miR-210促进小鼠BMMSCs血管内皮生长因子的表达和分泌

目的通过体内与体外的手段验证miR-210能够有效的促进骨髓间充质干细胞(BMMSCs)血管内皮生长因子(VEGF)的表达和分泌。方法构建慢病毒载体,分别转染BMMSCs和人脐静脉内皮细胞(HUVEC),Lenti-miR-210/BMMSCs和Lenti-Lac Z/BMMSCs培养第7天RT-PCR法检测VEGF表达,第14天Western blot法检测VEGF表达,PKH26荧光染色Lenti-miR-210/HUVEC和Lenti-Lac Z/HUVEC,Matrigel成管实验24 h,荧光显微镜观察成管效果;agomir-210和agomir-NC分别与BMMSCs复合Hy Stem-HP凝胶缓释系统裸鼠皮下注射7 d后取标本CD31免疫荧光染色。结果miR-210慢病毒载体转染BMMSCs,第7天RT-PCR和第14天Western blot法检测VEGF表达,明显高于Lenti-Lac Z/BMMSCs(P<0.05);Matrigel成管实验24 h结果显示:LentimiR-210/HUVEC组与Lenti-Lac Z/HUVEC组相比,端端接触明显且管状结构完整;agomir-210和agomir-NC与BMMSCs复合Hy Stem-HP凝胶缓释系统裸鼠皮下注射7 d后标本CD31免疫荧光染色结果:agomir-210组CD31阳性细胞含量明显高于agomir-NC组。结论通过体内与体外的检测,miR-210过表达能够有效促进BMMSCs血管内皮生长因子的表达和分泌。

细胞膜电位对大鼠BMMSCs基本生物学行为影响的研究

目的:探索BMMSCs膜电位对其基本生物学行为的影响及机制。方法:采用全骨髓贴壁法分离培养BMMSCs,采用电压敏感性染料DiSBAC分析细胞分化中的电位变化;分别使用乌本苷、二氮嗪诱导细胞发生去极化或超极化,采用划痕试验、CCK8、茜素红染色等手段检测细胞迁移、增殖和成骨分化能力等变化;采用Fluo-8 AM试剂盒检测胞浆钙离子浓度变化。结果:在增殖阶段BMMSCs膜电位变化不显著,而一旦换成成骨诱导液后跨膜电位急剧增加;当诱导BMMSCs发生去极化后其迁移、增殖能力显著增强,而成骨分化能力显著抑制,超极化处理后表现与之相反;发生去极化时胞浆钙离子浓度上调,超极化后钙离子浓度则显著下降。结论:BMMSCs膜电位与细胞行为密切相关。

GLIS家族锌指蛋白2(GLIS2)负调控Wnt/β-catenin通路抑制人骨髓间充质干细胞的成骨分化

目的探究人类基因GLIS家族锌指蛋白2(GLIS2)对Wnt/β联蛋白(β-catenin)通路调控作用,及对人骨髓间充质干细胞(BMMSC)分化的影响。方法培养人BMMSC,随机分为空白组、成骨诱导组、腺病毒GLIS2基因过表达(ad-GLIS2)组、ad-GLIS2阴性对照、GLIS2基因敲低(si-GLIS2)组、si-GLIS2阴性对照(si-NC)组。反转录PCR检测GLIS2 mRNA表达判定转染情况,对硝基苯磷酸苯二钠(PNPP)法检测碱性磷酸酶(ALP)活性、茜素红染色法检测钙化结节形成判定其成骨特性;T细胞因子/淋巴增强因子(TCF/LEF)报告试剂盒检测细胞内Wnt/β-catenin通路激活情况;Western blot法检测GLIS2、Runt相关转录因子2(Runx2)、骨桥蛋白(OPN)、成骨细胞特异性转录因子(osterix)表达。谷胱甘肽巯基转移酶沉降(GST-pulldown)实验验证GLIS2与β-catenin二者相互作用关系。结果与空白组相比,成骨诱导组BMMSC的ALP活性及钙化结节形成增强,Wnt/β-catenin通路活性及成骨分化相关蛋白表达升高,成骨形成能力增强,GLIS2表达降低。上调GLIS2表达后,抑制BMMSC成骨分化能力,抑制Wnt/β-catenin通路活性及成骨分化相关蛋白表达,反之下调GLIS2表达后,可促进BMMSC成骨分化能力,提高Wnt/β-catenin通路活性及成骨分化相关蛋白表达。β-catenin与GLIS2之间有相互作用关系。结论GLIS2可能通过负调控Wnt/β-catenin通路活化,抑制BMMSC成骨分化能力。

过表达CXCR4促进小鼠骨髓间充质干细胞的归巢和增殖

目的研究过表达CXC趋化因子受体4(CXCR4)对小鼠骨髓间充质干细胞(BMMSC)体内外归巢特性和细胞增殖活性的影响。方法利用慢病毒载体介导小鼠BMMSC过表达CXCR4,构建过表达CXCR4的细胞(CXCR4-BMMSC)。TranswellTM小室实验检测基质细胞衍生因子1(SDF-1)对BMMSC迁移能力的影响;噻唑蓝(MTT)法检测BMMSC的增殖能力。BALB/c小鼠接受全身照射(TBI)后,随机分为2组,每组10只。BMMSC对照组:小鼠经TBI后,输注5×10^5个绿色荧光蛋白标记的BMMSC(GFP-BMMSC);CXCR4-BMMSC组:小鼠经TBI后,回输5×10^5个携带GFP的CXCR4-BMMSC。尾静脉回输细胞后,取小鼠胸腺进行冰冻切片,荧光显微镜下观察回输的细胞归巢至胸腺组织的情况;流式细胞术检测BMMSC归巢至受鼠体内胸腺的效率。结果 TranswellTM小室实验证实CXCR4可促进SDF诱导的BMMSC的跨膜迁移;与BMMSC对照组相比,CXCR4-BMMSC的增殖活性显著升高。与BMMSC对照组相比,过表达CXCR4可明显提高BMMSC归巢至胸腺组织的效率;流式细胞术检测结果提示BMMSC归巢至胸腺数量高于对照组。结论过表达CXCR4可增强SDF-1对BMMSC的迁移募集,体内可促进BMMSC归巢至损伤胸腺。CXCR4还可促进小鼠BMMSC的增殖。

VEGF过表达的骨髓间充质干细胞对大鼠牙槽骨缺损修复的影响

目的:探讨VEGF过表达的BMMSCs对大鼠牙槽骨损伤修复的影响。方法:分离培养及鉴定BMMSCs;VEGF过表达载体转染BMMSCs;制备BMMSCs成骨膜片并鉴定;构建大鼠牙槽骨损伤模型并植入成骨膜片;术后2、4、6、8周Micro-CT扫描牙槽骨并计算骨体积分数。结果:分离后的BMMSCs形态多为菱形;VEGF过表达的BMMSCs荧光镜下可见明显绿色荧光,且VEGF表达提高(83.1±4.8)%(P<0.05)。Vonkossa染色发现,BMMSCs成骨膜片矿化结节染色阳性,胞外局部有黑色钙结节。植入BMMSCs膜片后,第4和8周模型大鼠牙槽骨骨体积分数增加(P<0.05);与BMMSCs膜片相比,过表达VEGF的BMMSCs膜片在第4、6和8周骨体积分数增加(P<0.05)。结论:VEGF过表达的BMMSCs能增强大鼠牙槽骨损伤的修复。

miR-21调控人骨髓间充质干细胞成骨分化的研究

目的:观察miR-21在人骨髓间充质干细胞(h BMMSCs)成骨分化过程中的表达。方法:通过转染使h BMMSCs过表达或抑制miR-21后,分别采用ALP染色、茜素红染色观察各组ALP活性和钙化结节的表达形成量;并采用Real time RT-PCR、Western blot检测各组成骨相关基因Runxz、osterixmRNA及其蛋白的表达水平,以观察miR-21对h BMMSCs体外成骨分化的调控作用。将表达不同水平miR-21的各组h BMMSCs与HA/TCP复合后植入裸鼠皮下,8周后取材,采用HE染色和Masson三色染色观测各组类骨质的形成量。结果:miR-21在h BMMSCs成骨过程中表达量较对照组明显升高(P<0.05)。过表达miR-21能促进h BMMSCs体外成骨分化及体内的异位成骨能力;而抑制miR-21则能降低h BMMSCs体外成骨分化及体内的异位成骨能力。结论:miR-21可外调控h BMMSCs成骨分化,在骨形成过程发挥作用。

大鼠脂肪源性干细胞和骨髓间充质干细胞增殖速度的比较性研究

目的:比较ADSC和BMMSC在增殖速度上的差异性,初步探讨二者的优越性。方法:应用酶消化分离法分离AD-SC,差速贴壁法分离BMMSC,MTT法比较增殖速度。结果:第一代和第三代都呈现ADSC在培养48h后比BMMSC增殖快,P<0.05。结论:ADSC增殖快于BMMSC,体外扩增更容易快速获得大量种子细胞。

壮骨止痛胶囊调控Notch通路对去卵巢大鼠Notch1、Jagged1、HES蛋白的影响

目的观察壮骨止痛胶囊对去势雌鼠Notch1、Jagged1、HES蛋白的表达差异,探究其治疗骨质疏松的具体机制。方法将3月龄的健康雌性SD大鼠60只,随机分为空白组(KBZ)、假手术组(JSSZ)、模型组(MXZ)、壮骨止痛胶囊组(ZGZTFZ)、雷帕霉素(RAPA)组、自噬抑制剂(3-MA)组,每组各10只。除空白组、假手术组外,其余各组建立绝经后骨质疏松模型,假手术组去除卵巢周围相应体积脂肪。灌胃1个月后取材制备各组血清。ELISA测定血清中Ⅰ型胶原氨基端延长肽(P1NP)含量;HE染色、免疫组化测定骨组织和肾组织中Notch1、Jagged1、HES的表达。结果与假手术组比较,模型组蛋白表达有明显差异(P<0.01);与模型组比较,壮骨止痛胶囊组和RAPA组Notch1、Jagged1、HES表达升高(P<0.01);与RAPA组比较,壮骨止痛胶囊组骨组织HES表达降低(P<0.01),Notch1表达升高(P<0.01),Jagged1表达差异无显著统计学意义(P>0.05),肾组织中HES、Notc-h1、Jagged1表达显著降低(P<0.01);3-MA组HES、Notch1、Jagged1表达显著降低(P<0.01)。结论壮骨止痛胶囊能调控去卵巢大鼠的Notch通路对Notch1、Jagged1、HES蛋白表达起正向调节作用,促进骨形成,干预绝经后骨质疏松的状况。

免疫性血小板减少症患者骨髓间充质干细胞自身功能缺陷机制的研究进展

免疫性血小板减少症(ITP)是一种常见的以持续血小板减少为特征的自身免疫性出血性疾病。因其异质性而涉及不同的发病机制,不同疗法对患者效果有差异。骨髓间充质干细胞(BMMSC)可以调节天然免疫和获得性免疫的过程,从而产生耐受的微环境。BMMSC自身功能缺陷和免疫功能调节障碍是ITP发病的重要原因,ITP患者BMMSC的自身功能缺陷的机制主要为P53通路激活、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)通路活性减弱、肿瘤坏死因子α诱导蛋白3/核因子κB/SMAD同源物7(TNFAIP3/NF-κB/SMAD7)通路激活,而免疫功能调节障碍与诱导各种免疫细胞功能的受损有关。深入了解ITP的发病机制有助于ITP的治疗,但外源性BMMSC应用于ITP临床治疗的效果仍不清楚,需要更多的临床试验来验证。

电离辐射及不同条件培养基诱发骨髓间充质干细胞基因组不稳定性的比较研究

为了探讨不同剂量电离辐射及其所致条件培养基对肺癌相关骨髓间充质干细胞(bone marrowmesenchymal stemcells,BMMSCs)基因组不稳定性的影响,以A549和人BMMSCs为研究对象,采用X射线辐射和条件培养基转移的方法建立辐射旁效应模型,检测基因组不稳定性相关的细胞克隆存活率、微核率、53BP1(tumor suppressor p53 binding protein 1)焦点数等指标,同时采用ELISA法检测旁效应条件培养液不同时间点ROS、NO、TGF-β1的水平。结果显示:与正常BMMSCs组相比,IR组、A549-medium组和BMMSCs-medium组的细胞增殖均减少(P<0.05);细胞微核率和53BP1焦点数均增多(P<0.05);IR组变化最明显,其次为A549-medium组。此外,A549-medium组中TGF-β1、ROS以及NO的水平与BMMSCs-medium组相比均显著升高(P<0.05)。实验结果初步表明,辐射可能通过条件培养基中ROS、TGF-β1、NO等分子诱导未照射BMMSCs产生类似于直接辐射造成的基因不稳定性旁损伤效应,并且A549-medium组的旁损伤强于BMMSCs-medium组。

早衰小鼠骨髓间充质干细胞电压门控钙通道的表达检测

目的:研究早衰小鼠骨髓间充质干细胞(BMMSCs)的成骨分化特点以及电压门控钙通道的表达特点。方法:用micro-CT检测zmpste24-/-早衰小鼠和野生小鼠的骨量差异;分离培养两者的BMMSCs,并取第2代细胞分别检测其成骨能力以及胞内钙离子的浓度,采用RT-PCR方法检测两种小鼠BMMSCs中电压门控钙通道(10种亚型)的表达水平。结果:与野生型小鼠相比,zmpste24-/-早衰小鼠的骨量、其BMMSCs的成骨分化能力和胞内钙离子浓度均明显降低(P<0.05);RT-PCR检测结果显示,电压门控钙离子通道的10种亚型在两者BMMSCs中均有表达,其中Cav1.1、Cav1.2、Cav2.1和Cav2.2在早衰小鼠BMMSCs中的表达水平均明显低于野生小鼠组(P<0.05)。结论:在早衰过程中,电压门控钙离子通道可能参与了BMMSCs介导的骨质疏松。

微/纳米化载锶涂层对骨髓间充质干细胞生物活性影响的研究

目的:评价微/纳米化载锶涂层对骨髓间充质干细胞(BMMSCs)生物活性的影响。方法:将纯钛片分为3组,A组:光滑组(未经任何处理,n=24);B组:氢氟酸(HF)酸蚀组(n=24);C组:HF酸蚀+磁控溅射组(n=27)。SEM观察钛片表面形貌;X射线能谱(EDS)分析其表面元素含量;表面接触角检测钛片表面亲水性;离子释放试验检测C组的锶离子释放情况。在3组钛片表面分别接种BMMSCs,观察BMMSCs早期粘附能力;MTT检测细胞增殖能力;ALP活性评估细胞成骨分化能力。结果:3组钛片经不同方法处理后,B组形成微米级表面形貌;C组形成微/纳米表面形貌,并载入了锶元素,且锶元素可以离子形式释放;B、C组的亲水性、细胞粘附及增殖能力均高于A组,且B组高于C组;C组表面细胞的ALP活性显著高于B组。结论:微/纳米化载锶涂层有助于促进BMMSCs的增殖和成骨分化能力。

二甲双胍改善长期体外培养骨髓间充干细胞的增殖和分化功能

目的:观察二甲双胍(metfomin, Met)能否改善体外长期培养小鼠骨髓间充质干细胞(BMMSCs)的增殖和成骨分化功能。方法:分离小鼠BMMSCs进行体外培养,选取P1代和P6代细胞,P6代细胞用Met处理,检测细胞增殖,克隆形成,ALP活性、矿化结节和成骨基因mRNA表达水平。使用试剂盒检测细胞ROS水平,并检测抗氧化、干细胞属性(干性)及衰老相关基因的mRNA表达情况。结果:小鼠P6代BMMSCs的增殖和成骨分化功能明显低于P1代细胞,Met可以显著提高P6代细胞的增殖和成骨分化能力,并提高细胞的抗氧化功能和干性,降低衰老相关基因表达。结论:Met能够增强体外长期培养的小鼠BMMSCs的增殖和分化功能,这种作用可能是通过改善氧化应激和提高干性实现的。

自然衰老小鼠骨髓间充质干细胞增龄性改变的研究

目的:探讨自然衰老小鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)在衰老过程中生物学特点的改变。方法:分离、培养年轻(2月龄)、年老(16月龄)C57/BL6J小鼠的BMMSCs,经干细胞表面分子鉴定后,Western Blot检测2组BMMSCs的Tert、Acetyl-P53蛋白表达水平;氧化应激活性氧(ROS)试剂盒检测ROS表达水平;流式细胞仪检测并比较两组细胞的增殖、凋亡状态。结果:年轻、年老小鼠BMMSCs阳性表达Sca-1,阴性表达CD34、CD45,符合间充质干细胞表达特性;年老小鼠BMMSCs Tert蛋白表达水平明显低于年轻组(P<0.05),Acetyl-P53蛋白表达水平明显高于年轻组(P<0.05);年老细胞ROS表达水平明显高于年轻组;年老细胞的增殖能力明显低于年轻组(P<0.05),而凋亡水平则明显高于年轻组(P<0.05)。结论:年老小鼠BMMSCs出现增龄性变化,这些变化可能在骨衰老中起着重要作用。

SAMP6小鼠骨髓间充质干细胞线粒体呼吸链复合体功能研究

目的:研究自发性老年性骨质疏松模型SAMP6小鼠骨髓间充质干细胞(BMMSCs)的衰老状态、分化功能及线粒体呼吸链复合体活性。方法:分离培养SAMP6及其对照品系SAMR1小鼠BMMSCs,分别以实时定量PCR(RT-PCR)、Western Blot及细胞染色的方法,检测衰老、分化相关指标,并分别检测线粒体呼吸链复合体活性及复合体相关基因的表达。结果:与对照品系SAMR1小鼠相比,SAMP6小鼠BMMSCs的衰老相关基因、蛋白水平及β-gal染色阳性率显著升高(P<0.05);成骨分化相关基因、蛋白水平及茜素红染色阳性率显著降低(P<0.05);线粒体呼吸链复合体Ⅰ和Ⅲ活性显著降低,且呼吸链复合体相关基因表达亦降低(P<0.05)。结论:SAMP6小鼠BMMSCs存在细胞衰老及成骨分化功能障碍,其线粒体呼吸链复合体功能显著下降。

Zmpste24^(-/-)小鼠骨髓间充质干细胞的增殖凋亡及其TRP通道的表达研究

目的:探讨Zmpste24^(-/-)小鼠骨髓间充质干细胞(BMMSCs)的增殖凋亡情况及瞬时性受体电位通道(TRP通道)表达水平与野生型(WT)小鼠的区别。方法:体外分离培养4月龄Zmpste24^(-/-)和WT小鼠的BMMSCs,经干细胞表面分子鉴定后,分别采用β-半乳糖苷酶试剂盒检测两种小鼠细胞的衰老情况;流式细胞仪检测小鼠细胞的增殖、凋亡情况;实时定量RT-PCR检测两种小鼠细胞的TRP通道表达水平;激光共聚焦显微镜检测两种小鼠的细胞内Ca2+浓度。结果:Zmpste24^(-/-)和WT小鼠的BMMSCs均阳性表达Sca-1,阴性表达CD34、CD45。Zmpste24^(-/-)小鼠BMMSCs的衰老细胞数目和凋亡水平明显高于WT小鼠(P<0.05),而其增殖能力则明显低于WT小鼠(P<0.05);TRPC1、TRPM4、TRPM8、TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV5通道的表达水平均明显高于WT小鼠(P<0.05);胞内Ca^(2+)浓度明显高于WT小鼠(P<0.05)。结论:Zmpste24^(-/-)小鼠BMMSCs的增殖率降低、凋亡率升高可能与其TRP通道高表达、胞内钙离子浓度升高有关。

lncRNAs调控骨髓间充质干细胞分化的研究进展

近年来国内外越来越多的研究揭露了lncRNAs可能起到调控骨质疏松发病过程的潜在作用。该文从lncRNAs调控BMMSCs分化的角度出发,对lncRNAs在骨质疏松症中影响及作用机制进行综述,以进一步探讨lncRNAs在骨质疏松症治疗方面的潜在价值。

骨髓间充质干细胞对骨髓CD34^+细胞增殖影响的体外研究

研究骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMMSC)对骨髓CD34+细胞增殖的影响,为骨髓CD34+细胞体外扩增的深入研究提供依据。用MACS进行骨髓CD34+细胞的分选;用流式细胞术进行CD34+细胞纯度鉴定;用密度梯度离心法分离引产胎儿骨髓单个核细胞,结合贴壁法进行BMMSC的体外扩增培养;用流式细胞术进行BMMSC表面标志鉴定;用Transwell培养板培养CD34+细胞与BMMSC;用自动细胞计数仪计数有活性的CD34+细胞数量;用MTT比色法检测骨髓CD34+细胞增殖活性。流式细胞术检测结果显示分选所得的CD34+细胞纯度达到90%以上;流式细胞术检测显示传至第3代继续培养72h后的BMMSC高表达CD44、CD29,而HLA-DR、CD45、CD34表达阴性,说明所培养的BMMSC纯度很高;Transwell培养板培养CD34+细胞与BMMSC,在倒置显微镜下观察以及自动细胞计数仪计数发现,实验组有活性的CD34+细胞数量高于对照组(P<0.05);采用MTT比色法检测骨髓CD34+细胞的增殖活性,实验组高于对照组(P<0.05)。以上结果说明BMMSC有促进骨髓CD34+细胞增殖的作用,这种作用可能与其分泌的细胞因子有关。

颌骨骨质疏松机制的研究

随着种植技术的发展与改进,人们生活水平的不断提高,种植牙已被广大患者接受和认可。颌骨是全身骨骼系统的一部分,全身骨代谢疾病也会影响颌骨骨组织的代谢和骨量的变化。骨质疏松作为影响种植体骨结合的重要因素,对种植牙咀嚼功能成功恢复不可忽视。本文从骨改建异常,骨质疏松与成脂分化,间充质干细胞的成脂分化,Ror2/Wnt5α信号通路对BMMSCs成脂分化的调控机制等方面作一综述。

Comparison of Osteogenesis Between Two Kinds of Stem Cells from Goat Combined Calcium Phosphate Cement in Tissue Engineering

To explore the possible mechanism of osteogenesis for deciduous teeth stem cells (DTSCs) in vivo/ vitro, stem cells from goat deciduous teeth (SGDs) were firstly isolated, induced and transplanted into immunocompromised mice. The SGDs's mineralization pattern and osteogenesis were compared with bone marrow messenchymal stem cells (BMMSCs) from goats. SGDs have similar osteogenic differentiation pattern in vitro and bone-like tissue formation mechanism in vivo to BMMSCs; moreover SGDs have stronger alkaline phosphatase (ALP) gene expression and osteopontin (OPN) gene expression levels than BMMSCs; also SGDs can form more bone-like tissues than BMMSCs when cell-scaffold compounds are transplanted into immunocompromised mice. This pre-clinical study in a large-animal model confirms that DTSCs may be an appropriate source of stem cells in repairing bone defects with tissue engineering.