基于drop-off ddPCR方法检测急性髓系白血病C-KIT基因N822位点突变及其临床应用

目的:建立急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)患者C-KIT基因N822位点突变的drop-off微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)定量检测方法,并评价其临床应用价值。方法:针对C-KIT基因第17外显子设计一对引物及探针,优化drop-off ddPCR反应条件及体系,评价该方法的特异性、灵敏度、重复性,使用所建立的方法对140例已行Sanger测序的AML初诊患者骨髓标本进行检测,并用二代测序(next generation sequencing, NGS)验证结果;用drop-off ddPCR对3例阳性患者化疗后C-KIT突变频率进行动态监测。结果:drop-off ddPCR检测C-KIT基因N822位点突变的最适退火温度为54℃,空白检测限为1.62拷贝数/μL,最低检测下限为10.12拷贝数/μL,线性良好。140例AML初诊患者样本中Sanger测序检出2例阳性(1.4%),而ddPCR共检出突变7例(5.0%),突变频率为0.29%~7.41%;进一步应用常规NGS方法对ddPCR阳性样本进行验证,共检出阳性3例(2.1%),等位基因频率为1.26%~8.00%。动态监测3例阳性患者C-KIT突变频率,结果显示治疗达完全缓解时C-KIT突变频率明显下降甚至降低至0。结论:本研究建立了检测C-KIT基因N822位点突变的drop-off ddPCR技术,具有良好的方法学检测性能,其灵敏度高于Sanger测序和NGS,有望用于阳性患者缓解后的可检测残留疾病监测及治疗指导。

再生障碍性贫血患儿C-kit基因表达及其意义

目的 探讨C kit基因与再生障碍性贫血 (再障 )发病的关系。方法 应用免疫细胞化学方法和核酸原位杂交技术检测儿童再障C kit、C kitmRNA表达的变化。结果 1.C kit阳性细胞表达值 (A值 )在慢性再障 (CAA)组、重型再障 (SAA)组和正常对照组分别为 0 .5 2± 8.81、0 .4 6± 2 .18、0 .5 8± 7.94 ,CAA、SAA组与正常对照组比较差异无显著性 (P均 >0 .0 5 )。 2 .C kitmRNA阳性细胞表达值 (A值 )CAA、SAA组和正常对照组分别为 0 .4 7± 6 .0 2、0 .77± 8.0 9、0 .6 1± 3.71。CAA、SAA组与正常对照组比较差异无显著性 (P均 >0 .0 5 )。结论 儿童再障骨髓造血衰竭并非C kit及C

小鼠脊髓挫伤型损伤后caspase-3、bax、bcl-2和c-kit基因的表达

为揭示凋亡相关基因和c-kit基因在脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后的相互关系,利用RT-PCR和免疫组化技术,分别检测了caspase-3、bax、bcl-2、c-kit的mRNA和蛋白在小鼠脊髓损伤后的表达。结果显示:在SCI后4 h开始出现大量的神经元和胶质细胞凋亡,其中促凋亡因子表达增加,而抑制凋亡因子表达量减少。caspase-3的mRNA和蛋白的表达在SCI后开始增加,并在72 h时达到峰值,bax表达规律与之基本一致,但是其峰值出现在24 h。随着时间的变化,bcl-2与c-kit的表达均表现为升高—降低—升高的变化趋势,与caspase-3和bax的变化趋势相反,且其调控作用均发生在caspase-3之前。此外,SCI后c-kit基因也呈现抑制凋亡的作用。表明:损伤是导致脊髓发生凋亡的因素之一;bcl-2是凋亡抑制因子,与bax共同控制细胞凋亡,并直接作用于下游caspase-3的表达。

半夏泻心汤对胃电节律失常大鼠胃壁c-kit基因表达水平的影响

目的 :观察半夏泻心汤及其拆方对胃电节律失常大鼠胃壁组织c kit基因表达水平的影响 ,探讨该方的作用机制。方法 :制备胃电节律失常模型 ,用RT PCR (reversetran scriptivepolymerasechainreaction ,逆转录多聚酶链式反应 )法检测半夏泻心汤及其拆方对胃壁c kit基因表达水平的影响。结果 :各用药组均能下调c kit基因的表达 ,与模型组比较有显著差异 (P <0 0 1 )。结论 :半夏泻心汤治疗心下痞证 (调节胃肠运动 )可能与其调节c kit基因表达有关。

儿童核心结合因子相关性急性髓系白血病中C-KIT基因突变分析

目的分析C-KIT基因突变与儿童核心结合因子相关性急性髓系白血病(CBF-AML)临床特点及预后的关系。方法回顾分析CBF-AML患儿中C-KIT基因突变情况,分析伴随C-KIT基因突变患儿的临床和实验室特点及预后。结果 86例CBF-AML患儿中,35例(40.7%)C-KIT基因突变阳性。inv(16)/CBFβ-MYH11患儿中C-KIT基因8号外显子突变检出率明显高于t(8;21)/RUNX1-RUNX1T1患儿,差异有统计学意义(P<0.01)。与阴性组相比,C-KIT阳性组患儿在性别、年龄、初诊白细胞计数、初诊骨髓幼稚细胞比例、伴随其他基因、髓外白血病、第一疗程完全缓解率等方面的差异均无统计学意义(P> 0. 05)。C-KIT基因突变阳性及阴性组患儿5年无事件生存率分别为82. 8%和76. 4%,总生存率分别为89.3%和85.9%,组间差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 C-KIT基因突变在儿童CBF-AML中发生率高,对CBF-AML患儿的预后无明显影响。

胃肠间质瘤患者肿瘤组织中c-Kit基因和PDGFRA基因突变的分子病理检测分析

目的:探讨胃肠间质瘤(gastrointestinal stomal tumors,GIST)患者肿瘤组织中c-Kit和PDGFRA基因各亚型突变情况的研究。方法:应用直接测序方法检测65例GIST石蜡组织中c-Kit基因9、11、1 3和1 7外显子和P D G F R A基因1 2和1 8外显子突变情况。结果:G I ST肿瘤组织中c-K i t基因总突变率为63.08%(41/65),外显子9、11、13和17的突变率分别为23.08%(15/65)、35.38%(23/65)、1.54%(1/65)和3.08%(2/65);c-Kit基因各外显子之间双重突变共2例(3.08%),其中9外显子与11外显子双重突变1例(1.54%),11外显子与17外显子双重突变1例(1.54%);c-Kit基因11号外显子内双重突变2例(3.08%),三重突变1例(1.54%)。PDGFRA基因总突变率为3.08%(2/65),均为外显子18突变。c-Kit基因和PDGFRA基因双突变共存型1例(1.54%),为c-Kit基因13外显子V654L点突变和PDGFR A基因18外显子D842V点突变。结论:GIST患者中c-Kit基因存在较高的突变率,尤其为9和11外显子突变,其基因突变亚型分类能指导精准医学下伊马替尼的肿瘤靶向治疗,PD GF R A基因突变率和存在两种及其以上突变发生的发生概率虽低但不容忽视。

c-kit基因在慢传输型便秘大鼠胃肠道的表达

目的探讨c-kit基因在慢传输型便秘(STC)模型大鼠胃肠道的表达。方法选取24只健康Wistar大鼠,随机分为实验组和对照组。实验组予以每日复方地芬诺酯混悬液(8 mg/kg)灌胃制造STC模型,对照组予以同等剂量的生理盐水灌胃。每5 d记录1次大鼠大便粒数、大便干重及大鼠体质量。分别饲养60 d及90 d后停药1周,测定胃肠道传输时间。大鼠解剖后选取胃窦、小肠、结肠组织,运用RT-PCR方法检测组织中c-kit基因表达情况。结果实验组日均粪便粒数小于对照组,平均每粒粪便质量大于对照组,差异均有显著性意义(P<0.05)。实验组首粒黑便排出时间长于对照组,差异有显著性意义(P<0.05)。两组大鼠胃窦组织c-kit基因60 d与90 d时差异均无显著性意义;两组大鼠小肠组织c-kit基因60 d时实验组与对照组差异无显著性意义,90 d时差异有显著性意义;两组大鼠远端结肠组织c-kit基因60 d及90 d时实验组与对照组比较差异均有显著性意义。结论在STC模型中,胃窦c-kit基因表达变化不明显,小肠c-kit基因表达有减少趋势,远端结肠c-kit基因表达明显降低,可能是STC大鼠的主要病理生理机制。

胃肠道间质瘤临床病理及c-KIT基因检测

目的探讨胃肠道间质瘤(Gastrointestinal stromal tumors,GIST)的临床病理、免疫组织化学和c-KIT基因突变情况。方法收集我院2010年4月至2012年12月收治的26例经手术切除病理确诊的GIST患者,对26例病例采用免疫组织化学行c-KIT蛋白(CD117)、CD34、平滑肌肌动蛋白(SMA)、人S100蛋白(S-100)检测,以确诊为GIST。采用直接测序方法对c-KIT基因11、9、13、17号的外显子突变进行序列分析。结果 26例病例中CD117阳性为22例,共14例(53.8%)检测到c-KIT突变,第11外显子是KIT基因最常见的突变位点,检测到的突变形式主要有缺失突变,点突变和插人突变,均为杂合性突变。结论 CD117阳性及c-KIT突变是GIST的普遍现象,突变位点有集中趋势,以梭形细胞型突变最常见。

小细胞肺癌c-Kit基因蛋白的表达及其与预后的关系

目的:探讨c-Kit基因蛋白在小细胞肺癌(SCLC)中的表达及其与临床病理、预后的关系。方法:采用免疫组化方法,检测63例手术切除SCLC中c-Kit蛋白的表达,并分析其与患者的生存率及其它相关临床资料的关系。结果:63例c-Kit蛋白的阳性表达率为56%(35/63)。c-Kit蛋白的表达与SCLC患者性别、年龄、肿瘤分期以及生存率无明显相关。结论:SCLC的发生发展与c-Kit基因蛋白表达密切相关;与SCLC患者预后尚无确切的相关性。

骶骨胃肠间质瘤的临床病理学特点、克隆性及c-kit基因突变分析

目的:探讨发生于骶骨的胃肠间质瘤(gastrointe stinalstromal tumor,GIST)的临床病理学特点、c-kit基因突变情况及克隆性.方法:手术切除标本经常规HE染色和免疫组化染色观察确诊后,应用显微切割技术分离病变及病变周围纤维结缔组织,提取基因组DNA,再进行c-kit基因外显子9、11、13和17的PCR扩增和测序.同时利用女性X染色体失活的嵌合性和磷酸甘油酸激酶(phosphoglycerate kinase,PGK)和雄激素受体(androgen receptor,AR)基因位点的多态性进行克隆性检测.结果:光镜下瘤细胞主要为梭形,呈束状、编织状或旋涡状排列;胞质丰富,嗜酸性或中性;细胞核杆状或长梭形,核分裂像罕见.免疫组化标记瘤细胞表达CD117和CD34强阳性.PCR产物直接测序检测揭示c-kit基因外显子11有突变发生,而外显子9、13和17均无突变.克隆性检测结果示GIST为单克隆性病变.结论:GIST是肿瘤性病变;发生于骶骨的GIST的诊断需要通过免疫组化来确诊,并行c-kit基因扩增的检测以及测序进一步证实.

胃肠道间质瘤c-kit基因突变体的研究

目的:研究突变型c-kit基因对细胞增生及细胞周期的影响从而揭示突变型c-kit基因对人体细胞的恶性转化作用. 方法:将构建于pcDNA3的突变型c-kit cDNA和野生型c-kit cDNA重组质粒及空白pcDNA3质粒(空白对照)通过脂质体法稳定转染人胚胎肾细胞(human embry- onic kidney cell.HEK)细胞.用Western blot方法检测c-kit蛋白的表达情况,观测转染细胞的生长曲线变化。用MTT法检测细胞增生活性的变化,并用流式细胞仪检测c-kit基因突变体对细胞周期的影响. 结果:与阴性对照、空白对照相比,实验组细胞生长速度明显增快,细胞增生活性明显增强,细胞周期检测显示:实验组和阳性对照组处于增生期细胞(S+G2-M) 比例明显高于阴性对照组和空白对照组,各组处于增生期的细胞比例依次为:48.34%(实验组)、48.2496(阳性对照组)、42.03%(阴性对照组)、42.16%(空白对照组). 结论:c-kit基因突变可使人类细胞的增生活性明显增强, 并可以使更多的细胞由静止期进入增生期,提示c-kit基因突变有可能是引起GIST的恶性转化的关键机制之一.

胃肠道间质瘤c-kit基因全部外显子的突变研究

目的 c-kit基因全部外显子在胃肠道间质瘤疾病中的突变情况,并探讨其意义.方法 收集2010年9月至2012年12月胃肠道间质瘤手术切除标本62例,其中胃间质瘤41例,小肠14例,直肠4例,结肠1例,腹膜2例,年龄20～82岁,男性40例,女性22例,中位年龄54岁,术前筛查均无GIST家族史,患者术前均未接受过放疗或化疗,都是经术中病理报告和最终石蜡切片病理报告确诊的GIST标本.设计特异性PCR引物,用肿瘤组织提取的DNA为模板进行PCR扩增后测序,研究c-kit基因突变在胃肠道间质瘤组织中的突变规律.结果 在62例胃肠道间质瘤组织标本中有53例c-kit基因发生突变,突变率85.5%（53例/62例）,PCR产物突变率为3.8%（62例/1612例）,外显子2突变6例（9.7%）,外显子8突变7例（11.3%）,外显子10突变14例（22.6%）,外显子11突变8例（12.9%）,外显子21突变27例（43.5%）.此外第21号外显子有8例位于c-kit基因第80778位点的C突变成T,有19例位于c-kit基因第80846位点的G突变成A.结论 胃肠道间质瘤中c-kit基因突变率高达85.5%,表明c-kit基因突变可能对胃肠道间质瘤的发生发展起重要作用.

体外Cajal样细胞c-kit基因mRNA在高糖环境下表达变化及意义

目的:观察体外高糖环境下Cajal样细胞(interstitial cells of Cajal-like,ICCs)c-kit mRNA表达变化。方法:胶原酶消化法原代分离培养豚鼠膀胱ICCs,加入含葡萄糖浓度分别为5mmol/L、15mmol/L、30mmol/L培养基培养24h、48h、72h后,应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测高糖环境下c-kit基因mRNA表达水平的变化。结果:RT-PCR电泳经分析显示15mmol/L、30mmol/L组ICCs c-kit mRNA表达较5mmol/L组降低(P<0.01),72h组较24h组、48h组表达降低。结论:高糖环境造成ICCs c-kit基因mRNA表达水平降低,可导致ICCs的SCF/c-kit信号通路异常,ICCs功能及结构障碍,可能是糖尿病膀胱病变的发病机制之一。

急性白血病FLT3/ITD、C-Kit基因突变预后相关性的研究

目的探讨FLT3内部串联重复(internal tandem duplication,ITD)与C-Kit基因突变与急性白血病突变预后相关性。方法利用PCR扩增技术结合DNA测序技术分析33例急性髓系白血病(AML),13例急性淋巴细胞白血病(ALL),急性混合细胞白血病6例患者骨髓单个核细胞中FLT3/ITD基因与C-Kit基因突变率,分析FLT3/ITD基因与C-Kit基因突变阳性患者的表达水平及疗效。结果急性髓系白血病(AML)患者的FLT3/ITD基因及C-Kit基因平均表达水平高于急性淋巴细胞白血病患者(P<0.05)。33例初治急性白血病FLT3/ITD阳性及C-Kit阳性的患者治疗后缓解率低于阴性患者。结论 FLT3/ITD及C-Kit基因是急性白血病中常见的基因突变类型,均属于III型受体酪氨酸激酶家族成员,与白血病的发生及预后有相关性。

胃肠道间质瘤c-kit基因突变的研究(摘要)

目的探讨c-kit基因在胃肠道间质瘤(GIST)中的突变状况。方法用PCR扩增和基因测序的方法，检测52例GIST及28例对照肿瘤c-kit基因第11号外显子序列，其中30例GIST另检测了c-kit基因第9和第13号外显子序列。结果25例亚性GIST中，14例有c-kit基因11号外显子突变(56．0％)；27例良性及交界性GIST中，仅2例有突变(7．4％)。良恶性GIST中，

胃肠道间质瘤的c-kit基因突变检测

目的探讨CD117阳性的胃肠道间质肿瘤（GIST）c-kit基因突变分布及类型。方法采用免疫组化技术,对10例GIST标本行CD117、CD34、SMA和S-100检测,以确诊为GIST;采用PCR技术对CD117阳性的GIST进行c-kit基因突变检测;采用直接测序方法对突变c-kit基因11、9、13和17号的外显子突变进行序列分析。结果4例成功提取了肿瘤DNA,其中3例检出了c-kit基因突变,均分布于第11号外显子,均为557-558（WK）的缺失性突变;其中2例为纯合子性突变,1例为杂合子性突变。结论CD117阳性的GIST通常有c-kit基因突变,其11号外显子是经典分布热点,变异纯合子和杂合子突变为常见类型。

黑素再生中药对体外培养的黑素细胞酪氨酸酶基因和c-kit基因表达的影响

目的：分析黑素再生中药对体外培养的黑素细胞酪氨酸酶（Tyr）和c-kit基因表达的影响。方法：按照Halaban方法培养黑素细胞，传代至3～5代细胞用于实验；用黑素再生中药分别配制不同浓度的TICVA培养基。分散酶消化传代后第2天加入所配培养基，仔细观察细胞形态和生长状况，5d后计数；采用Bio-Rad蛋白分析试剂盒方法检测蛋白含量；蛋白质印记参照Halaban等方法。结果：高浓度黑素再生中药具有一定的细胞毒性，而8mg·mL-^1以下黑素再生液细胞毒性很小；黑素再生中药组细胞可溶性总蛋白质量浓度与对照组细胞可溶性总蛋白浓度，无显著差异（P＞0.05），但细胞可溶性总蛋白提高了6.7％；在等量的总蛋白中，黑素再生中药处理后的Tyr的含量增加了5.3％，黑素再生中药组c-kit表达增加了88.9％。结论：黑素再生中药治疗白癜风可能与Tyr基因的蛋白表达有一定的关联，对c-kit表达具有极显著的促进作用。

髓系白血病患者SHP-1与c-kit基因检测的临床意义

目的探讨造血细胞磷酸酶(SHP-1)基因与原癌基因c-kit在髓系白血病患者中的表达,以及其与白血病发生和预后的关系。方法用半定量逆转录-聚合酶链反应法检测67例髓系白血病患者(患者组)及33例正常对照组的白细胞SHP-1与c-kitmRNA表达。结果患者组中,急性髓系白血病(AML)、慢性粒细胞白血病慢性期(CML-CP)和急变期(CML-BP)患者的SHP-1平均表达水平均低于对照组(P<0.05);CML-CP患者的c-kit平均表达水平高于对照组,CML-CP和CML-BP患者比较有统计学差异(P<0.05);34例初治AML患者中,SHP-1+的完全缓解率高于SHP-1-,而c-kit则相反。SHP-1+c-kit+的完全缓解率高于SHP-1-c-kit+。结论SHP-1可能作为潜在的抑癌基因与c-kit基因参与白血病的发病,检测SHP-1与c-kit基因表达可作为判断髓系白血病患者预后的指标。

恶性上皮性肿瘤中c-kit基因蛋白表达意义探讨

目的：了解恶性上皮性肿瘤c-kit基因蛋白表达分布及其意义。方法：回顾我院及南京军区福州总医院2005-08～2006-08共634例外科手术切除病检标本，免疫组化检测CD117在恶性上皮性肿瘤表达。结果：CD117阳性癌症患者共16例。胃肠道癌8例，其中1例为复发性癌，乳腺癌6例，肺癌2例。结论：少数恶性上皮性肿瘤c-kit基因蛋白表达，可能提示部分恶性上皮性肿瘤的格列卫用药指征。

哺乳动物毛色候选基因c-KIT的研究进展

哺乳动物的皮毛颜色主要受毛发中黑色素的种类和数量影响。c-KIT基因编码一种酪氨酸激酶跨膜受体,被称为肥大/干细胞生长因子受体,与黑色素生物合成相关。c-KIT基因突变会抑制干细胞生长因子受体功能,导致黑色素细胞的生成、成熟、增殖、分化和迁移等过程受到影响。本文就哺乳动物毛色形成的机制和主效基因、c-KIT基因的作用机理及其对哺乳动物毛色的影响进行综述,以期为深入研究哺乳动物毛色遗传机制以及不同毛色的选种和选育提供参考依据。