分别为总脂肪的80.72%和80.16%,但必需脂肪酸质量分数有差异,黄色蛹为53.03%,黑色蛹为49.61%。此外,2种颜色柞蚕蛹均含有Mg、Fe、Zn、K、Ca、Cu、Mn等多种矿物质元素,均未检出Pb、Hg、As等重金属元素。综合分析检测数据认为,柞蚕黄色蛹和黑色蛹均属优质蛋白质食品,其中黄色蛹的营养价值略优于黑色蛹。

利用柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)表达载体系统在柞蚕蛹中表达人生长激素

为探究柞蚕核型多角体病毒（ApNPV）表达载体一柞蚕蛹表达系统用于表达哺乳动物活性蛋白的可行性，利用该表达系统表达医用蛋白人生长激素（hGH）。构建插入hgh基因的转移表达载体pApM748BE／hgh，将该转移表达载体质粒DNA与病毒ApNPV-△ph／Aefp／hgh’基因组DNA共转染樗蚕（Philosamiacynthiam）培养细胞Pc一01，用末端稀释法筛选获得重组病毒ApNPV-△ph／Aefp／hgh。采用Westernblotting和ELISA方法，检测到柞蚕蛹感染重组病毒ApNPV—△ph／-△ph／Aefp／hgh／hgh’后第7天体液中就有hGH明显表达；感染后第13～14天蛹体液中的hGH含量保持较高水平，重组hGH的最高表达量可达251．18肛g／mL；感染后第15～20天仍可以检测到hGH的表达，但表达产物出现降解现象。用活化的人红白血病细胞K562检测利用ApNPV表达载体系统在柞蚕蛹表达的重组hGH的体外活性，结果显示其对K562细胞的增殖具有明显的促进作用。

柞蚕嫩蛹保鲜处理及蛹表皮相关酶活性的变化

柞蚕嫩蛹的口感与营养价值高于成熟蛹,而酪氨酸酶、漆酶与蛹体壁的硬化和黑化过程有关。采用低温(4℃)及低温下分别用壳聚糖、海藻酸钠、维生素C(VC)、壳聚糖复合物处理柞蚕嫩蛹,调查各处理组不同时间点的成熟蛹比率,以低温+壳聚糖处理对柞蚕嫩蛹的保鲜效果最好,其余处理组柞蚕嫩蛹的保鲜效果依次为低温+海藻酸钠、低温+壳聚糖复合物、低温+VC、低温。柞蚕蛹表皮酪氨酸酶和漆酶的最适pH分别为7.0、5.0,最适温度分别为30℃、50℃。测定各处理组不同保存时间蛹表皮的酪氨酸酶和漆酶活力,对蛹表皮酪氨酸酶活性的抑制效果依次为低温+壳聚糖、低温+海藻酸钠、低温+壳聚糖复合物、低温+VC、低温;对蛹表皮漆酶活性的抑制效果依次为低温+壳聚糖复合物、低温+壳聚糖、低温+海藻酸钠、低温+VC,低温组的抑制效果最差。采用低温+壳聚糖、低温+海藻酸钠处理能够在柞蚕嫩蛹表面形成薄膜,抑制酪氨酸酶和漆酶的活性,从而阻止嫩蛹表皮的硬化和黑化,达到延长柞蚕嫩蛹保鲜时间的目的。

柞蚕雌蛹与雄蛹的营养组分及含量分析

[目的]客观评价柞蚕蛹的营养价值,为其在食品及保健品领域的应用提供理论依据。[方法]对新选育的柞蚕品种川柞1号柞蚕蛹的营养价值作出科学评价,对该柞蚕雌蛹和雄蛹的主要营养成分进行测定分析。[结果]试验表明,新鲜雌蛹和雄蛹中蛋白质质量分数分别为12.11%和10.80%,氨基酸质量分数分别为10.48%和8.35%,均含有8种人体必需氨基酸,必需氨基酸分别占总氨基酸质量的38.49%和36.36%,必需氨基酸质量比分别为395.1、334.2 mg/g。新鲜雌蛹和雄蛹中的粗脂肪含量分别为4.22%和6.40%;均含有K、Ca、Na、Mg、Cu、Zn、Fe、Mn、Se、Cr等多种矿物质元素,均未检测出Hg、Pb和As等重金属元素。此外,柞蚕雌蛹、雄蛹中还含有多种维生素,包括维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素C、维生素E等,其中维生素B2、维生素C、维生素E的含量较高。[结论]综合分析检测数据认为,柞蚕雌蛹和雄蛹均属于优质蛋白质食品,且雌蛹的营养价值略优于雄蛹。

柞蚕脑中央神经分泌细胞的超微结构

对蛹化后第1天的春柞蚕脑中央神经分泌细胞进行电镜观察,发现柞蚕脑中央神经分泌细胞略呈椭圆形,单极,胞核大,无分支,核内散布着多数染色质小块和少数核仁,细胞质内有由膜包被的多量椭圆形或圆形神经分泌颗粒,轴突基部尤为密集,轴突内亦有分布;此外尚有线粒体和较多的糙面内质网。以上形态特征说明春柞蚕脑中央神经分泌细胞在蛹化后第1天正进行着PTTH的转运和释放,从而导致蛹的继续发育(非滞育)。

柞蚕免疫蛹粉在刺参健康养殖中的应用研究

体外诱导方法制备含有抗菌活性物质的柞蚕蛹粉,并将其以不同比例(0%、1.0%、2.0%)添加到刺参饲料中,并对照商品抗菌肽产品(0.5%添加),制成C、M1、M2和K几种等能、等氮饲料,探讨其在海参养殖中的应用可行性。结果发现,抗菌肽添加组(K)刺参的体增重率(82.06%)显著高于对照组(C)(64.77%)(P<0.05),M1组比对照组提高13.4%,但差异不显著。免疫学指标测定中发现,刺参体腔细胞吞噬活性在各组间无显著差异,但各添加组体腔液超氧化物歧化酶(SOD),M2、K组溶菌酶(LSZ)和M1、M2组酸性磷酸酶(ACP)活性与对照组相比均表现出显著提高(P<0.05),其中SOD活性M1、M2组和K组分别比对照组提高了40.24%、49.91%和61.49%;LSZ活性M2组和K组分别比对照组提高6.41%和5.48%;ACP活性,M1组和M2组分别比对照组提高了29.65%和37.34%。经体腔注射用灿烂弧菌(Vibrio splendidus)侵染各组健康刺参,三处理组刺参均表现出一定的对病原菌的抵抗力,但其中K组刺参的免疫保护率最高。电镜切片显示,柞蚕抗菌肽和免疫蛹粉可以提高小肠绒毛的长度,但2.0%免疫蛹粉则对小肠形态产生一定程度的破坏。综上,饲料添加1.0%柞蚕免疫蛹粉可有效促进刺参生长,并提高抗病力。

柞蚕滞育蛹的体液防卫反应

本文对柞蚕Ａｎｔｈｅｒａｅａｐｅｒｎｙｉ滞育蛹体液防卫的某些特性做了报道。结果表明：（１）经注射大肠杆菌诱导６ｈ后，体液中出现了抗菌活性物质。诱导７ｄ后，抗菌活力达到峰值，１５ｄ后活力消失。用生理盐水诱导的反应较快，４ｄ后达到峰值，１０ｄ后活力消失。（２）经大肠杆菌诱导后的体液对苏芸金杆菌、大肠杆菌、枯草杆菌及金黄葡萄球菌均有杀菌效应。在最初５ｍｉｎ内杀菌效率较高。注射生理盐水诱导的体液较大肠杆菌诱导的杀菌效果低。（３）用昆虫病原菌苏芸金杆菌及非病原菌大肠杆菌作不同的诱导源，诱导１ｄ后的体液对大肠杆菌的抗菌活力差别不显著，但对柞蚕蛹的生活力及发育有明显影响；用苏芸金杆菌诱导的柞蚕滞育蛹３ｄ后死亡，用大肠杆菌诱导的蛹能正常羽化。（４）在一定范围内用不同剂量的大肠杆菌进行诱导，其抗菌活力不受影响，但超过一定限度，既使是非病原菌也可以突破昆虫的防卫功能。

螟黄赤眼蜂工厂化产品的低温贮存研究

针对以柞蚕卵为中间繁殖寄主的螟黄赤眼蜂产品,在贮存虫态、贮存时间方面进行了系统的研究。结果表明,螟黄赤眼蜂不同发育虫态在贮存时间上差别明显。综合分析得出,中、长期贮存虫态应以幼虫中期为最佳,贮存时间应限制在40 d之内。

柞蚕部分现行二化性品种的饲料转化效率分析

采用5龄干量折合法,对生产上推广的11个柞蚕二化性品种的饲料转化效率进行测定分析,筛选出高饲料转化效率的品种作为柞蚕新品种选育的素材。春期试验中,柞蚕品种582基于全茧量和蛹体质量的饲料转化效率最高,分别为16.46%±0.46%、15.08%±0.66%;柞蚕品种早418基于茧层量的饲料转化效率最高,为1.51%±0.13%。秋期试验中,柞蚕品种8821基于蛹体质量、全茧量的饲料转化效率最高,分别为16.77%±1.32%、18.59%±1.39%;柞蚕品种多丝4号基于茧层量的饲料转化效率最高,为1.87%±0.27%。试验结果显示,柞蚕品种间基于全茧量、蛹体质量的饲料转化效率差异显著,基于茧层量的饲料转化效率差异极显著,且基于全茧量、茧层量、蛹体质量3个性状间的饲料转化效率呈现极显著的正相关。

柞蚕不同极性部位的体外抗氧化活性研究

目的以柞蚕雄蛹和雄蛾为研究对象,考察柞蚕的体外抗氧化活性。方法雄蚕蛹粉和雄蛾粉经80%乙醇提取后用石油醚、正丁醇进行萃取,得到石油醚层、正丁醇层和水层,通过紫外-可见分光光度法测定总提物及3个活性部位对超氧阴离子自由基(O-2·)、羟基自由基(·OH)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH·)和2,2'-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)自由基(ABTS+·)的清除能力。结果雄蚕蛹和雄蚕蛾均具有较好的抗氧化活性,其总提液清除O-2·、·OH、DPPH·和ABTS+·的IC50值分别为8.82324 g/L,12.09121 g/L,0.12991 g/L,0.22706 g/L和8.09633 g/L,14.55845 g/L,2.30111 g/L,10.00324 g/L。在极性分部位实验中,雄蛹和雄蛾不同活性部位清除自由基的能力均为:水层>正丁醇层>石油醚层。结论雄蚕蛹和柞蚕雄蛾具有较好的抗氧化活性,有良好的综合抗氧化性和开发应用前景。

柞树叶与柞蚕蛹中的主要矿质元素及重金属元素含量测定

柞蚕及其饲料中的矿物质元素和有害重金属元素含量是科学评价柞蚕食品营养价值与实施产品生产质量监控的重要指标之一。在辽宁省6个市（县）选点采集柞蚕蛹和辽东栎柞树的叶片（采样柞蚕的饲料）,在沈阳市采集分属5个种的柞树叶片,采用HNO_3-H_2O_2高压消解-电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）对上述样品中的矿物质元素和重金属元素含量进行测定。方法学验证加标回收率为97.50%~102.60%,相对标准偏差（RSD）〈3.13%。对柞树叶样品的检测结果表明,同一地区各种柞树叶片中的矿物质元素含量存在差异,槲、麻栎2个种叶片中的重金属元素Mn、Fe、As、Hg、Pb含量较高;来自不同地区的辽东栎叶片中的矿物质元素含量存在显著性差异,其中Mg、P、K、Ca、Mn平均质量比分别为2 909.13、1 727.28、7 060.91、13702.74、514.66 mg/kg,Fe、Cu、Zn、Ni的平均质量比分别为280.11、15.48、22.75、5.19 mg/kg,Se的平均质量比为0.05 mg/kg,重金属元素Cr、As、Cd、Hg、Pb的平均质量比分别为1.52、0.30、0.09、0.02、2.63 mg/kg。检测不同地区来源的柞蚕蛹样品中的矿物质元素含量存在显著性差异,其中Mg、P、K、Ca平均质量比分别为3 725.74、8 019.68、15 102.84、1 234.52 mg/kg,Fe、Mn、Cu、Zn、Ni的平均质量比分别为120.15、14.80、16.64、132.06、2.82 mg/kg,Se的平均质量比为0.37 mg/kg,重金属元素Pb、Hg、Cr、As、Cd的平均质量比分别为1.63、0.01、5.01、0.92、0.32 mg/kg。相关性分析表明,柞树叶与柞蚕蛹中的Mn含量中度相关且相关性达到显著水平（P〈0.05）;柞树叶与柞蚕蛹中的P、K、Cr、Cu、Zn、As含量低度相关,Ni、Hg、Mg、Ca、Fe、Se、Cd、Pb含量在二者间的相关关系极弱。

柞蚕蛹壳聚糖对草莓的保鲜作用研究

利用柞蚕蛹壳制取的壳聚糖是柞蚕副产物综合利用的高附加值产品。采用不同浓度的柞蚕蛹壳壳聚糖涂膜,研究壳聚糖对草莓的保鲜作用。结果表明,以质量分数为1.5%的壳聚糖涂膜的草莓,其可溶性糖含量、维生素C含量和丙二醛含量与新鲜草莓最接近,保鲜效果明显,在常温下可贮藏4 d以上。

虫草菌诱导柞蚕蛹产生抗菌物质的研究

虫草菌诱导柞蚕蛹 ,制取自注射后直至蛹虫草成熟的不同发育阶段的提取液 ,使用抑菌圈法 ,发现雌、雄蛹提取液分阶段对金黄色葡萄球菌具有抑制作用。

柞蚕蛹胶囊饲料及不同性比对饲养蠋蝽的影响

为有效降低用柞蚕Antheraea pernyi蛹人工饲养蠋蝽Aram chinensis的饲料成本,研究柞蚕蛹胶囊饲料制作;在室内分别用柞蚕蛹和其胶囊饲料饲养蠋蝽,观测其发育历期和繁殖力的变化,比较两种饲养方法的饲料成本;同时比较分析柞蚕蛹胶囊饲料饲养蠋蝽时,3种雌雄性比对蠋蝽繁殖力的影响。结果表明:用柞蚕蛹胶囊饲料饲养时,蠋蝽的成活率、若虫发育历期、成虫寿命、产卵量、卵孵化率与直接用柞蚕蛹饲养的均无显著差异,且饲料成本降低50%。用柞蚕蛹胶囊饲料饲养蠋蝽时,雌雄性比1∶1与3∶2配置间的产卵量及产卵次数差异不显著,但显著高于雌雄性比2∶3配置的,雌雄性比3∶2是人工饲养蠋蝽的最佳性比。

柞蚕蛹多肽对ICR雄性小鼠性功能的影响

给ICR雄性小鼠灌胃低、中、高3个剂量(0.20 g/kg、0.50 g/kg、1.25 g/kg)的柞蚕蛹多肽,分别设定空白对照组、乳清蛋白(0.50 g/kg)阳性对照组,连续灌胃30 d后,与ICR雌性小鼠进行交配,通过考察交配潜伏期、20 min内交配的次数以及检测雄性ICR小鼠血清中睾酮和NO含量、睾丸质量、精液囊质量、前列腺质量,研究柞蚕蛹多肽对ICR雄性小鼠性功能的影响。结果显示,与空白对照组相比较,柞蚕蛹多肽各剂量组小鼠睾丸和附性腺质量及其脏器指数有增加趋势,0.50 g/kg、1.25 g/kg柞蚕蛹多肽剂量组小鼠血清中睾酮和NO含量显著增加,捕捉潜伏期和交配潜伏期时间显著缩短,捕捉次数和交配次数显著增加。结果表明,柞蚕蛹多肽能显著提高雄性ICR小鼠性交配能力及性功能。

蛹虫草菌侵染柞蚕蛹条件的研究

分别从菌种处理、接种方式、寄主三个角度研究了蛹虫草菌侵染柞蚕蛹的条件,结果表明,用添加70%柞蚕蛹浸出汁制作蛹虫草菌的液体培养基对菌种进行活化培养,以注射的方式接种于灭菌后(121℃,20 min)的柞蚕蛹体内,培养出的子实体最好,蛹体完全僵化所需时间缩短至6 d,僵化率及发草率分别提高至98.0%和99.3%。

球孢白僵菌侵染的柞蚕蛹体壁和脂肪体组织病理观察

【目的】探究球孢白僵菌Beauveria bassiana穿透柞蚕Antheraea pernyi蛹体壁和侵染其脂肪体的过程,进一步明确其对柞蚕蛹的致病机理。【方法】利用扫描电镜技术观察球孢白僵菌穿透柞蚕蛹体壁的病理变化,并运用透射电镜技术观察球孢白僵菌侵染的柞蚕蛹脂肪体的病理变化。【结果】扫描电镜观察结果显示:在球孢白僵菌侵染柞蚕蛹体表过程中,分生孢子主要侵染气门、刚毛根部和头部与胸部的节间膜等部位。分生孢子除了从气门、刺突、头部和胸部的节间膜进入体内以外,也可以直接穿透厚而坚硬的体壁进入体内。透射电镜观察结果显示,脂肪体中,球孢白僵菌首先侵染细胞器(线粒体除外),然后再侵染脂肪滴。被侵染的脂肪滴颜色变浅,表面出现许多孔洞,变形,分裂成小的脂肪滴进而完全被侵蚀。蛹僵硬时,脂肪体细胞完全被破坏,只观察到芽生孢子和菌丝。【结论】柞蚕蛹经体表侵染和注射侵染球孢白僵菌处理后,蛹的体壁和脂肪体两组织都发生了明显的病理变化。

不同柞蚕品种鲜蛹营养组分检测及分析

[目的]选育适合在一化性柞蚕产区放养的优质、高产、蛹丝兼用的柞蚕新品种。[方法]对川柞1号、川柞2号、河33、贵101及通江这5个柞蚕品种鲜蛹的主要营养成分、氨基酸、维生素及微量元素锌、硒的含量进行检测分析。[结果]川柞2号鲜蛹营养组分综合表现最优,其中蛋白质质量分数为12.45%;粗脂肪质量分数为5.77%;氨基酸质量分数为9.71%,EAA/TAA为40.37%,EAA/NEAA为67.6%,药效氨基酸和支链氨基酸含量略高于其他品种,鲜味氨基酸仅次于贵101;维生素A、B 1、B 2、C、E及微量元素锌、硒含量较为丰富。[结论]川柞2号属优质蛋白质资源,适合在一化性柞蚕产区作为蛹丝兼用品种示范推广。