扶正化纤方调控PI3K/AKT/BAD信号通路对肝纤维化小鼠的作用及机制

目的基于PI3K/AKT/BAD信号通路探讨扶正化纤方对肝纤维化小鼠的作用及机制。方法采用腹腔注射20%四氯化碳-橄榄油溶液0.2 mL,每周3次,连续4周,复制肝纤维化小鼠模型。将C57B/L雄性小鼠随机分为正常组、模型组、安络化纤丸组(0.78 g·kg^(-1))以及扶正化纤方低、中、高剂量组(3.1、6.2、12.4 g·kg^(-1)),每组6只。灌胃给药(10 mL·kg^(-1)),每日1次,持续4周。使用小动物超声仪检测肝脏弹性值;HE、Masson、天狼星红染色法观察小鼠肝脏组织病理变化;ELISA法检测血清透明质酸(HA)、层黏蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(P-ⅢC)及Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)水平;qRT-PCR及Western Blot法检测肝脏组织中AKT、BAD、Bax、Bcl-2 mRNA及蛋白表达;免疫荧光法检测肝脏组织中α-SMA表达水平。结果与空白组比较,模型组小鼠的体质量、肝质量明显降低(P<0.05,P<0.01);肝脏弹性值显著升高(P<0.01);胶原纤维面积占比显著升高(P<0.01);血清HA、LN、P-ⅢC、Ⅳ-C水平均显著升高(P<0.01);肝脏组织α-SMA阳性表达面积占比显著升高(P<0.01),AKT、Bcl-2 mRNA及蛋白表达显著上调(P<0.01),BAD、Bax mRNA及蛋白表达显著下调(P<0.01)。与模型组比较,各给药组小鼠的体质量、肝质量均明显升高(P<0.05,P<0.01);肝脏弹性值均显著降低(P<0.01);胶原纤维面积占比均显著降低(P<0.05,P<0.01);血清HA、LN、P-ⅢC、IV-C水平均显著下降(P<0.01);肝脏组织α-SMA阳性表达面积占比显著降低(P<0.01),Bcl-2 mRNA及蛋白表达显著下调(P<0.01),AKT蛋白表达显著下调(P<0.01),BAD、Bax mRNA表达显著上调(P<0.01)。扶正化纤方中、高剂量组小鼠肝脏组织中AKT mRNA表达显著下调(P<0.01),Bax蛋白表达显著上调(P<0.01);扶正化纤方低、高剂量组小鼠肝脏组织中BAD蛋白表达显著上调(P<0.01)。结论扶正化纤方可能通过PI3K/AKT/BAD信号通路调控下游Bcl-2、Bax蛋白表达,促进活化肝星状细胞(HSC)凋亡,减少细胞外基质(ECM)及胶原纤维合成,从而改善四氯化碳诱导的肝纤维化小鼠肝内纤维间质沉积。

杏仁核注射红藻氨酸诱导的边缘叶发作癫痫大鼠海马Bad去磷酸化和Bcl-2表达上调

应用红藻氨酸(kainicacid,KA)诱导的大鼠边缘叶发作癫痫模型,检测Bad(Bcl-2-associateddeathprotein)、14-3-3、磷酸化Bad、Bcl-XL和Bcl-2在癫痫大鼠海马神经元的表达。单侧杏仁核内注射KA诱导癫痫发作,持续记录脑电和局部脑血流(regionalcerebralbloodflow,r-CBF),发作1h后静脉注射30mg/kg安定终止发作,然后分别用cresylviolet染色和TUNEL染色观察海马神经元存活和凋亡的变化;用免疫荧光、Westernblot和免疫沉淀检测海马Bad、14-3-3、磷酸化Bad、Bcl-XL和Bcl-2的表达。结果表明,发作终止8h时出现TUNEL阳性细胞,24h时达高峰;发作诱导Bad去磷酸化,去磷酸化的Bad与分子伴侣蛋白14-3-3解离,然后Bad与Bcl-XL结合;磷酸化Bad表达减少而Bcl-2表达增加;发作前后r-CBF无明显变化。以上结果提示,癫痫发作诱导Bad的去磷酸化和Bcl-2表达上调,Bad的去磷酸化可能具有损伤作用,而Bcl-2的表达上调则对癫痫神经元损伤具有保护作用,但与脑缺血无关。

电针足三里穴、曲池穴对脑缺血再灌注大鼠Bad及其磷酸化的影响

目的:探讨电针"足三里"、"曲池"对脑缺血再灌注大鼠凋亡相关蛋白Bad及其磷酸化的影响。方法:将雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、电针组,采用Zea Longa线栓法制备局灶型脑缺血再灌注模型,术后24h开始电针刺激偏瘫侧"足三里"、"曲池"穴。Zealonga 5分法用于模型的筛选及神经功能缺损程度,TUNEL法分析皮质区缺血半暗带神经细胞凋亡情况,采用Western blotting检测脑组织中Bad、p-Bad蛋白表达水平。结果:模型组大鼠缺血皮质区Bad表达增高,p-Bad表达下降。与模型比较,电针组Bad表达下降,p-Bad表达增高。结论:电针治疗可抑制Bad的表达,提高Bad磷酸化,从而发挥抗脑缺血所致的神经细胞凋亡的作用。

Bcl-2/Bad/mPTP通路介导14-3-3γ对抗脂多糖所致心肌损伤

目的探讨Bcl-2/Bad/mPTP通路在14-3-3γ对抗脂多糖所致心肌损伤中的作用。方法构建pFLAG-14-3-3γ重组质粒,转染至原代乳鼠心肌细胞中,然后行LPS损伤处理。处理结束后,取培养液检测LDH活性,MTT比色法检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡,线粒体肿胀实验检测mPTP开放,Western blot检测14-3-3γ、Bad、phospho-Bad以及线粒体Bcl-2蛋白表达。结果 LPS损伤使心肌细胞LDH活性升高、细胞存活率下降、凋亡细胞增加、mPTP开放加剧,转染pFLAG-14-3-3γ重组质粒后再行LPS损伤,则LDH活性下降、细胞存活率升高、mPTP开放与细胞凋亡减少,同时phospho-Bad蛋白表达增加,线粒体Bcl-2蛋白表达增加。结论 pFLAG-14-3-3γ能够对抗脂多糖所致的心肌细胞损伤,其机制可能与磷酸化Bad,释放Bcl-2至线粒体,抑制mPTP的开放有关。

脑络欣通及其拆方对脑缺血再灌注大鼠NGF、PI3K、Akt以及Bad蛋白表达的影响

目的观察局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠缺血半暗带NGF、PI3K、Akt以及Bad蛋白的动态表达及脑络欣通(黄芪、川芎、三七、蜈蚣等)对其影响。方法以线栓法阻塞大鼠左侧大脑中动脉,复制局灶性脑缺血再灌注模型,缺血2 h再灌注3、7、14 d,用免疫组化染色SABC法分别检测缺血半暗带NGF、PI3K、Akt、Bad的表达。结果与模型组相比,脑络欣通组在脑缺血再灌注3、7、14 d后,能够明显增加PI3K、Akt的表达(P<0.01或P<0.001);在再灌注7、14 d,脑络欣通组NGF蛋白表达显著升高(P<0.05或P<0.01);再灌注14 d,脑络欣通组Bad蛋白表达显著减少(P<0.05)。结论脑络欣通能够保护脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织,其作用机制可能与促进NGF表达,激活PI3K/Akt通路并降低Bad蛋白表达有关。

线粒体雌激素受体β通过与Bad相互作用抑制非小细胞肺癌细胞的凋亡

目的探究线粒体雌激素受体β(ERβ)抑制凋亡刺激诱导非小细胞肺癌细胞死亡的分子机制。方法免疫荧光及western blotting分析细胞内源ERβ的线粒体定位;检测顺铂与十字孢碱(staurosporine,STS)处理过表达或沉默线粒体ERβ后细胞凋亡的变化;免疫共沉淀和western blotting分析线粒体ERβ与促凋亡蛋白Bad的相互作用。结果 ERβ存在于A549及201T细胞的线粒体中;过表达或沉默ERβ可以显著减少或增加顺铂与STS诱导的Bax激活及细胞凋亡;线粒体ERβ与促凋亡蛋白Bad相互作用可能阻抑Bax的活化及线粒体转位。结论线粒体雌激素受体β可以通过与Bad相互作用抑制顺铂或STS诱导非小细胞肺癌细胞的凋亡,提示线粒体ERβ可能是治疗非小细胞肺癌的一个新靶点。

人参皂甙Rb_1对大鼠缺血再灌注心肌细胞Bcl-2、Bax、Bad、Fas基因表达的影响

目的 观察人参皂甙Rb1对缺血再灌注心肌细胞Bcl 2、Bax、Bad、Fas基因表达的影响。方法 结扎 /松解Wistar大鼠左冠状动脉前降支 ,建立大鼠缺血再灌注动物模型 ,免疫组化法检测Bcl 2、Bax、Bad、Fas基因的蛋白表达 ,并利用图象分析系统测量蛋白阳性表达区域平均光密度值 ,进行定量分析。结果 缺血再灌注组及Rb1治疗组Bcl 2、Bax、Bad、Fas基因的表达较假手术组明显增加 (P <0 0 5 ) ,Rb1治疗组Bcl 2的表达与缺血再灌注组比较无明显差异 (P >0 0 5 ) ,而Bax、Bad、Fas的表达明显下降 (P <0 0 5 ) ,人参皂甙Rb1治疗组Bcl 2 /Bax、Bcl 2 /Bad以及Bcl 2 /Fas比值均较假手术组与缺血再灌注组明显增加。结论 人参皂甙Rb1治疗可以抑制缺血再灌注心肌细胞中促凋亡基因Bax、Bad、Fas的表达 ,并使Bcl 2 /Bax、Bcl 2 /Bad以及Bcl 2 /Fas比值增加。

正常人眼晶状体中细胞凋亡调节基因Bad、Bcl-xl的表达及其意义

目的 探讨正常人眼晶状体中促进细胞凋亡基因Bad和抑制细胞凋亡基因Bcl xl是否有表达及表达情况。方法 正常人眼晶状体 8个 ,常规石蜡包埋切片 ,采用免疫组织化学方法 (SP法 )观察晶状体上皮、前囊、后囊、囊下、晶状体纤维组织中Bad、Bcl xl基因的表达。结果 Bad、Bcl xl基因在正常人眼赤道部晶状体上皮细胞及较新形成的晶状体纤维内表达 ,且相同部位两种基因的表达量没有统计学差异 (P <0 0 5 ) ,而中央区晶状体上皮细胞、晶状体囊、老化的晶状体纤维内无Bad、Bcl xl基因表达。结论 正常人眼晶状体功能的维持可能是抑制细胞凋亡基因与促进细胞凋亡基因共同作用的结果。

凋亡相关基因bcl-2、bad在乳腺癌中的表达及意义

目的:探讨凋亡相关基因bcl-2、bad在乳腺癌组织中的表达及其与患者预后的关系。方法:采用免疫组化方法检测10例正常乳腺组织、10例乳腺纤维瘤组织、40例青年乳腺癌组织、40例老年乳腺癌组织中bcl-2、bad基因的表达,并检测80例乳腺癌组织中ER、PR的表达。结果:bcl-2表达随乳腺癌的组织学分级增加呈递减趋势(P<0.01),青年乳腺癌患者bcl-2表达阳性率显著低于老年乳腺癌患者(P<0.05),bcl-2表达阳性率与腋窝淋巴结转移呈负相关(P<0.05),与ER、PR表达呈正相关(P<0.05)。bad表达随乳腺癌的组织学分级增加也呈递减趋势(P<0.05),青年乳腺癌患者bad表达阳性率显著低于老年乳腺癌患者(P<0.05),bad表达阳性率与腋窝淋巴结转移、ER、PR表达无明显相关(P>0.05)。结论:bcl-2、bad可以作为预测乳腺癌预后的因子。检测乳腺癌组织中bcl-2基因表达水平,特别是联合检测bcl-2、bad以及ER、PR的表达水平,有助于个体化判断乳腺癌患者的预后,并指导治疗。

Bad、Bax和Bid蛋白表达在非酒精性脂肪性肝炎中的作用

目的:探讨细胞凋亡相关蛋白Bad、Bax和Bid表达在小鼠非酒精性脂肪性肝炎(non- alcoholic steatohepatitis,NASH)中的作用.方法:采用胆碱-蛋氨酸缺乏、高脂(high fat,methionine and choline deficient,MCD)饮食建立小鼠NASH模型(实验组),以胆碱-蛋氨酸充足饮食设立对照组.HE染色观察肝脏脂肪变、炎症活动和纤维化程度:采用Western blot检测Bad、Bax和Bid蛋白表达.结果:MCD饮食喂养小鼠10 d可见轻度肝脂肪变,3 wk形成中、重度肝脂肪变及明显的炎性细胞浸润,8 wk肝脂肪变、肝细胞坏死、炎性细胞浸润加重,或伴有轻度肝纤维化.血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase.ALT)水平随肝损伤加重而进行性升高.10 d、3 wk和8 wk实验组小鼠肝组织Bad和Bax蛋白表达显著高于对照组(P<0.05、P<0.01和P<0.05);造模10 d实验组小鼠Bid蛋白活化,10 d、3 wk和8 wk表达均显著高于对照组(P<0.01).结论:MCD饮食可导致小鼠NASH,诱发细胞凋亡调节蛋白Bad、Bax和Bid表达上调.

川芎嗪对宫颈癌Hela细胞磷酸化Bad蛋白和Survivin蛋白表达的影响

目的研究川芎嗪(TMP)对Hela细胞磷酸化Bad(p-Bad)蛋白和Survivin蛋白表达的影响。方法四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)法检测TMP对Hela细胞增殖的抑制作用;流式细胞术检测细胞凋亡率;Western印迹法检测p-Bad和Survivin蛋白的表达。结果与对照组相比TMP可抑制Hela细胞的增殖(P<0.01);增加Hela细胞的凋亡率(P<0.05,P<0.01);降低p-Bad蛋白和Survivin蛋白的表达(P<0.05,P<0.01)。结论TMP可抑制Hela细胞增殖,诱导Hela细胞凋亡,降低p-Bad蛋白和Survivin蛋白的表达,这可能是TMP诱导Hela细胞凋亡的机制之一。

CCl4诱发galectin-3基因敲除鼠急性肝损伤中GRP78和BAD表达

目的观察半乳糖凝集素-3(galectin-3)基因敲除鼠肝脏中GRP78和BAD表达,探讨急性肝损伤中galectin-3抗凋亡作用。方法制备GRP78和BADDNA探针,分别利用Western和Northern杂交技术检测在CCl4损伤galectin-3基因敲除鼠肝组织中GRP78和BAD蛋白和mRNA表达。结果成功构建PTS1-BAD和PTS1-GRP78扩增质粒。GRP78蛋白主要定位在微粒体中,galectin-3+/+小鼠经CCl4处理6-14h后,肝脏GRP78表达上调至高峰,而后恢复正常;在galectin-3-/-小鼠中,CCl4处理后GRP78表达水平未见变化。正常或者CCl4处理的galectin-3+/+和-/-小鼠中GRP78 mRNA表达未见显著差别。galectin-3+/+鼠中主要定位在微粒体中在CCl4处理前后未见BAD蛋白在细胞浆和微粒体中表达。galectin-3-/-中BAD主要定位在肝细胞浆和微粒体,CCl4处理前后表达升高。BAD mRNA 1.6kb片段在galectin-3+/+和-/-小鼠经CCl4处理前后均没有变化,但0.9kb片段galectin-3+/+和-/-小鼠经CCl4处理后表达降低。结论CCl4可诱导肝脏mRNA降解,该过程中参与细胞凋亡的蛋白质表达升高。galectin-3+/+小鼠CCl4处理后肝细胞凋亡以内质网应急途径为主,而galectin-3-/-则以线粒体为主。在肝细胞中galectin-3对线粒体凋亡和内质网应急途径均有抑制作用。

Bad联合Caspase-8促凋亡基因共表达对SK-HEP-1肝癌细胞体外增殖、凋亡、迁移和体内成瘤影响的实验研究

目的观察Bad联合Caspase-8促凋亡基因共表达对SK-HEP-1肝癌细胞体外增殖、凋亡、迁移和体内成瘤影响。方法利用基因重组技术构建Bad-Caspase-8共表达融合基因。慢病毒转染SK-HEP-1肝癌细胞72 h后,蛋白质免疫印迹法观察细胞中Bad蛋白和Caspase-8蛋白表达,CCK-8法检测BadCaspase-8融合基因过表达对SK-HEP-1肝癌细胞增殖影响,流式细胞仪检测其对SK-HEP-1肝癌细胞凋亡影响,Transwell侵袭实验检测转染后细胞迁移变化,最后将转染SK-HEP-1肝癌细胞接种至裸鼠皮下观察成瘤效果。结果转染72 h后,SK-HEP-1肝癌细胞中Bad蛋白和Caspase-8蛋白水平显著增加,细胞增殖能力显著降低,实验组、对照组和空白组OD值分别为0.86±0.122、1.89±0.315和2.01±0.194,P<0.001;转染后SK-HEP-1肝癌细胞凋亡率明显增加,实验组、对照组和空白组细胞凋亡率分别为(31.6±2.8)%、(3.2±0.9)%和(2.9±1.1)%,P<0.001,转染后SK-HEP-1肝癌细胞迁移能力显著降低,实验组、对照组和空白组细胞迁移数分别为18±3,77±10和85±11,P<0.001;细胞接种至裸鼠皮下15 d,与对照组和空白组相比,实验组肿瘤生长速度缓慢,实验组、对照组和空白组成瘤体积分别为(1.6±0.17)cm3、(4.4±0.29)cm3和(4.9±0.42)cm3,P<0.001。结论促凋亡基因Bad和Caspase-8共表达可显著降低SK-HEP-1肝癌细胞增殖活性,促进SK-HEP-1肝癌细胞凋亡,减少SK-HEP-1肝癌细胞迁移,抑制SK-HEP-1肝癌细胞体内成瘤效率,可作为肝癌靶向治疗潜在靶点。

急性一氧化碳中毒迟发性脑病大鼠海马神经细胞凋亡及Erk1/2,Bad蛋白的表达

目的:研究急性一氧化碳(CO)中毒迟发性脑病(DEACMP)模型大鼠海马神经细胞凋亡及细胞外信号调节蛋白激酶1/2(Erk1/2)、Bcl-2/Bcl-xl相关凋亡蛋白(Bad)的表达,探讨DEACMP可能的发病机制.方法:体质量240～280g雄性SD大鼠48只,随机均衡分为对照组、染毒后1,3,7,14,21d组.分次腹腔注射CO纯品气体制备DEACMP模型,观察大鼠染毒后表现,并动态监测大鼠尾血碳氧血红蛋白(COHB)浓度.取各组大鼠海马组织制备石蜡病理切片,分别采用苏木精-伊红(HE)染色、末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷酸缺口末端标记(TUNEL)法、免疫组织化学法观察海马神经元形态学变化、凋亡细胞数量,及Erk1/2,Bad蛋白的表达.结果:染毒后大鼠昏迷时间较长,COHB长时间(>16h)维持在高水平(>50%);染毒后7～14d海马神经细胞出现明显变性坏死;凋亡细胞数在第7～14d达到高峰(P<0.05);Erk1/2于染毒后1～21d表达水平随时间延长逐渐减低(P<0.05);Bad表达于染毒后1d升高,3d达峰值后逐渐降低,但至21d时表达仍高于正常对照组(P<0.05).结论:CO中毒后Erk1/2表达下调、Bad早期表达上调后又回落,提示Erk1/2、Bad蛋白介导了海马区神经元的凋亡,参与了DEACMP的发生.

肾阳虚大鼠生殖细胞凋亡及Bcl-xl和Bad蛋白的表达

目的:观察实验性肾阳虚大鼠生殖细胞凋亡及Bcl-xl、Bad蛋白表达的变化。方法:12只成年健康雄性SD大鼠随机分成肾阳虚组(n=6)和对照组(n=6)。建立单侧肾阳虚动物模型后,取睾丸,对照组同侧取材。采用原位缺口末端标记法(TUNEL)检测生殖细胞凋亡,免疫组化法检测Bcl-xl、Bad蛋白表达。结果:凋亡细胞主要是初级精母细胞和圆形精子细胞。肾阳虚组生殖细胞凋亡指数高于对照组(P<0.05);肾阳虚组Bcl-xl蛋白表达低于对照组(P<0.05);Bad蛋白表达高于对照组(P<0.05)。结论:实验性肾阳虚大鼠生殖细胞凋亡明显增多,可能与Bcl-xl蛋白表达降低、Bad蛋白表达升高相关。生殖细胞凋亡可能是肾阳虚所致生殖功能障碍的一个重要原因。

九节龙-Ⅲ经BAD凋亡途径诱导胶质瘤U251细胞凋亡

目的研究九节龙-Ⅲ诱导胶质瘤U251细胞凋亡及其内在机制。方法四甲基偶氨唑蓝(MTT)分析药物对U251细胞及胶质细胞增殖的影响;膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)染色、Hoechst33342染色和透射电镜检测细胞凋亡;Western blotting分析Bcl-xL/Bcl-2相关死亡启动子(BAD)蛋白表达和磷酸化水平。结果九节龙-Ⅲ以剂量和时间依赖方式抑制U251细胞活性(P<0.05,IC50=8.2μg/ml),诱导染色质浓聚边集、凋亡小体形成等凋亡改变,且浓度低于40μg/ml时不抑制胶质细胞活性(P>0.05)。Western blotting发现U251凋亡细胞内BAD表达明显增加、去磷酸化并被裂解。结论九节龙-Ⅲ经BAD去磷酸化和裂解的凋亡途径诱导了胶质瘤U251细胞的显著凋亡。

促凋亡基因bad的表达与肝内胆管细胞癌分化的关系

目的 探讨促凋亡基因bad在原发性肝内胆管细胞癌 (ICC)中的表达及其与肿瘤分化程度的关系。方法 采用免疫组织化学DakoEnvision方法 ,对 48例原发性肝内胆管细胞癌 (ICC组 )和 2 5例肝细胞肝癌的癌旁肝组织汇管区胆管上皮组织 (对照组 )中bad基因的表达情况进行检测。结果 bad基因在ICC中的表达阳性率明显高于对照组 (P<0 .0 1) ;在中、低分化的ICC中bad基因的阳性表达水平明显高于高分化的ICC(P<0 .0 5 )。结论 在低分化的胆管细胞癌中bad基因的表达明显增强 ,bad基因的表达与肿瘤的分化程度相关。

实验性隐睾大鼠生殖细胞凋亡及Bcl-xl、Bad蛋白表达检测

目的:检测实验性隐睾大鼠生殖细胞凋亡及Bclxl、Bad蛋白表达的变化。方法:50只成年健康SD雄性大鼠随机分成隐睾组(n=23)和对照组(n=27)。建立单侧隐睾动物模型,术后3d,7d,10d取材隐睾侧睾丸,对照组同侧取材。采用原位缺口末端标记法(TUNEL)检测生殖细胞凋亡,免疫组化法检测Bclxl,Bad蛋白表达。结果:凋亡细胞主要是初级精母细胞和圆形精子细胞。隐睾组生殖细胞凋亡指数术后3d组((5.54±1.93)%)、7d组((7.33±1.61)%)、10d组((9.48±2.96)%)均明显高于对照组((2.26±0.92)%,P<0.01);隐睾组Bclxl蛋白表达术后3d组((67.30±6.11)%)、7d组((54.00±8.75)%)、10d组((35.85±6.55)%)均低于对照组((76.00±6.83)%,P<0.01);Bad蛋白表达术后7d组((46.22±9.30)%)、10d组((41.30±5.81)%)均高于对照组((13.88±3.58)%,P<0.01)。结论:实验性隐睾大鼠生殖细胞凋亡增多,可能与Bclxl蛋白表达降低、Bad蛋白表达升高相关。

全脑缺血再灌注后Bad蛋白的表达与细胞凋亡的关系及ERK信号转导途径对其的影响

目的观察全脑缺血再灌注时Bad蛋白的表达和细胞凋亡及ERK信号转导通路对其的影响。方法 90只健康雄性SD大鼠随机分为三组(n=30):假手术组(sham组)、全脑缺血再灌注组(IR组)、抑制剂PD98059干预组+全脑缺血再灌注组(PD组)。采用四血管法建立大鼠全脑缺血再灌注模型,在2,6,12,24,48,72 h各个时间点分别用免疫组化法检测磷酸化ERK和磷酸化Bad蛋白在大鼠海马区的表达,TUNEL染色观察不同时点海马神经元存活和凋亡的变化。结果 TUNEL阳性细胞于IR组再灌注6 h后开始出现,24-48 h达高峰。PD组TUNEL阳性细胞表达各时点均强于IR组,随再灌注时间延长而表达增强,24 h达高峰。sham组各时点未见TUNEL阳性细胞。磷酸化ERK于IR组再灌注2 h后在CA3区可见表达,再灌注6 h后逐渐下降,至再灌注后48 h未见表达。IR组磷酸化ERK表达强于sham组,sham组随再灌注时间延长而表达减弱;PD组各时点磷酸化ERK未见表达。磷酸化Bad蛋白于IR组再灌注后2 h在CA3区可见表达,之后逐渐减弱,再灌注后24 h后未见;PD组各时点磷酸化Bad表达弱于IR组,变化趋势与IR组相同。sham组各时点磷酸化Bad表达明显,无时点变化;二者在CA1区的表达均弱于CA3区。二者的表达下降变化与凋亡发生的高峰时间一致。结论磷酸化ERK和磷酸化Bad在脑缺血再灌注时表达下降且变化一致,提示ERK信号通路可通过抑制Bad的磷酸化抗凋亡形式向去磷酸化促凋亡形式的转变,发挥抗调亡机制,参与脑缺血再灌注时神经细胞的保护。

Bcl-2和Bad参与GDNF协同雌二醇对多巴胺能神经细胞的保护作用

目的：研究GDNF和雌二醇（E2）联合使用对6-羟基多巴胺（6-OHDA）所致的多巴胺能神经细胞损伤的影响并探讨其作用的机制.方法：新生2～3d的雄性SD大鼠行常规中脑脑片培养,6-OHDA诱导损伤,脑片分为8组：正常对照组、溶剂对照组、E2组、Wortmannin（PI3-K特异性阻断剂）＋E2组、GDNF组、Wortmannin＋GDNF组、GDNF＋E2组、Wortmannin＋GDNF＋E2组.免疫荧光染色观察黑质致密部（SNc）酪氨酸羟化酶（TH）的表达情况;Western Blot检测各组脑片中Bcl-2及Bad的表达.结果：免疫荧光染色结果显示,在GDNF＋E2组,TH的表达比单用GDNF或E2时显著升高,差异有统计学意义（P＜0.05）;阻断PD-K/Akt信号通路后,TH的表达与未阻断组相比降低,差异有统计学意义（P＜0.05）.Western Blot检测结果显示,在GDNF＋ E2组,Bcl-2的表达比单用GDNF或E2时升高,而Bad的表达比单用GDNF或E2时降低,差异均有统计学意义（P＜0.05）;阻断PI3-K/Akt信号通路后,Bcl-2的表达与未阻断组相比降低,而Bad的表达是升高的,差异有统计学意义（P＜0.05）.结论：GDNF和E2联合使用对6-OHDA所致的黑质多巴胺能神经细胞损伤有保护作用,其机制可能是通过调节凋亡相关蛋白Bcl-2和Bad的表达变化实现的.