DC-SIGN真核表达载体的构建及其稳定转染BHK21细胞系的建立

目的构建DC-SIGN分子真核表达载体,获得可稳定表达DC-SIGN分子的BHK21细胞系。方法以pUNO-hDC-SIGN1Aa质粒为模板,通过PCR方法扩增人DC-SIGN基因,经过NotI和BamHI双酶切之后,将其克隆入真核表达载体pIRES-neo,构建真核表达载体pIRES-neo-DC-SIGN,以NotI和BamHI双酶切以及测序验证重组质粒的正确性。将重组质粒以Lipo-fectamineTM2000转染到BHK21细胞,通过G418及有限稀释法进行阳性克隆的筛选,建立稳定表达DC-SIGN分子的BHK21细胞系,利用流式细胞仪、Western blotting及免疫荧光法检测DC-SIGN分子的表达。结果双酶切鉴定证明DC-SIGN基因已经成功克隆入真核表达载体pIRES-neo中,测序结果表明DC-SIGN基因与原序列一致。pIRES-neo-DC-SIGN转染BHK21细胞后,获得了稳定表达DC-SIGN分子的细胞系。流式细胞仪检测结果显示,阳性克隆中DC-SIGN分子的表达率为85.42%。免疫荧光结果显示,DC-SIGN分子主要表达于细胞膜表面。Western blotting能检测到DC-SIGN蛋白表达的特异条带。结论成功构建了稳定、高效表达DC-SIGN分子的BHK21细胞系,为后续DC靶向性疫苗研究奠定了基础。

尿激酶原基因cDNA在BHK21细胞中的表达

将人尿激酶原（Ｐｒｏ－ＵＫ）基因ｃＤＮＡ分别插入到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子和ｐＳＶ２－ｎｅｏ的ＳＶ４０启动子下游，构建了重组表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ＵＫ和ｐＳＶ２－ＵＫ，分别将这两种表达质粒以脂质体载体法转染ＢＨＫ２１细胞。ＥＬＩＳＡ检测结果表明，ｐｃＤＮＡ３－ＵＫ和ｐＳＶ２－ＵＫ在哺乳动物细胞中能够表达，７２ｈ表达量分别为２８．７ｎｇ／ｍｌ和１３．５ｎｇ／ｍｌ。

BHK21细胞的悬浮驯化及其悬浮培养参数研究

[目的]探讨各种悬浮培养条件对BHK-21细胞悬浮培养的影响,尤其是细胞生长过程中出现的细胞结团现象对细胞生长状态的影响,从而摸索出稳定的培养条件。[方法]将BHK-21细胞株进行悬浮驯化培养,通过对悬浮培养的培养液、pH、溶解氧、罐压、搅拌等各种细胞相关生长条件进行研究。[结果]细胞的结团严重影响了细胞的生长代谢。最佳培养条件为最佳接种浓度0.2×106个/ml,牛血清的最佳含量为5%,BHK21细胞培养液理想pH为7.0~7.2,采用2孔通气的100 r/min有利于BHK21细胞的生长。[结论]为体外规模化细胞培养平台奠定理论基础。

羊口疮病毒F1L蛋白对山羊痘病毒黏附BHK21细胞的影响

以提取羊口疮痂皮中病毒的DNA为模板,用PCR扩增羊口疮病毒(ORFV)的059基因序列,并进行基因克隆、测序鉴定和生物信息学分析;优化合成059基因编码序列,连接载体pET42a(+),转化Escherichia coli BL21(DE3);用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导阳性克隆菌,采用免疫印迹检测表达的F1L蛋白,并以His柱纯化蛋白、梯度法复性及Bradford法测定蛋白浓度;将BHK21细胞铺于12孔板中培养至单层,分别作F1L蛋白、山羊痘病毒(GTPV)、先蛋白后病毒、蛋白和病毒混液4种方式孵育,利用荧光定量PCR测定孵育至1.0、6.0 h的细胞黏附GTPV的量,研究ORFV F1L蛋白对GTPV黏附BHK21细胞的影响。结果表明:成功获得了ORFV重庆石柱分离株(ORFV–CQsz)的059基因编码序列,其编码的F1L蛋白包含1个结合细胞表面硫酸乙酰肝素受体的结构域,显示出肝素结合活性;该蛋白羧基端有2个跨膜区,不利于蛋白质的表达,但优化DNA序列构建的重组质粒菌,经IPTG诱导后获得对F1L蛋白的高效表达;免疫印迹显示F1L蛋白对ORFV抗体有较好的反应原性;Bradford法测定的纯化复性的F1L蛋白质量浓度为1.06 mg/mL;荧光定量PCR检测数据显示,不同孵育处理下GTPV黏附细胞的拷贝数不同,表明F1L蛋白对GTPV黏附BHK21细胞呈现一定的干扰作用,能降低病毒黏附到细胞的拷贝数。

组织型纤溶酶原激活剂cDNA在BHK21细胞中的表达

将组织型纤溶酶原激活剂（ｔ－ＰＡ）基因ｃＤＮＡ经多次亚克隆插入到真核表达载体ｐＳＶＬ的ＳＶ４０启动子和ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子下游，构建了重组表达质粒ｐＳＶＬ－ｔＰＡ和ｐｃＤＮＡ３－ｔＰＡ。分别将这２种表达质粒以脂质体载体法转染ＢＨＫ２１细胞，ＥＬＩＳＡ检测结果表明，ｐＳＶＬ－ｔＰＡ和ｐｃＤＮＡ３－ｔＰＡ在哺乳动物细胞中能够表达，７２ｈ表达量分别是５２．８μｇ／Ｌ和７０．４μｇ／Ｌ。

抑制BHK21细胞STYK1/NOK基因的转录组分析

目的转录组分析抑制丝氨酸-苏氨酸-酪氨酸激酶1(STYK1/NOK)后仓鼠肾正常细胞BHK21的基因表达,并分析其可能作用的信号通路.方法BHK21细胞分为空载体组(转染6μg空载体pBs/U6)、低转染浓度组(2μg si-STYK1/NOK质粒+4μg空载体pBs/U6)和高转染浓度组(6μg si-STYK1/NOK质粒).转染48 h后,Western blot检测STYK1/NOK蛋白表达,基于检测结果,选取空载体组和高转染浓度组提取总RNA进行转录组测序.将测序所得的序列进行过滤比对,获得差异表达基因后,应用R软件进行生物功能(GO)分析和KEGG信号通路分析.应用STRING蛋白质互作数据库中的互作关系进行差异基因蛋白互作网络的分析.采用qRT-PCR验证关键差异表达基因亚甲基四氢叶酸脱氢酶2(Mthfd2)、转录激活因子5(Atf5),ⅡA分泌型磷脂酶A2(Pla2g2a)、6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-双磷酸酶3(Pfkfb3)的表达.CCK-8法检测空载体组和高转染浓度组细胞增殖情况.结果Western blot结果表明高转染浓度组明显抑制STYK1/NOK蛋白表达.高转染浓度组与空载体组相比,共发现差异表达基因44个,包括19个上调基因和25个下调基因.GO富集分析发现差异表达基因主要影响生物调控、细胞进程、代谢调控、细胞生物过程、细胞、细胞部分、胞外区、配体和催化活性.KEGG通路分析发现差异表达基因主要集中作用于免疫系统、癌症、细胞周期、信号转导和氨基酸代谢等方面.qRT-PCR结果表明,高转染浓度组Mthfd2、Atf5的相对表达量显著上调(P<0.05),Pfkfb3、Pla2g2a的相对表达量显著下调(P<0.05),与测序结果相一致.细胞增殖实验表明高转染浓度组细胞增殖明显高于空载体组(P<0.01).结论抑制BHK21细胞STYK1/NOK表达后,致使BHK21细胞原癌基因表达增强,抑癌基因表达减少,促进细胞增殖.

不同牛血清促悬浮培养BHK21细胞生长的作用

[目的]验证成年牛血清在细胞培养过程中对细胞的促生长作用。[方法]分别以商品胎牛血清、新生牛血清、处理的成年牛血清进行悬浮培养BHK21细胞,通过细胞密度、细胞活力等指标来检测各血清对细胞的促生长作用。[结果]3种血清对细胞的促生长作用差异不明显,都具有良好的促细胞生长作用。[结论]处理的成年牛血清具有良好的促细胞生长作用,与胎牛血清、新生牛血清促细胞生长作用差异不明显。

BHK21细胞冻存密度与复苏后活力的关系分析

对BHK21细胞不同的冻存密度与细胞复苏后活力的关系进行了统计分析。首先取处于对数生长期的细胞,以4种不同的密度进行冻存,这4种密度分布在0.5×107～4.0×107个/mL之间。冻存2周后,每种密度各复苏3支,计算其活力,分析密度与活力之间是否存在相关性。如此,平行做2次。结果发现,不同的细胞冻存密度与细胞复苏后的活力之间有相关性。

稳定表达SLAM受体的Vero和BHK21细胞系的建立及其对犬瘟热病毒分离效果的比较

旨在构建稳定表达SLAM受体的SLAM-Vero细胞系和SLAM-BHK21细胞系,并比较其对犬瘟热病毒(CDV)野毒株的敏感性,为CDV野毒株的快速分离与研究提供一种有效的工具。将真核表达载体Pcag-SLAM分别转染Vero细胞和BHK21细胞。经G418压力筛选结合有限稀释法筛选阳性克隆株,并通过RT-PCR、间接免疫荧光鉴定(IFA)和Western blot等方法对稳定表达SLAM受体的SLAM-Vero细胞系和SLAM-BHK21细胞系加以验证。应用这两种细胞系对3例临床犬瘟热病例的5种不同组织进行病毒分离,对分离得到的CDV进行RT-PCR及IFA鉴定。结果显示,经RT-PCR和Western blot验证,本研究成功构建出SLAM-Vero细胞系和SLAM-BHK21细胞系,SLAM-Vero细胞接种病毒12~24h即可出现典型的CDV导致的细胞融合体CPE,利用SLAM-Vero细胞从3只CDV阳性犬的肺和脾中分离得到2株CDV,而SLAM-BHK21细胞、亲本Vero细胞及亲本BHK21细胞未能分离出病毒。研究表明,与SLAM-BHK21细胞相比,SLAM-Vero细胞对CDV的分离率较高,并能产生明显的CPE。在分离CDV野毒株时,选择肺和脾更容易在SLAM-Vero细胞系上分离出病毒。

BHK21细胞在新型微载体培养系统生长条件优化

目的:使用BelloCell-500AP生物反应器和BioNOC-II微载体,对BHK21细胞在此新型高密度培养生物反应器中的生长特性进行研究。方法:首先将1.5×108个BHK21细胞悬液加入含有微载体的生物反应器内,按生物反应器厂家推荐参数进行培养,每天取载体计数观察BHK21的生长特性。然后调整细胞浓度和微载体培养系统运行参数。结果:BHK21细胞经过6 d培养载体中细胞总数达到峰值,细胞密度是起始接入数量的31倍为4.41×109个;经过培养过程参数优化,确定适于BHK21细胞高密度培养参数。试验成功实现了BHK21细胞的高密度培养,为以BHK21细胞为生产基质的病毒疫苗生产提供了一条简便快捷的途径。

介绍一种用于BHK21细胞的改良培养基

我们在培养 BHK21细胞的过程中,采用一种改良培养基(以下简称 HLE 培养基),经在87批1902瓶细胞(15立升园瓶)中的使用情况表明,用该培养基培养的 BHK21细胞,细胞成功率高,生长情况良好,能满足疫苗对细胞质量的要求,接毒后的病变。

冷藏保存BHK21细胞悬液及复苏试验

采用方瓶存放BHK21细胞悬液，在2℃～8℃冰箱存放不同时间后，按常规方法进行细胞复苏和传代。对比存放不同时间后细胞复苏时的驯化次数、细胞数量和细胞活力，寻求最佳存放时间和复苏代次以指导生产。同时将2℃～8℃冷藏保存方法与液氮冻存细胞方法在细胞复苏周期和达到所需扩繁细胞数方面进行比较。结果表明，方瓶冷藏保存BHK21细胞悬液最长可存放60d，经2—5代驯化后，细胞形态和活力恢复正常，细胞数量与收悬液前细胞数量无显著差异，并能稳定传20代以上。与液氮冻存细胞方法相比，该方法在快速恢复细胞产量时有较大优势，在生产周期紧张的情况下可作为辅助方法保障细胞传代的延续。

冷冻密度和复苏温度对BHK21细胞活力的影响

就细胞的冷冻密度和复苏温度对细胞活力的影响做了分析。取处于对数生长期的细胞以0．5×107～4．0×107／mL之间的4个细胞密度分别进行冷冻，2周之后复苏细胞，检验其复苏活力；又分别在37℃、38℃和39℃的水温复苏同一批细胞，复苏后检验细胞的活力。结果表明，随着冷冻密度的升高，复苏活力逐渐下降；在38℃水温复苏细胞的平均活力比在37℃和39℃水温复苏细胞的平均活力高，而且稳定。因此，细胞的冷冻密度和复苏活力之间存在显著负相关性，38℃的水温更适于复苏细胞。

单一血清和混合血清培养BHK21细胞的比较研究

本试验用单一血清和混合血清对幼年叙利亚地鼠肾（BHK21）细胞进行了培养，显微镜观察细胞的生长状况，并用细胞计数仪对相应的细胞进行计数及活力测定。结果表明，在同一时间含有5％的4种混合血清的低血清培养基培养的BHK21细胞比同一浓度的任何一种单一血清培养的细胞形态更好，细胞活力更高。

低血清培养的BHK21细胞染色体遗传稳定性分析

目的：分析1种商业化的低血清培养基适应BHK21细胞进行传代培养,该细胞染色体的变异稳定性,以判定其质量。方法：采用直接法制取4个代次的BHK21细胞的染色体标本,用常规Giemsa染色,1 000倍光学显微镜下计数中期分裂相染色体数目,求出染色体变异率（%）,并进行核型分析。结果：BHK21为亚二倍体或亚四倍体细胞系,亚二倍体众数为42,亚四倍体细胞众数为72~74,该细胞系染色体的畸变率在各代次所占的比例为0~2%,均较低。结论：用商业化的低血清培养基驯化培养BHK21细胞,逐渐降低培养液中血清含量,进行传代培养,通过选取不同代次细胞的染色体进行核型分析,该细胞系的遗传学特性相对稳定,各代次间无本质差异,可候选为制苗用细胞。

管道化培养与常规转瓶培养BHK21细胞的比较与分析

本试验在常规转瓶培养BHK21细胞的基础上,推出管道化培养BHK21细胞,旨在控制污染,提升产品质量。通过此工艺的革新,在降低细胞污染率和淘汰率、提高产品质量、提高工作效率和产能、降低劳动强度等方面均起到了很大的作用。给大规模动物细胞培养提供了可靠的保障。

BHK_(21)细胞对蚀斑法检测乙型脑炎减毒活疫苗结果的影响分析

目的分析BHK_(21)细胞对蚀斑法检测乙型脑炎减毒活疫苗系统的影响,降低检测系统误差。方法比较BHK_(21)细胞以不同频次传代培养时的细胞生长状态,以及以不同接种浓度进行疫苗病毒滴度检测时,对检测系统稳定性的影响。结果 BHK_(21)细胞培养4 d传代,其形态良好、边缘光滑、胞质透光性好、细胞分散均匀、细胞活率达到95%以上;BHK_(21)以105细胞/m L浓度接种时,乙型脑炎减毒活疫苗及其病毒滴度参考品的变异系数最小,分别为0.66%和0.64%。结论 BHK_(21)细胞培养4 d传代、以105个/m L浓度接种时用蚀斑法检测病毒滴度系统最稳定,可供乙型脑炎减毒活疫苗滴度检测参考。

风疹病毒分离株在BHK_（21）细胞中的形态与形态发生

利用超薄切片电子显微镜技术对本室分离的风疹病病毒（ＲＶ）ＪＲ＿（２３）株在ＢＨＫ＿（２１），细胞中的形态及形态发生过程进行了研究，同时与ＲＶ标准野毒株Ｇｏｓ－１０作了比较。结果表明，ＲＶＪＲ＿（２３）株感染ＢＨＫ＿（２１），细胞后６ｈ开始于细胞浆内观察到病毒颗粒，９６ｈ达到高峰。病毒颗粒呈图形，有双层脂质包膜包绕，直径４５～７５ｎｍ，核衣壳２５～３５ｎｍ。细胞浆内见到大量病毒相关颗粒，直径２０～３０ｎｍ。病毒包膜来自于细胞浆中的空泡膜或细胞膜。被ＲＶ感染的细胞浆中还观察到“繁殖复合体”，由膜性结构包绕着许多类似病毒颗粒的囊泡构成。丙株ＲＶ在形态与形态发生方面未发现差异。