EBV-BHRF1基因阳性与阴性细胞株对3种诱导凋亡因素抵抗性差异的研究

目的观察ＥＢＶ┐ＢＨＲＦ１基因阳性（ＳＵＮＥ┐１、Ｒａｊｉ和Ｂ９５┐８）与阴性（Ｋ５６２、ＹＡＣ）细胞株对３种诱导细胞凋亡（ａｐｏｐ┐ｔｏｓｉｓ）因素（无血清培养４８小时，４３℃作用１０分钟或２×１０－６ｍｏｌ／Ｌ地塞米松作用２４小时）的抵抗力差异。方法ＰＣＲ扩增ＥＢＶ┐ＢＨＲＦ１基因片段诱导后经电镜及电泳ＤＮＡ检测细胞凋亡。结果分别从Ｂ９５┐８、Ｒａｊｉ及人低分化鼻咽癌细胞株（ＳＵＮＥ┐１）ＤＮＡ中扩增出ＥＢ病毒的ＢＨＲＦ１全基因片段，而Ｋ５６２、ＹＡＣ细胞株则不含该基因片段。分别经上述３种方法处理后，前３种细胞株的形态及ＤＮＡ电泳行为未发生明显改变，而后２种细胞株则出现典型的细胞凋亡特征，即细胞核凝缩，细胞膜及细胞器基本保持完整；ＤＮＡ电泳出现梯形（Ｌａｄｄｅｒ）条带。

BHRF1基因表达对CNE2细胞生长的影响

目的：观察ＥＢ病毒基因ＢＨＲＦ１的表达对鼻咽癌细胞生存能力的影响。方法：通过构建携有ＢＨＲＦ１的高表达载体，并转染低分化鼻咽癌细胞株ＣＮＥ２细胞。检测转染后癌细胞周期各时相分布的改变和在缺乏营养条件下的生长情况。结果：ＢＨＲＦ１的表达能使Ｇ１期细胞百分比升高，Ｓ期细胞百分比下降，癌细胞在缺血清条件下生存时间延长。结论：ＢＨＲＦ１的表达能促使鼻咽癌细胞周期的重新分布。

ShRNA靶向干扰BHRF1基因抑制鼻咽癌细胞增殖

目的针对ShRNA靶向干扰BHRF1基因抑制鼻咽癌细胞增殖以分析癌症靶向治疗的前景。方法通过基因测序法鉴定所构建的siRNA表达载体。用四唑盐比色(MTT)法、流式细胞术评价转染siRNA后对鼻咽癌细胞增殖、凋亡的影响。结果与NC-shRNA组相比,BHRF1-shRNA组细胞凋亡增加,凋亡率为(31.51±1.59)%。结论由慢病毒载体介导的shRNA表达载体进入细胞后,可以有效下调BHRF1基因表达水平,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。

地塞米松对SUNE-1和B_(95-8)细胞株中EB病毒BHRF1基因转录水平的影响

目的：以Ｋ５６２细胞为阴性对照，观察ＳＵＮＥ－１和Ｂ９５８两种含ＥＢＶ－ＢＨＲＦ１基因的肿瘤细胞株在２×１０６ｍｏｌ／Ｌ地塞米松（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，ＤＥＸ）作用１８ｈ后，细胞内ＥＢＶ－ＢＨＲＦ１基因转录水平的改变。方法：细胞ＲＮＡ的提取、ＲＮＡ的点杂交（Ｄｏｔｂｌｏｔ）及反转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）。结果：上述两种肿瘤细胞在２×１０６ｍｏｌ／Ｌ地塞米松作用１８ｈ等诱导细胞凋亡的条件下，细胞内ＥＢＶ－ＢＨＲＦ１基因的转录水平（ｍＲＮＡ）明显提高。结论：本结果初步显示ＥＢＶ－ＢＨＲＦ１基因的转录与宿主细胞抵抗凋亡的关系密切。

BHRF1基因与绿色荧光蛋白融合基因慢病毒载体的构建

目的构建BHRF1基因与绿色荧光蛋白融合基因慢病毒表达载体及获得稳定表达BHRF1的慢病毒的方法。方法通过实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法从鼻咽癌组织中扩增获得BHRF1的基因全长CDS序列,并克隆于带GFP荧光报告基因慢病毒表达载体中,酶切验证测序正确后,将质粒pWPXL-hBHRF1-IR ES-GFP与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,将浓缩纯化后的病毒上清感染293T细胞,荧光显微镜观察下293T细胞的绿色荧光表达及转染效率。结果电泳鉴定与目的基因表达条带完全吻合,测序结果显示扩增得到的BHRF1序列与GenBank公布的参考序列完全一致,双酶切和测序结果证明BHRF1已正确地克隆到慢病毒表达载体中,包装后慢病毒颗粒可高效转染293T细胞,荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光表达,转染效率>90%。结论成功构建了BHRF1与GFP融合基因慢病毒表达载体,为进一步研究BHRF1基因的相关功能提供了适合的稳定转染载体。

EB病毒BHRF1基因及其抑制细胞凋亡功能

BHRF1是EBV基因组中具有抑制细胞凋亡功能的基因片段，属Bcl-2基因家族，本文阐述了BHRFI基因及其蛋白产物的特征、表达和抑制凋亡功能，对其在EB病毒致病机理的认识及有关疾病的防治等方面的重大意义进行了分析。

EB病毒BHRF1基因表达对鼻咽癌细胞增殖周期影响的研究

目的：了解ＥＢ病毒编码ＢＨＲＦ１基因表达对鼻咽癌细胞增殖周期的影响。方法：本研究通过构建ＢＨＲＦ１高表达载体并将其转入鼻咽癌细胞株ＣＮＥ２细胞中，检测转染后稳定表达ＢＨＲＦ１癌细胞的增殖细胞核抗原（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇｃｅｌｎｕｃｌｅａｒａｎｔｉｇｅｎ，ＰＣＮＡ）表达和喜树碱作用前后细胞周期分布的改变。结果：ＢＨＲＦ１的表达可促使癌细胞的ＰＣＮＡ表达下降，Ｇ１期细胞增多，Ｓ期细胞减少；而在喜树碱作用后，ＢＨＲＦ１－ＣＮＥ２细胞的凋亡率明显小于对照组，其Ｇ１期细胞数下降，Ｓ期细胞数升高。结论：ＢＨＲＦ１基因的表达可通过调节细胞周期分布、抑制细胞凋亡的发生以增强细胞的生存能力。

BHRF1基因对丝裂霉素诱导胃癌细胞SGC7901凋亡影响

目的探讨EB病毒早期基因BHRF1的表达对丝裂霉素诱发胃癌细胞SGC7901凋亡的影响。方法构建pcDNA3.1-BHRF1表达载体,应用脂质体转染法将BHRF1表达载体转染胃癌细胞系SGC7901,MTT法检测细胞生长情况。实验分为细胞对照组、空载体对照组和目的基因转染组,细胞对照组仅接种SGC7901细胞,空载体对照组将pcDNA3.1空载体转染入SGC7901细胞中,目的基因转染组将重组质粒pcDNA3.1-BHRF1转染入SGC7901细胞中。分别培养24、48和72 h后,用浓度为30 mg/L的丝裂霉素处理,流式细胞术检测细胞凋亡率,Hoechst33258荧光染色方法检测凋亡小体。结果 pcDNA3.1-BHRF1重组质粒构建成功。MTT实验显示目的基因转染能明显拮抗由于丝裂霉素作用导致的细胞生长抑制;BHRF1转染+丝裂霉素处理组凋亡小体明显少于对照组,细胞凋亡率明显低于对照组,差异均有统计学意义(F=6 250.510,q=56.992、51.613,P<0.01)。结论 BHRF1基因具有明显拮抗丝裂霉素诱导胃癌SGC7901细胞凋亡的作用。

EB病毒BHRF 1基因表达对鼻咽癌细胞周期分布影响的研究

ＥＢ病毒感染与鼻咽癌的发生和发展明显相关。近来研究发现，ＥＢ病毒编码基因的表达与病毒介导的细胞转化与恶变有关。ＢＨＲＦ１为ＥＢ病毒编码的一个早期基因，其与原癌基因Ｂｃｌ－２具有部分相同的序列和共同的超微结构定位，提示其具有相似的功能和机理，即有抑制细...

EB病毒BHRF1基因的克隆及其表达产物抑制细胞凋亡的研究

目的ＥＢ病毒ＢＨＲＦ１基因克隆，其表达产物抑制ＣＨＯ细胞凋亡功能的研究。方法以Ｂ９５－８细胞株ＥＢＶＤＮＡ为模板设计一对引物，采用ＰＣＲ技术扩增ＢＨＲＦ１基因，用目的基因内的两个单酶切点ＢａｍＨⅠ、ＢｇｌⅠ进行酶切鉴定。用引物上所引入的两个酶切位点ＮｃｏⅠ、ＳｃｌⅠ酶切目的基因后定向连接到ｐＢＶ２２１载体上，转入宿主菌ＤＨ５α经质粒抽提，单、双酶切鉴定，从所获克隆中筛选重组质粒克隆。温控诱导目的基因表达，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及凝胶薄层扫描分析。采用缺血清培养方法建立ＣＨＯ细胞凋亡模型。结果所得扩增产物长５９２ｂｐ与预期大小一致；筛选出的９个重组质粒克隆经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和扫描表明重组蛋白表达量占菌体蛋白总量的２．５％。将含重组蛋白的菌体蛋白加入缺血清培养体系，通过与空白菌体蛋白对照表明，重组蛋白具有明显的抑制ＣＨＯ细胞凋亡的能力。结论ＢＨＲＦ１蛋白具有有效控制血清缺乏所诱导的ＣＨＯ细胞凋亡功能，这为ＢＨＲＦ１蛋白的广泛应用提供了依据。

EB病毒BHRF1基因抗辐射作用的研究

为了解EB病毒编码基因BHRF1的表达对鼻咽癌细胞抵抗放射线损伤能力的改变，构建携有BHRF1的高表达载体，并转染鼻咽癌细胞株CNE2细胞，观察转染前后的癌细胞在放射线照射后于裸鼠体内成瘤能力改变的情况。结果发现，在放射线照射前，BHRF1表达细胞在裸鼠体内形成肿瘤时间较晚，肿瘤重量较轻（P＜0．01）；而经放射线照射后，BHRF1表达细胞在裸鼠体内的成瘤能力强于对照组（P＜0．01），经原位末端标记检查发现其凋亡指数小于对照组（P＜0．01）。提示BHRF1的表达能通过阻止细胞的凋亡，增强鼻咽癌细胞抵抗放射线对其DNA的损伤作用。

鼻咽癌细胞EB病毒编码BHRF1基因的研究

利用斑点杂交技术检测正常鼻咽青草 咽未分化癌、低分化及高分化鳞癌中ＥＢ病毒编码ＢＨＲＦ１基因的存在情况。结果表明，鼻咽未分化癌及低分化鳞癌中的ＢＨＲＦ１阳性率分别为９０％和８５．７％，而高分化鼻咽癌组织的阳性率为２５％。提示ＢＨＲＦ１基因可能与因癌细胞的分化有关。

EB病毒BHRF_1基因聚合酶链反应扩增及其鉴定

目的：ＢＨＲＦ１的研究对于认识ＥＢＶ有关肿瘤和其它疾病的发病机理、寻找预防、治疗途径有十分重要的意义。方法：以Ｂ９５８细胞ＤＮＡ为模板，设计一对引物，用ＰＣＲ方法扩增ＢＨＲＦ１基因，用目的基因内的两个限制性内切酶位点进行酶切鉴定。结果：扩增产物长５９２ｂｐ，与预期结果一致，两个酶所切下的四个片段长度也与理想值相符。结论：本研究首次采用ＰＣＲ方法，成功地获得完整的ＥＢ病毒ＢＨＲＦ１基因，从而为该基因的进一步研究和应用奠定基础。

EB病毒早期基因BHRF1转基因模型鼠的建立

目的构建稳定表达EB病毒早期基因BHRF1蛋白的重组载体,通过显微注射法建立BHRF1转基因鼠模型。方法自EBV阳性细胞系B95-8提取总RNA,应用RT-PCR扩增BHRF1基因,然后与pcDNA3.1(+)连接,构建pcDNA3.1-BHRF1重组载体。重组载体用NruⅠ和DraⅢ双酶切,电泳后纯化回收长约2000 bp的目的片段溶于显微注射缓冲液。从超排小鼠取健康受精卵,通过显微注射技术,将纯化的CMV+BHRF1+polyA DNA片段注射入小鼠受精卵,短暂培养后选择健康受精卵移入假孕母鼠输卵管内。采用PCR检测子鼠鼠尾组织DNA,鉴定筛选BHRF1阳性首建鼠。结果经PCR、限制性内切酶鉴定及测序证实pcDNA3.1-BHRF1重组载体构建成功,DraⅢ和NruⅠ双酶切获得长约2 000 bp的CMV+BHRF1+polyA DNA片段。自18只见栓超排小鼠获取健康受精卵480枚,分别注入纯化的目的片段,经短暂培养后390枚受精卵仍健康,移入14只假孕母鼠输卵管内,11只受孕,产下74只子鼠。PCR检测子鼠鼠尾DNA获得16只阳性首建鼠,阳性率为21.6%(16/74)。结论本实验首次建立了BHRF1转基因鼠模型,为深入研究BHRF1的生物学特性及其在EBV相关肿瘤发生发展中的作用提供了理想的动物模型。

EB病毒早期基因BHRF1转基因小鼠纯合子建立及建系

目的构建整合有EB病毒(EBV)早期基因BamHI-H右向读码框1(BHRF1)基因纯合子转基因小鼠。方法通过显微注射技术构建BHRF1阳性首建鼠F0共16只,将转基因小鼠与正常小鼠交配,得到子代F1小鼠,PCR技术检测子鼠鼠尾组织DNA,鉴定筛选BHRF1阳性鼠。阳性鼠再与同系阴性鼠杂交得到F2小鼠,筛选出F2小鼠中的阳性鼠近交得F3小鼠。筛选出F3小鼠中的纯阳性鼠进行近交,得到纯阳性F4小鼠。F4小鼠再近交得到纯阳性F5小鼠。结果经PCR及测序证实,F4、F5小鼠均为BHRF1阳性鼠,测序结果经blast比对,与BHRF1基因完全相同。结论本实验首次建立了BHRF1转基因鼠模型,并成功筛选出纯阳性BHRF1转基因小鼠,为深入研究BHRF1的生物学特性及其在EBV相关肿瘤发生发展中的作用提供了理想的动物模型。

BHRF1反义寡核苷酸对BHRF1-CNE2细胞生存能力的影响

目的：探讨ＢＨＲＦ１ 反义寡核苷酸对表达ＢＨＲＦ１ 的鼻咽癌细胞株ＣＮＥ２ 生存能力的影响。方法：检测反义阻断ＢＨＲＦ１ 表达后ＢＨＲＦ１－ＣＮＥ２细胞在喜树碱作用下增殖能力和凋亡指数的变化。结果：在喜树碱作用下，应用ＢＨＲＦ１ 反义寡核苷酸组的癌细胞较对照组的增殖率下降，凋亡率增高。结论：反义阻断ＢＨＲＦ１的表达可降低ＣＮＥ２细胞的生存能力。

BHRF1表达对^(60)Co照射后CNE2细胞周期分布的影响

目的：了解ＢＨＲＦ１基因表达对６０Ｃｏ照射后ＣＮＥ２细胞周期分布的影响。方法：构建ＢＨＲＦ１高表达载体并转入ＣＮＥ２细胞中，通过检测癌细胞增殖细胞核抗原（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇｃｅｌｎｕｃｌｅａｒａｎｔｉｇｅｎ，ＰＣＮＡ）表达和在６０Ｃｏ照射后不同时期细胞周期分布的改变。结果：ＢＨＲＦ１可抑制细胞ＰＣＮＡ的表达及降低Ｓ期的百分率；经６０Ｃｏ照射后，ＢＨＲＦ１ＣＮＥ２细胞的凋亡率较低（Ｐ＜００１），Ｓ期细胞数下降不明显（Ｐ＞００５）；在辐射后的２４小时到７２小时，其Ｓ期和Ｇ２期细胞百分率先后升高。结论：ＢＨＲＦ１基因的表达可抑制细胞的增殖并增强其抵抗辐射诱发的细胞凋亡的发生。

BHRF1表达对鼻咽癌细胞抗凋亡能力的影响

目的了解ＥＢ病毒（ＥｐｓｔｅｉｎＢａｒｖｉｒｕｓ）基因ＢＨＲＦ１（ＢａｍＨＩＨｒｉｇｈｔｗａｒｄｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅＩ）表达对鼻咽癌细胞抗凋亡能力的影响。方法构建表达ＢＨＲＦ１重组载体并转入鼻咽癌细胞株ＣＮＥ２细胞中，以检测癌细胞在６０Ｃｏ照射后生物学行为的改变。结果ＢＨＲＦ１表达可抑制增殖细胞核抗原的表达，促使癌细胞的细胞周期重新分布，癌细胞对辐射的敏感性下降，生存能力增强。结论ＢＨＲＦ１的表达可增强ＣＮＥ２细胞抵抗放射线诱发细胞凋亡的能力。