不同生物型BVDV感染宿主细胞后差异基因分析

为深入研究牛场中普遍存在的持续性感染,探讨不同生物型牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)转化的分子机制,本试验将致细胞病变型BVDV(CP型BVDV)和非致细胞病变型BVDV(NCP型BVDV)感染MDBK细胞,观察细胞变化,感染后12~72h期间每间隔12h收集1次细胞,同时对24、48h收集的细胞进行转录组学分析。结果显示,不同生物型BVDV感染宿主细胞24h后,与感染NCP型BVDV的细胞相比,感染CP型BVDV的MDBK细胞中上调差异表达的基因2 849个,下调差异表达的基因3 347个,48h后,上调差异表达的基因2 933个,下调差异表达的基因2 831个。对差异基因的GO功能分析结果表明,差异基因参与的分子功能主要有催化活性、结合活性、酶调节活性、分子转导活性和蛋白结合转录因子活性等;Pathway显著性富集分析结果显示,差异表达基因主要参与细胞自噬、细胞凋亡、免疫调节因子等相关的信号通路。本试验结果可为进一步揭示病毒致病的分子机制、控制BVDV和研制其候选疫苗奠定基础。

一步法RT-PCR检测大缸奶在BVDV清除计划中的应用

本文利用一步法RT-PCR对28个牛场共计50份大缸奶样进行了BVDV核酸检测。在与全群抗原检测结果对比后发现,9个已知存有PI牛的泌乳牛群,其大缸奶核酸检测均为阳性,其余41个已知无PI牛的泌乳牛群,除1个因为存在急性感染牛造成阳性结果外,其余40个均为阴性。由此可见,本方法对与泌乳牛群内是否存在PI牛可以做出准确判断,其检测灵敏度和特异性均为100%,阳性预测结果可信度为0.9(9/10),阴性预测结果可信度为0.98(40/41)。此外,针对50个大缸奶样进行的抗体检测表明,对于已感染牛场,泌乳牛群是否存在PI牛,抗体水平没有明显差异(OD1.12±0.12vsOD1.34±0.23,P>0.05)。实验室条件下,本试验使用的RT-PCR方法对于阳性乳的最低检出限为50μL/头,因此理论上,最多可从1000份样品中检出阳性乳成分(总体积为50mL)。综上可知,本试验确立的RT-PCR方法灵敏度高、特异性强,可对泌乳牛群是否存在PI牛进行准确预测,相比大缸奶抗体检测更具实际指导意义,联合ELISA-Ag使用时还可大幅度降低泌乳牛群BVDV清除计划的检测成本,因而值得推广使用。

北京地区规模化牛场BVDV持续感染牛清除方案的初步实施

BVDV持续感染牛(persistently infected,PI)是造成牛群内BVD难以根除的重要原因。为摸清北京地区BVDV-PI牛分布情况,探索BVD清除方案,本次筛查利用抗原捕获ELISA,对北京地区7个规模化奶牛场共14028头荷斯坦奶牛进行BVDV抗原检测。共检出PI牛58头,其中成母牛9头,后备牛49头;场内阳性率0.04～1.02%;PI牛与健康牛相比,平均出生体重相差5.9kg(P<0.05),15月龄时体重相差94.6kg(P<0.05),平均初配月龄和首次怀孕月龄分别延迟2.9个月和4.9个月(P<0.05)。结果表明,PI牛个体发育缓慢且繁殖性能低下,但部分牛临床表现正常。以抗原捕获ELISA为主要检测手段的清除方案是控制BVD的有效方法。

牛病毒性腹泻/黏膜病病毒(BVDV/MDV)的分子生物学研究进展

牛病毒性腹泻/粘膜病病毒(Bovineviraldiarrheavirus/mucosaldiseasevirus,BVDV/MDV)是引起牛病毒性腹泻/粘膜病的病原,与猪瘟病毒(CSFV)、羊边界病病毒(BDV)同属.其基因组由5′非翻译区(5′UTR)、一个大的开放阅读框(ORF)和3′非编码区(3′NCR)组成,编码结构蛋白P14、gP48、gP25、gP53及几种非结构蛋白.下面就BVD/MD的分子生物学研究进展做一综述,以便给该病的进一步防制奠定理论基础.

BVDV SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法与RT-PCR方法的建立与应用

利用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法和RT-PCR方法建立2种有效地实验室检测牛病毒性腹泻病毒的方法。根据Gen Bank中登录的牛病毒性腹泻病毒基因序列,选取14株BVDVⅠ型和7株BVDVⅡ型,经序列比对后,设计合成1对特异性引物,建立了检测BVDV的RT-PCR方法和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。通过对RT-PCR方法和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的特异性、灵敏性和重复性进行检测。结果显示,该方法可从BVDV标准毒株Oregon C24V中扩增出250 bp的特异性片段,对牛细小病毒、牛副流感病毒、牛腺病毒、呼肠孤病毒的扩增结果均为阴性,对BVDV C24V株、GSTZ株、Av69株、S183株和BVDVⅡ型扩增结果为阳性。经对标准毒株的细胞毒进行检测,RT-PCR的灵敏性为10-1TCID_(50)/mL,SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的灵敏性为3.4×102copies/μL。应用2种方法对临床血清样本进行检测,结果比病毒分离方法更为敏感,操作简便。表明建立的RT-PCR方法和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法具有特异、灵敏、高效、快速的特点,可用于BVDV的流行病学监测、实验室检测以及诊断。

分泌抗BVDV McAb杂交瘤细胞株的建立

用牛病毒性腹泻病毒（ＢＶＤＶ） 感染ＭＤＢＫ 细胞，将感染细胞培养物冻融后离心取上清经ＰＥＧ 沉淀浓缩抗原免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，取血清抗体效价高的免疫鼠的脾细胞与ＳＰ２／Ｏ 细胞在ＰＥＧ作用下融合，产生杂交瘤细胞，用间接ＥＬＩＳＡ 法检测杂交瘤细胞生长孔上清，筛选阳性杂交瘤细胞株。以有限稀释法克隆２ ～３次，得到８ 株分泌抗ＢＶＤＶ 的单克隆抗体（ＭｃＡｂ） 杂交瘤细胞株。８ 株ＭｃＡｂ 对ＢＶＤＶ、猪瘟（ＣＳＦＶ） 均呈阳性反应。杂交瘤细胞核内染色体数为９８～１０５ 条。ＭｃＡｂ 属性为：６ 株属ＩｇＧ１ ，２ 株属ＩｇＧ２ａ 。经抗原结合位点分析，８ 株ＭｃＡｂ 可识别３ 个不同的抗原决定位点。将杂交瘤细胞注射ＢＡＬＢ／Ｃ 小鼠腹腔诱生腹水，其抗体效价提高３ ２００ 倍以上，有３ 株腹水单抗的ＥＬＩＳＡ 效价在１∶１０ 万以上，最高ＭｃＡｂ 株达１∶２０ 万。杂交瘤在液氮中保存１～２ ａ 后复苏仍能稳定地分泌抗ＢＶＤ 病毒的ＭｃＡｂ 。所有腹水ＭｃＡｂ 对ＢＶＤＶ 的中和指数均大于５０（ｌｏｇ１０１ ．７），最高达５０１１８（ｌｏｇ１０４．７） 。ＭｃＡｂ

荧光定量RT-PCR和RT-LAMP检测BVDV方法的建立及应用比较

为建立一种快速、灵敏诊断牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)的方法,试验采用RT-LAMP和荧光定量RT-PCR两种检测方法,与通用RT-PCR方法在特异性、灵敏性、样品检出率、试验设计复杂程度、扩增反应效率、使用仪器简单程度和检测成本高低七个方面对BVDV进行了综合性比较分析。结果表明:试验建立的RT-LAMP方法与荧光定量RT-PCR、通用RTPCR方法相比具有特异性强、灵敏度高、样品检出率和扩增反应效率高、操作简便快速、低成本等特点。说明RT-LAMP方法对快速、灵敏诊断牛病毒性腹泻病、防止疫情的扩散具有重要意义。

BVDV与BRV二温式多重PCR检测方法的建立

根据牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛轮状病毒(BRV)的保守基因设计了两对特异引物,并将三温式PCR扩增程序简化为2个温度梯度,建立了用于同时检测BVDV和BRV的二温式多重PCR方法,扩增长度分别为244和385 bp。特异性试验和敏感性试验结果表明,该方法只对BVDV和BRV模板进行扩增,而对其他对照病毒的检测均为阴性;检测灵敏度高,最低能检测到BVDV和RBV各1 pg病毒RNA。建立的BVDV和BRV二温式多重PCR方法,是一种快速、特异、敏感的检测方法。

BVDV-2 E2基因的原核表达及重组蛋白反应原性的研究

为了对BVDV进行诊断,根据GenBank登录的BVDV-2E2基因序列,设计特异性引物,对BVDV-2新疆分离株SW E2基因进行扩增,克隆入T载体中测序,然后亚克隆入BL21(DE3)表达载体pET-28a中,构建重组表达载体pET-28a-E2,并转化入大肠埃希氏菌中。用IPTG进行诱导重组菌,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物。SDSPAGE分析证实表达的重组融合蛋白相对分子量为32ku;Western blot分析表明该重组蛋白可与BVDV-2多克隆抗体发生特异性血清学反应,证实表达的重组E2蛋白具有良好的反应原性,为BVDV-2诊断试剂研发奠定基础。

抗BVDV卵黄抗体的制备

采用牛病毒性腹泻病毒(BVDV)免疫产蛋母鸡,然后用水稀释法成功地从卵黄中分离出抗BVDV免疫球蛋白(抗-BVDV IgY)。建立起测定鸡蛋中特异性抗BVDV活性的间接ELISA方法,并采用此方法检测每次免疫后第10天的抗体滴度。结果表明,蛋鸡在首次免疫后第10天,卵黄中可以检测到抗-BVDV IgY;5次免疫后,抗体效价达到1:6400,半年后仍能维持在该水平。

人参皂苷抗梅花鹿源BVDV研究

[目的]研究人参皂苷抗BVDV作用,为人参的开发与利用提供参考。[方法]采用中性红染料法,研究了人参皂苷的抗BVDV作用。[结果]人参皂苷对MDBK细胞无损伤的最大安全浓度是12.80μg/m l,在1.60～12.80μg/m l范围内人参皂苷抗BVDV效果显著。[结论]人参皂苷具有显著的抗BVDV病毒作用,在安全浓度范围内,人参皂苷抗病毒的作用随浓度的提高而增强。

BVDV基因E_0在人参发根的转化及其分子检测

将重组鹿源BVDV基因E0植物表达载体(pBI121/E0),通过发根农杆菌Ri介导,用叶盘法转化得到人参发根,分别用PCR、RT-PCR检测其转化情况。结果表明:获得了转鹿源BVDV基因E0人参发根,鹿源BVDV基因E0已整合到人参发根基因组中并得到了转录,为研制转基因人参发根疫苗提供了科学依据和材料。

青海牦牛BVDV E0基因的表达与抗原性检测

将青海牦牛病毒性腹泻病毒(BVDV)QHZK株的E0基因亚克隆入原核表达载体pET-32(α),构建了重组表达载体pET-32(α)-E0,然后用重组质粒转化Rosetta(DE3)感受态细胞,并利用IPTG诱导蛋白表达。表达的蛋白用His-Band镍柱进行亲合层析纯化,Western-blot鉴定表达蛋白。结果显示,E0基因可在大肠杆菌中获得表达,表达产物的分子质量约为44ku,与预计的蛋白分子质量大小一致。Western-blot分析表明,该蛋白可以与BVDV标准阳性血清产生特异性结合反应,具有良好的抗原性,为BVDV亚单位疫苗的研究奠定了基础。

五味子乙素抗梅花鹿源BVDV的实验研究

采用中性红染料法,测定了五味子乙素对MDBK细胞的最大安全浓度,探讨了五味子乙素抗梅花鹿源BVDV病毒的作用。结果表明:五味子乙素对MDBK细胞无损伤的最大安全浓度是19.53μg/mL;五味子乙素具有显著抗梅花鹿源BVDV作用,且有一定的量效关系,在安全浓度范围内,随浓度的提高,五味子乙素抗病毒的作用增强。

BVDV对后备牛生长发育状况及繁殖性能的影响

牛病毒性腹泻/黏膜病(BVD/MD)是一种严重危害奶牛健康的病毒性传染病,其病原为牛病毒性腹泻病毒(BVDV)。BVDV感染牛后主要表现两种状态,即一过性感染(TI)和持续性感染(PI)。BVD在牛场的流行,可严重影响奶牛的生产性能、繁殖性能及牛群健康状况,对奶牛的影响可表现为流产、胎儿畸形、腹泻和免疫抑制等。怀孕母牛在特定妊娠阶段感染BVDV后,可娩出PI犊牛,部分PI犊牛能像正常犊牛一样生长发育至成年,但其生长发育状况和繁殖性能较同龄健康牛差异十分明显。为评价BVDV对后备牛生长发育及繁殖状况的影响,笔者采用ELISA方法检出北京地区28个规模化奶牛场141头BVDV-PI牛,并与同龄健康牛生长发育及繁殖数据相比较,结果表明,BVDV-PI后备牛各月龄段的体高、体重均低于健康后备牛,其首次输精日龄、配准日龄、耗精量明显高于健康后备牛,而一次情期受胎率显著低于健康后备牛。数据显示,BVDV严重影响后备牛的生长发育及繁殖状况。

BVDV-2 E2基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

根据GenBank登录的BVDV-2 E2基因序列,设计特异性引物,对BVDV-2新疆SW分离株E2基因进行RT-PCR扩增,克隆入T载体中测序,然后亚克隆入华赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,构建重组表达载体pPIC9K-E2。用SalⅠ酶切线性化重组质粒pPIC9K-E2,电转化酵母GS115,通过G418筛选重组酵母菌GS115-pPIC9K-E2,用φ=1.5%甲醇诱导,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物。SDS-PAGE分析证实表达的重组融合蛋白分子质量为23.2ku;Western blot分析表明,该重组蛋白可与BVDV-2多克隆抗体发生特异性血清学反应,证实表达的重组E2蛋白具有良好的反应原性。

BVDV 1型和2型焦磷酸测序检测方法的建立

为了建立BVDV 1型和2型焦磷酸测序检测方法,用于BVDV的确诊和分型。根据GenBank中发表的BVDV 5'-UTR序列,设计通用扩增引物和分别针对BVDV 1型和2型的两条测序引物。以BVDV 1型BA株和BVDV 2型分离株为模板,用通用引物进行RT-PCR扩增,用测序引物对扩增产物进行焦磷酸测序,建立BVDV 1型和BVDV 2型焦磷酸测序检测方法。结果显示,焦磷酸测序技术检测的序列为30个碱基以上,可用于BVDV的快速鉴定和分型。用该方法对奶牛场86份抗凝血样品进行检测。共检测出2份BVDV 1型,没有检测出BVDV 2型。将检测为阳性的RT-PCR产物测序,测序结果与焦磷酸测序结果一致,符合率为100%。表明本研究建立的BVDV 1型和2型焦磷酸测序检测方法,可用于BVDV的检测和分型,能一次性对待检样品进行确诊,是一种简便、快速的BVDV分型检测方法,对于BVDV的快速确诊具有重要意义。

一株牛病毒性腹泻病毒BVDV-GSLY的分离鉴定

为了解甘肃地区牛病毒性腹泻病毒的流行情况及其分子特征,通过RT-PCR方法对甘肃地区某规模化养牛场的牛腹泻粪便样品进行了BVDV鉴定。将鉴定为BVDV阳性的牛腹泻粪便样品处理后接种到牛肾传代细胞(MDBK)进行病毒的分离,并通过RT-PCR、免疫荧光检测及病毒基因序列测定对分离的病毒进行鉴定及遗传进化分析。结果表明,成功分离到一株牛源BVDV,命名为BVDV-GSLY株;BVDV-GSLY毒株接种MDBK细胞培养可导致明显的致细胞病变效应,说明该毒株为致细胞病变型(CP)BVDV毒株;5′-UTR和Npro PCR扩增结果为阳性且扩增片段与预期大小相符;免疫荧光试验结果表明,接种BVDV-GSLY毒株的MDBK细胞可与FITC标记的BVDV抗体反应产生明亮的特异性绿色荧光,而正常MDBK对照细胞中没有荧光,表明该分离物是BVDV;BVDV-GSLY毒株在MDBK细胞上连续传12代,其病毒滴度可达10^(7.8)TCID_(50)/0.1 mL;基于5′-UTR和Npro核苷酸序列对BVDV-GSLY毒株进行序列比对和遗传进化分析,发现BVDV-GSLY毒株与美国的SD1株亲缘关系最近,5′-UTR核苷酸序列同源性为95.5%,Npro核苷酸序列同源性为91.5%,系统进化树分析也表明,BVDV-GSLY毒株与SD1株位于同一分支,说明BVDV-GSLY毒株属于BVDV-1a基因亚型。本研究成功分离到一株CP型BVDV-1a亚型毒株,不仅丰富了BVDV的分子流行病学数据,也为甘肃地区牛病毒性腹泻病的防控及相关疫苗的研发提供了一定的理论基础。

牛病毒性腹泻—粘膜病病毒(BVDV)的分子生物学研究进展

牛病毒性腹泻—粘膜病病毒(Bovineviraldiarrhea-mucosaldiseasevirus,BVDV)是引起牛病毒性腹泻—粘膜病的病原,欧美牛体中普遍存在轻性或隐性感染,与猪瘟病毒(HCV)、羊边界病病毒(BDV)具有1种共同抗原,有交叉反应,牛体中的抗体检出率高。本文通过对BVDV的分子生物学的概述,总结BVDV最新的分子生物学研究进展,为进一步预防和控制BVDV提供理论依据。

BVDV P7蛋白的原核表达及其生物信息学分析

为了对BVDV-1 P7蛋白进行原核表达及生物信息学分析,采用RT-PCR的方法扩增BVDV NADL株BVDV-1 P7的ORF,扩增产物经Bam H I、Sal I双酶切后插入原核表达载体p EGX4T-1(+),构建P7基因原核表达载体并将其转化至工程菌E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达,并对其进行生物信息学预测。结果表明,成功扩增并构建了BVDV NADL株的BVDV-1 P7原核表达载体,命名p EGX4T-1-P7。SDS-PAGE和Western blot表明,在分子质量34 k Da的位置出现与预期大小一致的蛋白条带;生物信息学结果表明在P7蛋白有信号肽,存在疏水区。该研究成功的表达了P7蛋白,该蛋白是一个疏水性蛋白,为其进一步的功能研究奠定了坚实的基础。