Cyclin D1在黄芪甲苷诱导BMSCs向神经元样细胞分化中的表达

目的:研究黄芪甲苷诱导骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)分化的特点和诱导过程中Cyclin D1的表达特点。方法:采用100 mg·L^(-1)黄芪甲苷诱导BMSCs分化,在1、12、24 h倒置显微镜观察细胞形态变化,免疫细胞化学方法观察巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)、Cyclin D1的表达,RT-PCR检测Cyclin D1 mRNA的表达。结果:收集获得的骨髓细胞采用原代和传代培养,至第3代BMSCs细胞基本纯化。经100 mg·L^(-1)黄芪甲苷作用后,部分细胞自胞体长出突起,形态似神经元样细胞且表达Nestin和NSE抗体,Nestin的表达时相早于NSE且表达强度高于NSE(P<0.05)。在药物作用1 h后,BMSCs细胞Cyclin D1不论在基因转录水平还是在蛋白表达水平均出现大幅度下调,此时BMSCs开始有Nestin的表达;药物作用12、24 h,BMSCs细胞Cyclin D1表达与药物作用前表达水平无显著性差异(P>0.05)。结论:黄芪甲苷可能首先通过调整细胞周期,延长了G1期向S期转变的时间,从而启动了BMSCs的分化程序,诱导BMSCs向神经干细胞分化。在黄芪甲苷的营养作用下,细胞的突起进一步生长并向神经元分化。

基于BMSCs淫羊藿-仙茅-巴戟天角药抗骨质疏松药效物质提取工艺研究

目的筛选淫羊藿-仙茅-巴戟天角药抗骨质疏松药效物质的最佳提取工艺。方法采用正交设计,选取提取时间、料液比、乙醇浓度为考察因素,以BMSCs细胞增殖率结合淫羊藿苷、总黄酮含量为考察指标,筛选淫羊藿-仙茅-巴戟天角药抗骨质疏松药效物质的最佳提取工艺,并对最佳提取条件进行验证。结果兼顾生产效率和节约能源,优选出淫羊藿-仙茅-巴戟天角药药效物质的最佳提取条件为提取时间1.5 h,乙醇浓度55%,溶剂用量10倍。验证实验结果BMSCs细胞增殖率、淫羊藿苷及总黄酮含量与工艺考察结果非常接近。结论该方法在保证淫羊藿-仙茅-巴戟天角药治疗骨质疏松的药效基础上,结合淫羊藿苷及总黄酮含量进行综合评价,优化提取工艺,使得实验结果更科学合理。

抑制PPARγ表达对BMSCs成骨分化的影响

目的探究抑制过氧化物酶增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)表达对BMSCs成骨分化的影响,为原发性骨质疏松症(primary psteoporosis,POP)的治疗提供理论基础。方法将骨密度正常患者提取的BMSCs分为正常对照组(CON组),POP患者提取的BMSCs分为原发性骨质疏松组(POP组),取POP组细胞加入PPARγ抑制剂,分为抑制剂组(INR组),经成骨诱导分化后,检测各组细胞中骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨钙素(osteocalcin,OCN)、Osterix、Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,Runx2)的表达情况;碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色观察各组BMSCs成骨分化情况。结果POP组ALP阳性细胞数低于CON组和INR组(P<0.05);与CON组相比,POP组中OCN、OPN、Osterix、Runx2表达量降低,差异具有统计学意义(P<0.05);与POP组相比,INR组中OCN、OPN、Osterix、Runx2表达量升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论抑制PPARγ表达后,BMSCs成骨分化特异性基因(ALP、OCN、OPN、Osterix、Runx2)表达增加。

仿生聚乳酸纤维膜对大鼠BMSCs成骨分化的影响

目的:探讨微观形貌仿生的聚乳酸纤维膜对大鼠BMSCs生长、铺展、黏附、增殖和成骨分化的影响。方法:取第3代rBMSCs,按1×105个/mL密度接种于覆盖不同直径聚乳酸纤维膜的细胞培养板上,分别为仿生组(A组)直径(357±32)nm、有形貌对照组(B、C组)直径分别为(164±13)nm、(1311±93)nm,无形貌空白对照组(Ctrl组),在成骨分化实验时增设成骨诱导阳性对照组(Positive组)。扫描电镜观察BMSCs生长、铺展;CCK-8试剂盒检测BMSCs增殖、黏附;实时荧光定量PCR检测Runx2、COLI、ALP、OSX的mRNA表达;Western Blot检测骨桥蛋白(OPN)、骨钙素(OC)的表达。结果:扫描电镜示:A、B二组上细胞具有明显聚集区域,相互联系紧密;单个细胞形态观察,A组较B、C及Ctrl组,细胞铺展面积更大、伪足更多。黏附实验示:在8h、16h,A、B组均高于C组(P<0.05)。增殖实验示:第3、5、7、9天,Ctrl组、A组、B组增殖情况均优于C组(P<0.05),三组间对比,Ctrl组优于A、B组(P<0.05);第7、9天A组增殖情况优于B组(P<0.05)。实时荧光定量PCR显示:在第3、10天,A、Positive组ALP、COLI、Runx2、OSX的mRNA表达量均明显高于B、C及Ctrl组(P<0.05);A组低于Positive组(P<0.05)。蛋白质印迹示:第10天,A、Positive组OPN、OC表达量均明显高于B、C、Ctrl组(P<0.05);A组OC表达量低于Positive组(P<0.05);B、C、Ctrl三组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论:微观形貌仿生的聚乳酸纤维膜能促进rBMSCs黏附、增殖、成骨分化。

炎性微环境下TGF-β1通过TGF-β1/Smad3通路促进BMSCs成骨分化

目的研究炎性微环境下转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化的影响及作用机制。方法应用肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)体外模拟炎性微环境,检测不同浓度TGF-β1对BMSC增殖活性的影响。实验分为对照组[BMSC+成骨诱导液(osteogenic medium,OM)]、实验组(BMSC+TGF-β1+OM)和抑制组[BMSC+SB431542(TGF-β1拮抗剂)+OM]。应用ALP染色、茜素红染色、实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)及Western blot法对BMSCs成骨分化能力和TGF-β信号通路因子Smad2、Smad3进行检测并比较3组间的差异。结果低浓度TGF-β1作用下BMSCs增殖活性较高,高浓度(50ng/ml)抑制BMSCs增殖活性;成骨诱导7天和10天时,实验组与其他两组比较,ALP染色较深、面积最大;茜素红染色结果显示,实验组体外矿化结节形成均高于其他两组;RT-qPCR检测结果显示,实验组成骨分化基因OPN、RUNX2与ALP表达均增高,TGF-β信号通路中Smad3在实验组表达最高,抑制组表达最低,差异有统计学意义(P<0.01)。Western blot法检测结果显示,实验组内OPN、RUNX2与ALP蛋白表达水平增高,差异有统计学意义(P<0.05);TGF-β信号通路中Smad3蛋白表达在3组中差异不明显,而p-Smad3在实验组中表达明显增高、抑制组中明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论炎性微环境中TGF-β1通过激活TGF-β/Smad3信号通路促进了BMSCs成骨分化。

压力作用下血小板反应蛋白-2通过调控黏着斑形成促BMSCs成软骨分化的研究

目的力学刺激在软骨发育和软骨组织稳态维持中有重要作用。前期研究发现,动态压力刺激促进BMSCs成软骨分化的过程中,伴随血小板反应蛋白-2(TSP-2)的表达上调,且TSP-2与BMSCs成软骨分化密切相关,但其作用机制尚未完全阐明。本研究采用外源性TSP-2多肽以及慢病毒干扰TSP-2表达后,检测动态压力下TSP-2在BMSCs成软骨分化中的作用及机制。方法体外分离培养BMSCs,分为对照组、TSP-2组、sh TSP-2组、压力组、压力+TSP-2组和压力+sh TSP-2组;免疫荧光染色法检测细胞中FAK的表达,并对黏着斑数量进行统计分析;采用超低黏附培养皿对BMSCs行3D培养,倒置光学显微镜观察细胞团块并拍照;Western blotting检测细胞团块中成软骨标志蛋白Sox9的表达;结果贴壁培养的sh TSP-2组、压力组和压力+sh TSP-2组BMSCs中,FAK的表达水平和黏着斑数量显著高于对照组(P<0.05),压力+TSP-2组与压力组相比黏着斑数量显著下调(P<0.05);sh TSP-2组和压力+sh TSP-2组中细胞团块存在大量未聚集的细胞;Western blotting结果显示TSP-2组、压力组、压力+TSP-2组细胞团块中Sox9的表达显著高于对照组(P<0.05)。结论动态压力刺激下TSP-2通过抑制BMSCs黏着斑的形成,促BMSCs向成软骨方向分化。

静水压力对BMSCs凋亡的影响及凋亡外囊泡特异性microRNA的研究

目的明确不同静水压力作用对BMSCs细胞凋亡的影响,并筛选压力作用下BMSCs凋亡囊泡表达的差异mi RNA。方法分离培养大鼠BMSCs并鉴定;细胞分为对照组、压力作用组(-40 k Pa,0.1 Hz作用1 h)、STS作用组(0.5μM,16 h),梯度离心法提取凋亡囊泡;CCK8检测细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western Blotting检测细胞凋亡标志物的表达及凋亡囊泡标志物的表达,NTA检测凋亡囊泡尺寸及浓度。采用高通量mi RNA测序技术对压力作用下BMSCs凋亡囊泡相关差异mi RNA进行筛选。结果采用全骨髓贴壁的方法分离培养的大鼠BMSCs可高表达干细胞表面标志物CD90、CD29、低表达造血细胞表面标志物CD34、CD45,并具有较强的克隆形成能力和多向分化的能力,为间充质干细胞。适当的静水压力处理可显著降低BMSCs细胞活性,促进其凋亡发生,并且-40 KPa压力作用下BMSCs凋亡率最高,且凋亡囊泡产生数量显著多于对照组。采用测序技术发现,-40 KPa压力作用产生的凋亡囊泡差异性表达mi R-183-5p和mi R-3473。结论适当的静水压力可以促进BMSCs的凋亡,并且-40 KPa压力作用下BMSCs凋亡囊泡差异性表达抗炎相关基因mmi R-183-5p和mi R-3473。

基于SDF-1/CXCR4轴探讨补肾壮筋汤促进小鼠BMSCs归巢和保护关节软骨的机制研究

目的探讨补肾壮筋汤调控SDF-1/CXCR4轴促进小鼠BMSCs归巢和保护关节软骨的作用机制,为膝骨关节炎(KOA)的康复治疗提供实验依据。方法①动物实验中,选用8周龄SPF级C57BL/6雄性小鼠30只,采用随机数字表法分为假手术组、模型组、补肾壮筋汤组,每组10只,干预12周。采用micro-CT、HE染色观察各组软骨形态变化;激光共聚焦显微镜观察骨组织SDF-1荧光强度;qPCR、Western blot检测各组归巢相关调控因子mRNA转录水平和蛋白相对表达量。②细胞实验中,选用4周龄SPF级C57BL/6雄性小鼠,采用全骨髓贴壁法提取原代BMSCs,流式细胞术对所提取的细胞进行鉴定后,筛选最佳慢病毒MOI值;随机将细胞分为空白组、空载组、补肾壮筋汤组、sh-SDF-1组、sh-SDF-1+补肾壮筋汤组5组,采用划痕实验观察各组BMSCs迁移情况;阿利新蓝、CollagenⅡ免疫细胞学染色观察各组细胞成软骨分化能力;激光共聚焦显微镜观察各组SDF-1、CXCR4的荧光强度;qPCR检测各组归巢相关调控因子mRNA转录水平。结果①动物实验中,关节组织形态学结果(micro-CT、HE染色)显示:与假手术组比较,模型组股骨髁间可见一圆形缺损,骨皮质失连,软骨细胞缺失;与模型组比较,补肾壮筋汤组股骨髁间环形缺损好转,软骨细胞排列稍紊乱。关节组织免疫荧光显示:与假手术组比较,模型组SDF-1蛋白相对表达量升高;与模型组比较,补肾壮筋汤组SDF-1的蛋白相对表达量升高(P<0.05)。qPCR与Western blot结果显示:与假手术组比较,模型组归巢关键调控因子(SDF-1、CXCR4、MIP-1α、MCP-1、MIP-1β、RANTES、VEGF、G-CSF、NCAM-1、MMP-2)的mRNA转录水平和蛋白相对表达量升高(P<0.05);与模型组比较,补肾壮筋汤组归巢关键调控因子mRNA转录水平和蛋白相对表达量升高(P<0.05)。②细胞实验中,BMSCs经细胞流式术鉴定:CD44、CD105呈阳性表达,CD34呈阴性表达。当病毒MOI值为100时,SDF-1基因感染率最高。BMSCs迁移和成软骨分化能力检测结果显示:与空白组比较,sh-SDF-1组细胞向划痕区域迁移的细胞数量、酸性黏多糖及CollagenⅡ蛋白相对表达量显著减少(P<0.05);补肾壮筋汤组和sh-SDF-1+补肾壮筋汤组迁移的细胞数量、阿利新蓝染色及CollagenⅡ蛋白相对表达量显著增多(P<0.05)。细胞免疫荧光显示:与空白组比较,sh-SDF-1组细胞SDF-1、CXCR4蛋白相对表达量显著减少;补肾壮筋汤组和sh-SDF-1+补肾壮筋汤组细胞SDF-1、CXCR4蛋白相对表达量显著增多(P<0.05)。qPCR结果显示:与空白组比较,sh-SDF-1组归巢关键调控因子的mRNA转录水平降低(P<0.05),补肾壮筋汤组归巢关键调控因子的mRNA转录水平升高(P<0.05)。结论补肾壮筋汤可通过上调SDF-1/CXCR4轴促进小鼠BMSCs归巢保护关节软骨。

TGF-β_1和IGF-1共同转染大鼠BMSCs向软骨细胞分化的实验研究

目的探讨应用TGF-β1和IGF-1基因转染大鼠BMSCs后,目的基因分泌情况及向软骨细胞的分化效果,为构建新型的组织工程软骨种子细胞提供思路。方法6周龄健康雄性Wistar大鼠2只,体重约150g。扩增、提取质粒pcDNA3.1-IGF-1、pcDNA3.1-TGF-β1,酶切、电泳鉴定并测序。采用密度梯度离心法和贴壁分离法,分离、纯化Wistar大鼠BMSCs,倒置相差显微镜观察原代和传代BMSCs形态学改变,免疫荧光法检测细胞表面标志。将TGF-β1和IGF-1基因单独或共转染第3代BMSCs,按转染情况分为5组:未转染组(A组)、转染空载体组(B组)、转染TGF-β1组(C组)、转染IGF-1组(D组)、TGF-β1与IGF-1共转染组(E组)。对转染后细胞进行筛选,MTT法测定筛选后细胞的增殖活性,RT-PCR和Western blot法检测筛选后细胞的表达。结果电泳显示IGF-1和TGF-β1两目的基因条带,基因测序与Gene-Bank cDNA序列相符。大鼠BMSCs原代细胞接种24h后可见少量贴壁突起细胞,4、5d开始形成典型的BMSCs簇状增生,9、10d细胞生长即可达80%～90%融合;传代后细胞形态较均一。免疫荧光法检测BMSCs的CD29、CD44呈阳性反应,CD34、CD45呈阴性反应。转染24h后有少量细胞死亡,筛选3周后细胞克隆形成,至第4周细胞可传代,多数细胞变成多边形,部分细胞边界不清,呈圆形,核偏位,核周颗粒明显。MTT法测定A、B、C、D、E组细胞在490nm波长处的吸光度(A)值,分别为0.432±0.038、0.428±0.041、0.664±0.086、0.655±0.045和0.833±0.103。A、B组与C、D、E组间差异均有统计学意义(P<0.01),但A、B组以及C、D、E组间差异无统计学意义(P>0.05)。RT-PCR和Western blot检测目的基因和蛋白的表达量,TGF-β1表达以C组最多,分别为0.9250±0.0220、124.3417±2.9820,E组次之,分别为0.7717±0.0120、101.7667±1.2410(P<0.01);IGF-1表达以E组最多,分别为1.0200±0.0260、128.1717±9.1520,D组次之,分别为0.4650±0.0420、111.0450±6.2480(P<0.01);II型胶原表达以E组最多,分别为0.9800±0.0340、120.3550±12.5500,C组次之,分别为0.7200±0.0260、72.2467±7.3640(P<0.01)。结论通过TGF-β1和IGF-1基因共同转染BMSCs修复软骨缺损是一个较有前景的发展方向,对组织工程软骨应用于临床具有重要意义。

辛伐他汀联合BMSCs治疗激素性股骨头坏死的实验研究

目的单纯BMSCs治疗激素性股骨头坏死的效果尚不理想,探讨辛伐他汀联合BMSCs治疗激素性股骨头坏死的可行性。方法取24只新西兰大白兔骨髓分离培养BMSCs,取第2代细胞制备为1×107/mL细胞悬液,与明胶海绵复合。取70只新西兰大白兔经耳缘静脉注射10μg/kg脂多糖,24h后臀肌注射20mg/kg甲基强的松龙琥珀酸钠,共3次,每次间隔24h,制备股骨头坏死模型。选取制备成功的48只,随机分为4组,每组12只。A组:不作任何处理;B组:单纯减压,并于减压通道植入明胶海绵;C组:减压同时植入复合BMSCs的明胶海绵;D组:减压同时植入复合BMSCs的明胶海绵,每日灌服辛伐他汀(10mg/kg)至处死。观察动物一般情况,于术后4、8周各组取6只行MRI扫描后,处死取股骨头行组织学及免疫组织化学染色,扫描电镜观察。结果术后8周C、D组动物走路姿势逐步好转。术后4周各组MRI未见明显坏死区信号改变,8周时A组可见坏死低信号区明显扩大,B组无变化,C组范围缩小,D组明显缩小。组织病理学观察,术后4周A组见空骨陷窝,无新生毛细血管;B组空骨陷窝较多,有少量新生毛细血管;C、D组空骨陷窝减少,坏死区有大量增生活跃的成骨细胞及新生毛细血管。D组空骨陷窝阳性数及微血管密度分别为19.30±1.52和7.08±1.09,与其他组比较差异有统计学意义(P<0.05)。术后8周,A组可见部分骨小梁断裂;B组减压孔道有纤维性骨痂形成;C组空骨陷窝少见,髓腔形态不规则;D组大量新生骨形成,髓腔较规则,髓内脂肪细胞大小及分布均匀。D组空骨陷窝阳性数及微血管密度分别为11.31±1.28和12.37±1.32,与其他组比较差异有统计学意义(P<0.05),与术后4周比较差异有统计学意义(P<0.05)。扫描电镜观察:术后8周,A组骨小梁见多处断裂塌陷,骨小梁表面未见骨细胞,髓腔内有大量脂肪细胞堆积;B组部分骨小梁可见裂痕;C组骨小梁不致密;D组骨小梁结构规整致密,成骨细胞多,骨细胞及基质胶原纤维正常,髓腔规则。结论辛伐他汀能促进BMSCs成骨及成血管化,辛伐他汀联合BMSCs治疗激素性股骨头坏死具有较好的应用前景。

BMSCs成骨分化的干预效应血小板裂解液对大鼠

目的观察血小板裂解液(platelet lysate,PL)对大鼠BMSCs成骨诱导分化的干预效应。方法成年健康清洁级Wistar大鼠24只,体重250～300 g,雌雄不限。取16只大鼠心内采血,采用3次离心结合反复冻融法制备PL,ELISA法测定PL中PDGF、TGF-β1、IGF-1和VEGF含量。另取8只大鼠,采用全骨髓分离培养法扩增传代BM SCs,取第4代细胞按1×104/cm2接种行成骨诱导培养。按诱导培养液的不同,实验分为3组,A、B组基础诱导培养基中分别含终浓度为5%和1%的PL,C组仅含基础诱导培养基。倒置相差显微镜动态观察各组细胞形态变化及生长状况;诱导培养7 d,各组行ALP染色;诱导培养2、8、10 d,ALP/总蛋白含量确定ALP活性;诱导培养20 d,茜素红染色观察矿化结节形成并定量分析。结果PL中PDGF、TGF-β1、IGF-1和VEGF含量分别为(300±30)、(140±25)、(80±35)和(70±20)pg/mL。倒置相差显微镜观察,各组BMSCs形态逐渐发生改变,出现类成骨细胞样形态特征;A组细胞形态变化不及B、C组明显,但细胞增殖较快;20 d A组细胞仍密集生长,ECM中形成的矿物沉积显著少于B、C组。诱导培养7 d,A组细胞胞浆中有少量颗粒,ALP染色呈弱阳性;B、C组细胞胞浆中有大量棕褐色颗粒,ALP染色呈强阳性。诱导培养2、8、10 d,ALP活性定量分析示A组显著低于B组和C组(P<0.05)。诱导培养20 d,茜素红染色显示A、B、C组钙结节数量分别为(7.67±1.10)、(12.87±0.81)和(15.59±1.25)个;矿化结节面积分别为(161 778.70±44 550.80)、(337 349.70±56 083.24)和(415 921.70±71 725.39)像素;A组均明显低于B组和C组(P<0.05),B、C组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论PL是多种生长因子的承载体系,以剂量依赖方式抑制BMSCs成骨诱导中ALP活性和矿化结节形成。

HA复合rhBMP-2转染的BMSCs对羊胫骨延长骨愈合的影响

目的评价HA复合rhBMP-2的腺病毒(adenovirus mediated rhBMP-2,Adv-rhBMP-2)转染的羊BMSCs对骨痂延长骨愈合的影响。方法成年山羊19只,雌雄不限,体重15～20kg。于每只羊髂嵴上穿刺抽取骨髓10mL,常规传代培养BMSCs。取第3代BMSCs,以感染复数200转染腺病毒。取0.25%胰蛋白酶消化转染后3d的细胞1×108个,与HA充分混匀制备Adv-rhBMP-2/BMSCs/HA。建立山羊右侧胫骨延长模型,术后立即于截骨部位注射自体细胞复合物。按术后注入物质不同随机分成4组:A组为Adv-rhBMP-2/BMSCs/HA组(n=6),B组为Adv-rhBMP-2/BMSCs组(n=5),C组为Adv-β-gal/BMSCs/HA组(n=4),D组为空白组(n=4)。术后第7天开始行胫骨延长,速度1mm/d,共延长4周。术后5、8、12周摄X线片观察骨痂生长情况,12周处死动物,取标本分别行骨密度检测、生物力学测定、组织学观察和骨形态计量学分析。结果X线片检查示,术后5、8周A、B组骨痂生成量明显多于C、D组,X线片定量评分A、B组明显高于C、D组,差异均有统计学意义(P<0.05);12周各组均在骨延长部位形成连续骨痂。骨密度测定:术后12周A、B、C、D组延长部位骨矿物质含量分别为(4.175±1.921)、(2.600±0.638)、(2.425±0.826)和(1.175±0.574)?g,骨矿物质密度分别为(0.612±0.196)、(0.630±0.159)、(0.450±0.166)和(0.266±0.113)g/cm2,A、B组显著高于C、D组(P<0.05)。生物力学测定:A、B、C、D组最大载荷分别为(490.20±155.08)、(350.59±80.48)、(221.95±68.79)和(150.65±92.29)N,弹性模量为(178.24±105.80)、(105.88±27.09)、(81.18±48.67)和(50.35±47.64)MPa,各指标A组显著高于C、D组(P<0.05)。组织学观察见A组骨延长处大量新生骨组织,骨小梁多为纵行网状排列。骨形态计量分析示A、B、C、D组新骨体积分别为72.35%±5.68%、67.58%±7.42%、49.63%±4.87%和38.87%±2.35%,A组新生骨生成量明显比D组多(P<0.05)。结论HA复合rhBMP-2修饰的BMSCs制备的组织工程骨可促进羊胫骨延长骨愈合。

杜仲叶通过Shp2激活Erk1/2促进BMSCs增殖的研究

目的研究杜仲叶提取物对大鼠BMSCs的增殖作用及其分子机制。方法使用密度梯度离心和贴壁培养法从SD大鼠股骨骨髓中获取BMSCs,通过流式细胞仪检测细胞表面抗原;分别用0,5,20,60,100 mg/ml的杜仲叶提取物和20mg/ml杜仲叶提取物+10μmol/L Shp2抑制剂NSC87887处理BMSCs,2 d后BrdU检测细胞增殖情况;用无血清无酚红培养基饥饿大鼠BMSCs 6 h后,一组分别加入0,5,20,60,100 mg/ml的杜仲叶提取物处理15 min,另一组用10μmol/LShp2抑制剂处理预处理2 h后加入20 mg/ml杜仲叶提取物处理15 min,Western blot检测p-Shp2(Tyr580)和Erk1/2磷酸化水平的变化。结果流式细胞仪细胞表面抗原检测显示CD29、CD90呈阳性,CD34、CD45呈阴性;BrdU结果显示杜仲叶提取物促进BMSCs增殖,并具有浓度依赖性,NSC87887可以抑制其促进作用;杜仲叶提取物可以诱导BMSCs的p-Shp2(Tyr580)和Erk1/2磷酸化水平升高,而对诱导Erk1/2磷酸化的促进作用是通过激活Shp2来完成的。结论杜仲叶提取物通过Shp2/Erk途径促进大鼠BMSCs增殖。

间歇性负压培养对人BMSCs骨保护素和骨保护素配体mRNA表达水平的影响

目的探讨间歇性负压对体外培养的人BMSCs骨保护素(osteoprotegerin,OPG)mRNA和骨保护素配体(osteoprotegerin ligand,OPGL)mRNA表达水平的影响。方法2008年1月由2例髋关节骨性关节炎行人工关节置换患者自愿捐赠骨髓,分离并体外培养人BMSCs,取第3代细胞。实验组进行负压诱导,设置压力为50kPa,30min/次,2次/d,间歇性负压干预2周;对照组于普通CO2培养箱中常规培养。倒置相差显微镜下观察细胞形态,并通过实时定量PCR检测OPG mRNA和OPGL mRNA表达水平。结果实验组细胞增殖速度略低于对照组,细胞逐渐由梭形向多角形转变,有数个突起,数目和形态不定,10～14d细胞融合成单层,2周后逐渐形成多个散在致密岛状结构;对照组细胞大部分为梭形。间歇性负压培养2周后,与对照组比较,实验组细胞OPG mRNA表达水平显著提高,OPGL mRNA表达水平显著降低,OPGL mRNA与OPG mRNA比率显著下降,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论间歇性负压促进人BMSCs OPG表达,同时抑制其OPGL表达。

CdCl_2诱导大鼠BMSCs凋亡和DNA损伤的研究

目的研究化学毒性物质氯化镉（cadmium chloride,CdCl2）对骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stemcells,BMSCs）形态学、MTT检测结果、细胞凋亡及DNA稳定性的影响。方法用MTT法筛选CdCl2对BMSCs抑制作用的最佳浓度;将BMSCs（F3）分为对照组及CdCl2最佳浓度（200μmol/L）干预组,培养24 h后用MTT法检测BMSCs的生存情况,用流式细胞仪（flow-cytometer,FCM）检测细胞凋亡情况,用单细胞凝胶电泳技术（SCGE）检测BMSCs的DNA损伤情况。结果 CdCl2可对BMSCs在6.25~200μmol/L有明显的抑制作用,细胞给药12及24 h后,存在剂量-效应关系和时间-效应关系,CdCl2对BMSCs抑制作用最强的浓度为200μmol/L（24 h）;显微镜下观察,对照组细胞呈成纤维细胞样贴壁生长,胞体透亮,折光性强;CdCl2诱导组细胞呈凸起回缩,细胞变小、变圆,贴壁不牢,悬浮细胞增多;与对照组比较,CdCl2诱导组细胞存活率明显降低,细胞凋亡明显增加,细胞的DNA拖尾率、平均尾长显著增加（P〈0.01）。结论 CdCl2在质量浓度为6.25~200μmol/L时对BMSCs有明显的抑制作用;对BMSCs抑制作用最强的浓度为200μmol/L（24 h）,且可引起大鼠BMSCs凋亡及DNA的损伤。

补肾方药诱导BMSCs移植对脑缺血损伤NGF、BDNF、VEGF表达的影响

目的观察补肾方药血清诱导大鼠BMSCs移植对脑缺血损伤大鼠脑组织神经生长因子(NGF)、脑源性神经生长因子(BDNF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达水平的影响作用。方法用线栓法制备大脑中动脉闭塞模型,随机分为模型组,单纯BMSCs移植组,左归丸、右归丸、地黄饮子、维甲酸诱导BMSCs移植组,另设假手术对照组。尾静脉移植用不同药物血清孵育BMSCs,移植后3 d和7 d处死大鼠,用ELISA法检测脑组织匀浆上清液中NGF、BDNF、VEGF的含量。结果第3天,与假手术组比较,模型组BDNF明显升高(P<0.05);与模型组比较,BMSCs移植各组VEGF明显升高(P<0.01),且药物孵育BMSCs移植各组NGF、BDNF明显升高(P<0.05,P<0.01);第7天,与假手术组比较,模型组NGF、BDNF明显升高(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,BMSCs移植各组NGF、BDNF、VEGF明显升高(P<0.01);与右归丸组比较,左归丸、地黄饮子组NGF、BDNF明显升高(P<0.01)。结论不同补肾法方药血清孵育BMSCs均可促进脑缺血损伤大鼠脑组织匀浆上清液中NGF、BDNF、VEGF的表达,且补阴和阴阳双补方药诱导BMSCs组中表达的NGF、BDNF作用优于补阳类方药。

多孔CPC组织工程肋骨支架制备及BMSCs在其表面增殖黏附的实验研究

目的通过形态学观察、细胞黏附和细胞增殖实验观察多孔CPC材料作为组织工程肋骨支架的可行性。方法取幼猪骨髓分离培养BMSCs并传代,另自制5mm×5mm×5mm大小的多孔CPC材料,micro-CT观察孔径、孔隙率及羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)含量,并与人正常松质骨作对比。取24孔培养板,于孔内置入多孔CPC材料1块,共15块,调整第1代BMSCs浓度为6×105个/mL,将细胞悬液150μL滴加到多孔CPC材料上,置于孵育箱中复合培养4、12、24h后,收集细胞并计数,计算细胞黏附率;行倒置相差显微镜观察、MTT法检测多孔CPC材料表面BMSCs的生长情况;扫描电镜观察接种BMSCs7d的多孔CPC材料,并与单纯多孔CPC材料和正常人松质骨对比。结果BMSCs与多孔CPC材料复合培养4、12、24h的细胞黏附率分别为28.00%±0.98%、46.70%±1.14%和48.50%±1.18%。MTT法检测细胞与材料复合培养1、2、3、4、5、6d的吸光度(A)值分别为1.103±0.214、1.557±0.322、1.920±0.178、2.564±0.226、2.951±0.415和3.831±0.328,呈明显上升趋势。倒置相差显微镜下可见细胞生长旺盛,贴壁良好,未出现毒性反应。micro-CT检查示多孔CPC材料的孔径均衡,且互相连通,HA含量为(1101.2228±0.6184)mg/ccm,孔隙率为70.26%±0.45%;人正常松质骨HA含量为(1072.5523±0.7442)mg/ccm,孔隙率为72.82%±0.51%;两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。扫描电镜观察单纯多孔CPC材料孔径与正常人松质骨孔径大小、结构相似,且互相连通;BMSCs在多孔CPC材料表面排列有序,细胞呈片状,部分呈簇状,细胞形态呈多边形,细胞间可见较多细胞间质。结论多孔CPC材料结构和成分均接近正常人松质骨,BMSCs在其表面生长良好,适合作为组织工程肋骨支架材料,但其对细胞的黏附性有待进一步改善。

下调骨细胞TGF-β/Smad4信号可抑制小鼠BMSCs成骨及破骨分化

目的检测骨细胞TGF-β/Smad4信号通路对骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨和破骨分化的作用,并初步探讨其相关机制。方法用条件性基因敲减Cre/loxp技术特异性敲减骨细胞Smad4,获得下调骨细胞TGF-β/Smad4信号通路的小鼠;体外分离骨细胞并与野生型小鼠骨髓间充质细胞(BMSCs)共培养;碱性磷酸酶(ALP)染色、茜素红(alizarin red)染色检测早期成骨分化和晚期钙盐沉积,酸性磷酸酶(TRAP)染色检测破骨细胞;real-time PCR检测成骨分化特异标志物Runx2、Osterix(OSX)、ALP、osteocalcin和破骨分化特异标志物RANKL和OPG的mRNA表达水平。Western blot检测成骨分化特异标志物Runx2和osteocalcin和破骨分化特异标志物RANK蛋白表达水平。结果下调骨细胞TGF-β/Smad4信号能够抑制BMSCs成骨转录因子Runx2、Osterix(P<0.01)、成骨分化特异标志物ALP和osteocalcin(P<0.01)以及破骨分化特异标志物RANK(P<0.01)的表达;增加破骨分化抑制物OPG的表达(P<0.05);而RANKL的表达无明显变化;最终下调了RANKL/OPG的比值(P<0.05)。结论终末分化的骨细胞调控骨的代谢,下调其TGF-β/Smad4信号可抑制BMSCs成骨和破骨细胞的分化。

GDF-5联合地塞米松诱导大鼠BMSCs向类髓核样细胞分化

目的探讨GDF-5联合地塞米松诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向类髓核样细胞分化潜能及其表型的改变。方法用全骨髓贴壁法及序贯酶消化法分别分离培养大鼠BMSCs和髓核细胞(NPCs),均取P3代细胞分为1)对照组,2)BMSCs+Dex组3)BMSCs+GDF-5组4)BMSCs+Dex+GDF-5组(联合诱导组)5)NPCs组。诱导培养21 d,镜下观察细胞形态及密度变化,阿辛蓝染色检测蛋白多糖,RT-PCR检测COL1、ACAN、SOX9及COL2和髓核细胞阳性基因KRT19、PAX1和FOXF1的表达。Western blot检测COL2及COL1蛋白表达。结果 BMSCs形态呈长梭型、漩涡样生长;NPCs呈球形、岛状生长的特点;诱导后BMSCs向类圆形、三角形转变,细胞体积缩小,胞质颜色与对照组相比逐渐加深;蛋白多糖分泌增加,以联合诱导效果最佳。ACAN、SOX9、COL2基因的相对表达量逐渐增高,ACAN/COL2的比例呈递增趋势,COL1的表达呈递减趋势。NPCs阳性基因KRT19、PAX1、FOXF1与对照组相比(P<0.05)。含GDF-5的诱导组COL2蛋白表达高于对照组(P<0.05),而联合诱导组COL1蛋白的表达最少。结论GDF-5可以诱导大鼠BMSCs向类髓核样细胞分化,且地塞米松能起到显著促进作用,为BMSCs移植治疗椎间盘退变提供了理论依据。

BMSCs复合胶原材料三维诱导软骨细胞的初步研究

目的通过体外培养犬BMSCs,以胶原海绵作为支架材料,体外三维复合培养后,观察向软骨细胞定向诱导的可行性。方法健康家犬10只,体重10～15kg,雌雄不拘。抽取骨髓,体外培养BMSCs,传至第3代,倒置相差显微镜观察细胞形态。实验组将第3代BMSCs以1×106/mL密度接种于胶原海绵支架材料,体外培养48h后,将细胞材料复合物以软骨细胞定向诱导培养基进行诱导,每隔2天换液;对照组将第3代BMSCs以相同密度接种于胶原海绵支架材料,每隔2天以DMEM换液。培养后14d,将细胞材料复合物行HE染色和免疫组织化学染色观察。结果倒置相差显微镜下第3代BMSCs与第2代BMSCs形态基本一致,传代初期细胞伸出伪足,呈梭形或三角形,7d后逐渐以梭形为主,胞体饱满,细胞传代后增长速度明显加快。组织学观察:实验组细胞广泛分布于支架材料孔隙内,多数细胞呈多角形或者不规则形,少数呈短梭形,细胞周围间隙可见基质成分;对照组细胞分布于支架材料孔隙内,呈梭形或圆形,核呈圆形或椭圆形,胞体较大,胞质透亮均匀,细胞核轮廓清楚,呈蓝色。免疫组织化学染色显示,实验组支架材料孔隙内的细胞胞浆可见棕黄色颗粒,细胞周围出现黄染区;对照组无表达。结论BMSCs接种于胶原海绵材料后,经定向软骨诱导后,可向软骨组织方向分化。