鼠源抗B型肉毒毒素单链抗体噬菌体文库的构建筛选及抗体免疫学活性的初步研究

B型肉毒毒素重链C-端片段(BoNTB/Hc)经金属螯和层析法纯化后免疫Balb/c小鼠,从其脾淋巴细胞中提取总RNA,反转录成cDNA,用抗体可变区混合引物进行全套抗体重、轻链可变区基因的扩增,体外随机装配成单链抗体(scFv)。将其克隆至pCANTAB5E中,构建单链抗体噬菌体抗体库。结果表明经过4轮"吸附-洗脱-扩增"的富集过程,筛选获得高亲和力的克隆。序列测定符合抗体可变区结构特点。

B型肉毒毒素保护性抗原Hc在大肠杆菌中的可溶性高表达

目的:通过序列优化及表达条件改进,在大肠杆菌中高效可溶性表达B型肉毒毒素保护性抗原Hc(Bont/B-Hc)。方法:对Bont/B-Hc基因片段优化,用大肠杆菌常用密码子替换稀有密码子,并将(G+C)含量由76.2%降至56.3%;人工合成多条具有重叠互补序列的寡核苷酸片段,采用重叠延伸PCR方法获得了Bont/B-Hc的全长基因,并构建了原核可溶性表达载体;将经酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导Bont/B-Hc的表达并进行纯化及Western印迹鉴定。结果和结论:目的蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了可溶性高表达,占菌体裂解液上清总蛋白的26.7%,表达量达到30mg/L,是目前国内外已知表达的最高水平;经Ni柱一步纯化后,目的蛋白纯度可达到80.3%,为肉毒毒素中和抗体的制备及亚单位疫苗的研究奠定了基础。

B型肉毒毒素受体结合区C片段在大肠杆菌中的表达及免疫原性研究

目的:在大肠杆菌中表达、纯化B型肉毒毒素受体结合区C片段(BHc-C),研究其免疫原性。方法:将BHc-C基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达GST-BHc-C融合蛋白并通过亲和纯化;以纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠制备免疫血清,采用ELISA检测免疫血清的效价并测定其抗B型肉毒毒素中和活性。结果:在大肠杆菌中表达了GST-BHc-C融合蛋白;以该融合蛋白免疫小鼠获得高效价免疫血清,且该免疫血清具有中和活性。结论:获得了GST-BHc-C融合蛋白,并证实其具有免疫原性。

我国及部分国家B型肉毒毒素的中毒情况

肉毒毒素是自然界中已知毒性最强的毒素,通常被分为A～G共7个血清型,其中A、B、E型是最常见的人类中毒型别。肉毒中毒的流行特点与菌体的地域分布、各地居民的饮食习惯和社会活动都有一定关系。目前,除南极洲外的世界各大洲均有B型肉毒中毒的报道。我国、日本及欧洲B型肉毒中毒主要为家庭自制食物引发的食源性中毒,而美国则主要为婴儿肉毒中毒。近年来,创口型B型肉毒中毒与"注射型吸毒人员"的关联引起了研究者的注意。为了加深对B型肉毒中毒的了解,我们对我国及部分国家和地区的B型肉毒中毒情况做简要介绍。

B型肉毒毒素单克隆抗体杂交瘤株的建立

[目的]制备、筛选稳定分泌B型肉毒毒素单抗的杂交瘤克隆,为相关研究提供工具。[方法]采用纯化的B型肉毒毒素免疫BALB/c小鼠,用免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0融合,筛选阳性克隆。[结果]得到10株稳定分泌B型肉毒毒素单抗的杂交瘤克隆,1株为IgM,其余9株分泌IgG,亚类为IgG2a。10株单克隆抗体均与B型肉毒毒素呈特异性反应,而与标准A型肉毒毒素无交叉反应,腹水单抗的效价均在105以上。[结论]10株杂交瘤细胞株均能分泌抗B型肉毒毒素单克隆抗体,为B型肉毒毒素的检测和研究提供了工具。

B型肉毒毒素重链C端基因的表达与保护作用的初步研究

肉毒毒素是肉毒梭状杆菌产生的外毒素,有7种血清型(A～G),是目前已知的毒性最强的细菌蛋白质。人类肉毒中毒主要是由A、B和E型引起。本研究克隆了B型肉毒毒素重链C端片段(Hc),在大肠杆菌中进行了诱导表达,并用Ni离子亲和柱进行了纯化。Hc蛋白免疫后的BALB/c小鼠可以抵抗6×103LD50B型肉毒毒素攻击。

鼠源抗B型肉毒毒素Fab抗体库的构建及初步筛选

目的:应用重组噬菌体抗体库技术制备抗B型肉毒毒素Fab抗体。方法:用重组B型肉毒毒素重链C端片段(BoNTB/Hc)免疫BALB/c小鼠,从其脾淋巴细胞扩增免疫球蛋白Fd段和κ链基因,克隆至表达载体pComb3中,并将抗体Fab段表达于噬菌体表面,建立容量为5.96×106cfu的噬菌体抗体库。以BoNTB/Hc为抗原对所建抗体库进行4轮亲和筛选,获得与B型肉毒毒素特异性结合的克隆,并进行序列测定。结果:构建了抗B型肉毒毒素Fab抗体库,筛选出特异性克隆1个。结论:从鼠源噬菌体免疫抗体库中初步获得了特异性抗B型肉毒毒素的Fab抗体。

B型肉毒毒素中毒的实验诊断及分析

目的:于2003年初,在江苏地区,因食入自制豆酱后,引起家庭内食物中毒病因的检测。方法:由临床医生依据患者的主诉和症状,初步判定为疑似食物中毒,病因不明。经过流行病学调查,收集患者进食的剩余食品,样品经过处理,进行肉毒毒素的毒力测定试验,肉毒毒素的分型试验以及肉毒梭菌的分离和培养试验。结果:测定自制豆酱中肉毒毒素含量LD50为2万单位;所检出的毒素为肉毒毒素B型。结论:综合临床诊断,流行病学调查资料和实验诊断结果,推断此次食物中毒的病因为自制豆酱中的B型肉毒毒素。

B型肉毒毒素重组Hc亚单位疫苗的免疫原性研究

目的:用大肠杆菌表达重组B型肉毒毒素受体结合区Hc抗原(BHc)作为亚单位疫苗,并研究其免疫原性。方法:构建pTIG-Trx-BHc原核表达载体,用大肠杆菌表达并纯化重组BHc抗原;免疫BALB/c小鼠以研究它的免疫原性。结果:大肠杆菌表达并纯化获得了重组BHc抗原,免疫小鼠后能刺激机体产生高效价的抗BHc抗体和保护性免疫反应。该重组BHc亚单位疫苗1μg剂量2次免疫小鼠即可产生对104LD50剂量B型肉毒毒素攻毒的完全保护,血清中和效价可达1.33 IU/m L。结论:大肠杆菌表达的重组BHc抗原具有良好的免疫原性,能够有效地保护小鼠抵抗B型肉毒毒素的攻击,该BHc抗原能够作为亚单位候选疫苗预防B型肉毒毒素中毒。

B型肉毒毒素单克隆抗体的制备和鉴定

目的利用杂交瘤技术筛选抗B型肉毒毒素(BoNT/B)的鼠源单克隆抗体(mAb)。方法以BoNT/BHc蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,筛选阳性细胞株经有限稀释法克隆化后,采用腹水诱生的方法制备抗体,通过亚型鉴定、SDS-PAGE、Western印迹以及非竞争ELISA等方法对抗体进行鉴定。结果5只BALB/c小鼠免疫后尾血效价均达到1∶64000,取其中效价最高的5号鼠制备杂交瘤,筛选到9株阳性细胞,经鉴定抗体重链有IgG1和IgG2b两种亚型,轻链均为κ型。腹水制备的1E9-H2抗体纯度>96%,以线性表位与抗原BoNT/BHc特异性结合,亲和力常数为6.7×10-9mol/L。结论筛选到1株高亲和力鼠源单克隆抗体,为BoNT/B中和抗体研发及检测方法建立提供了选择。

B型肉毒毒素轻链蛋白的原核表达及纯化

目的克隆B型肉毒毒素轻链Bont-B基因,使其在大肠杆菌内表达,并对表达的重组蛋白进行纯化。方法设计并人工合成Bont-B基因,克隆入表达载体pMD19-T中,构建质粒pMD19-T-Bont-B,经酶切后与pET-28a载体连接,构建重组表达质粒pET-28a-Bont-B,将重组表达质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blot分析后,经金属螯合层析Cu2+柱进行纯化,纯化产物经SDS-PAGE分析纯度。结果重组表达质粒pET-28a-Bont-B经PCR、双酶切及测序鉴定,证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约50 000,主要以可溶性形式表达,表达量约占菌体总蛋白的6%;纯化后的重组蛋白纯度可达90%以上。结论已成功克隆并在大肠杆菌BL21(DE3)中原核表达了Bont-B轻链基因,为制备抗Bont-B轻链单克隆抗体及研究肉毒中毒机制和治疗奠定了基础。

B型肉毒素干预choke Ⅱ区对大鼠跨区皮瓣的影响

目的研究B型肉毒毒素(BTX B)术中干预大鼠背部跨区穿支皮瓣choke Ⅱ区对皮瓣成活的影响。方法在大鼠背部建立三血管体穿支皮瓣模型,50只SD大鼠采用数字表法随机分为实验组(B型肉毒素组)和对照组(生理盐水组),术后即刻,对实验组皮瓣choke Ⅱ区皮下间隔0.2mm均匀注射100U,总计1500U(约0.3ml) BTX B,对照组采用相同剂量生理盐水均匀注射choke Ⅱ区。术后7天分别检测两组皮瓣的成活率;用明胶-氧化铅灌注进行皮瓣造影;取蒂部组织做HE测蒂部穿支动脉血管管径变化;取choke Ⅱ区域组织做HE测微血管数量;取choke Ⅱ区域组织做RT-PCR测VEGF、HIF-1α的表达情况。结果术后7天,实验组皮瓣的成活面积(90±2.9)%显著高于对照组(75±3.2)%,差异有统计学意义(P<0.01);明胶-氧化铅灌注造影显示实验组choke区真性吻合数较对照组明显增多。实验组choke Ⅱ区VEGF、HIF-1α基因表达均明显高于对照组(P<0.01)。实验组蒂部穿支动脉管径大于对照组(P<0.01),新生血管计数高于对照组(P<0.05)。结论 B型肉毒毒素可以促进皮瓣choke血管扩张及血管新生改善皮瓣血供,从而提高了大鼠背部跨区穿支皮瓣的成活。

B型肉毒毒素轻链荧光表达细胞模型的构建及应用

目的 构建B型肉毒毒素轻链(BoNT/B,BLC)荧光表达细胞模型,并用于小分子化合物效应评价。方法 将BLC基因导入荧光表达载体pEGFP-N1中,构建重组质粒,并将其转染至神经细胞系Neuro-2a细胞中进行表达,通过荧光显微镜观察细胞内BLC-EGFP蛋白荧光表达水平,利用Western印迹法检测细胞中BLC-EGFP的酶切活性和稳定性,进一步利用该模型评价SRC激酶抑制剂KX2-391对BLC-EGFP蛋白胞内稳定性的影响。结果 成功构建重组表达质粒pEGFP-N1-BLC。质粒转染后,BCL-EGFP蛋白在Neuro-2a细胞中的表达水平随时间逐渐增加并具有酶切胞内底物囊泡相关蛋白-2(VAMP-2)的活性;质粒转染12 h后加入CHX终止蛋白合成,BLC-EGFP的胞内水平在72 h内无显著变化;加入KX2-391作用24 h后,可显著促进BLC-EGFP蛋白的胞内降解。结论 成功建立B型肉毒毒素轻链荧光表达细胞模型,为后续B型肉毒毒素轻链胞内持留机制研究和胞内解毒剂筛选提供了技术储备。

A型肉毒毒素与B型肉毒毒素治疗颈肌张力障碍比较

背景：本文是2003年肉毒毒素治疗颈肌张力障碍的Cochrane评价的更新版。颈肌张力障碍是最常见的局限性肌张力障碍，是一种以非自主性疼痛性头部姿势为特征的致残性障碍。肉毒毒素有A、B两型，A型肉毒毒素（BtA）通常是颈肌张力障碍的第一线治疗药物。B型肉毒毒素（BtB）是替代药物，没有强有力的理由说明BtB可能与BtA同样有效或比BtA更有效。

B型肉毒毒素单克隆抗体的制备及其检测试剂盒的研制

目的 建立B型肉毒毒素(botulinum toxin B, BoNT/B)快速检测方法,研制B型肉毒毒素酶联免疫吸附测定(ELISA)检测试剂盒。方法 以B型肉毒类毒素为抗原免疫小鼠,用杂交瘤技术获得鼠源单克隆抗体(单抗),体内法扩大制备单抗。间接ELISA测定杂交瘤细胞株分泌单抗的稳定性、腹水效价以及单抗的亚型、理化性质和抗原识别表位。过碘酸钠法对抗原表位差异较大的抗体进行HRP标记,筛选最佳包被抗体和标记抗体,并确定包被抗体包被浓度和标记抗体工作浓度。将其配制成试剂盒,对试剂盒的线性、定量限、准确度和重复性等进行研究。结果 筛选、鉴定8株能稳定分泌B型肉毒毒素特异性单抗的杂交瘤细胞株。8株单抗腹水效价1∶32 000~1∶512 000,重链为IgG类、轻链为κ型,均耐碱、耐热,不耐酸,其中4C11、4D7、7F9和8D2 4株单抗抗原表位差异较大。以4D7为包被抗体、8D2为标记抗体配制试剂盒,B型肉毒毒素滴度在2~32 LD_(50)/mL范围内呈现良好的线性(r=0.996),定量限为0.96 LD_(50)/mL,试剂盒2~8℃有效期为12个月,与A、C、D、E和F型肉毒毒素均无交叉反应。B型肉毒毒素3、6、12、24 LD_(50)/mL的回收率均在85%~115%之间,重复性CV≤15%。结论 筛选得到8株鼠源单抗,建立了B型肉毒毒素快速ELISA检测方法,研制了检测周期短且高灵敏度的B型肉毒毒素ELISA检测试剂盒。