叶酸通过JNK/p38 MAPK信号通路调节小鼠C2C12成肌细胞分化

目的:观察叶酸(folic acid,FA)对小鼠C2C12成肌细胞增殖和分化的影响并探讨其作用机制。方法:(1)在小鼠C2C12成肌细胞增殖阶段,采用不同浓度(0、2.5、5、10和20μmol/L)的FA处理C2C12细胞,显微镜下观察各组细胞的状态,MTT法检测细胞活力,EdU法检测细胞增殖情况。(2)在小鼠C2C12成肌细胞分化阶段,将细胞分为对照(control,Ctrl)组(0μmol/L FA)和FA组(10μmol/L FA),于分化的第2天和第4天,采用免疫荧光染色和Western blot检测成肌细胞分化相关蛋白成肌细胞决定蛋白1(myoblast determination protein 1,MyoD)、成肌蛋白(myogenin,MyoG)和肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MyHC)的表达水平,并统计各组细胞肌管形成情况。(3)在小鼠C2C12成肌细胞分化第4天时,加入FA处理0、1、3和6 h,采用Western blot检测各时点c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、磷酸化JNK(phosphorylated JNK,p-JNK)、p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)和磷酸化p38 MAPK(phosphorylated p38 MAPK,p-p38 MAPK)蛋白水平。(4)将分化4 d的小鼠C2C12成肌细胞分为Ctrl组、FA组、SP600125(JNK特异性抑制剂)组、SB2035805(p38 MAPK特异性抑制剂)组、FA+SP600125组和FA+SB203580组。C2C12成肌细胞先接受10μmol/L的SP600125或SB203580处理1 h,再经10μmol/L的FA处理24 h,FA组经10μmol/L FA处理24 h,Ctrl组不作处理。采用Western blot检测p-JNK、JNK、p-p38 MAPK、p38 MAPK和MyHC蛋白水平。结果:(1)与0μmol/L FA组相比,其余各浓度组的细胞数量明显增多,细胞活力显著提高(P<0.05),EdU阳性细胞率均显著增加(P<0.05)。(2)与Ctrl组相比,FA组MyoD、MyoG和MyHC的表达水平均显著提高(P<0.05),肌管融合指数显著增加(P<0.05或P<0.01)。(3)与0 h组相比,FA处理1、3和6 h后p-JNK/JNK和p-p38 MAPK/p38 MAPK的比值均显著升高(P<0.05或P<0.01),且随着处理时间的延长,p-JNK/JNK和p-p38 MAPK/p38 MAPK的比值呈现逐渐升高的趋势。(4)与Ctrl组相比,FA组p-JNK、p-p38 MAPK和MyHC蛋白水平显著升高(P<0.01);与FA组相比,FA+SP600125组p-JNK和MyHC蛋白水平显著降低(P<0.05),FA+SB203580组p-p38 MAPK和MyHC蛋白水平显著降低(P<0.05或P<0.01)。结论:FA可以通过激活JNK/p38 MAPK信号通路促进小鼠C2C12成肌细胞分化。

SR9009联合吲哚丙酸通过核因子κB信号通路减轻C2C12成肌细胞的炎症反应

背景:钟基因Rev-erbα参与调节炎症,但激活Rev-erbα会增加心脑血管疾病风险。为降低相关风险,探索Rev-erbα激动剂SR9009联合其他药物来减轻骨骼肌成肌细胞炎症,奠定治疗炎症相关性骨骼肌萎缩的理论基础。目的:探讨脂多糖刺激C2C12成肌细胞时吲哚丙酸、SR9009与核因子κB信号通路的关系。方法:①1μg/mL脂多糖刺激C2C12成肌细胞,RNA转录组测序结合KEGG通路富集分析信号通路。②CCK-8法检测C2C12成肌细胞活性,筛选吲哚丙酸的最佳给药浓度;然后将细胞分为空白对照组、脂多糖(1μg/mL)组、SR9009(10μmol/L)+脂多糖组、吲哚丙酸(80μmol/L)+脂多糖组、吲哚丙酸+SR9009+脂多糖组,ELISA检测细胞上清液中白细胞介素6水平,RT-qPCR检测白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、Toll样受体4、CD14 mRNA表达,Western blot检测NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达。③siRNA敲减Rev-erbα,RT-qPCR评估敲减效率,检测白细胞介素6、肿瘤坏死因子αmRNA表达。结果与结论:①与空白对照组比较,脂多糖时间依赖性抑制成肌细胞融合形成肌管,白细胞介素6、肿瘤坏死因子αmRNA表达水平升高,细胞上清液中白细胞介素6水平显著升高;KEGG通路分析支持脂多糖刺激激活核因子κB信号通路。②吲哚丙酸浓度>80μmol/L时抑制C2C12成肌细胞活性;吲哚丙酸和SR9009通过抑制核因子κB信号通路发挥抗炎作用,降低白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、Toll样受体4、CD14 mRNA表达水平,p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表达比值低于脂多糖组。SR9009联合吲哚丙酸显著降低脂多糖诱导的炎症,Toll样受体4、CD14、白细胞介素6和肿瘤坏死因子αmRNA表达水平进一步下调,p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表达比值显著低于吲哚丙酸+脂多糖组和SR9009+脂多糖组。③Rev-erbα随脂多糖刺激时间依赖性升高;siRNA敲减Rev-erbα效率达58%以上,成功敲减Rev-erbα后添加脂多糖,白细胞介素6和肿瘤坏死因子αmRNA表达较脂多糖组显著上调。④结果说明,Rev-erbα可以作为调节炎症反应的靶点,SR9009靶向激活Rev-erbα联合吲哚丙酸能抑制核因子κB信号通路显著减轻C2C12成肌细胞的炎症反应,联合抗炎效果优于单独干预。

Brd2通过Wnt/β-catenin信号通路调控小鼠C2C12成肌细胞的分化

目的 探究溴结构域蛋白2(bromodomain containing 2,Brd2)对小鼠C2C12成肌细胞分化能力的影响及作用机制。方法 通过GEO数据库分析Brd2在肌营养不良患者和健康人骨骼肌组织中的表达水平。用含2%马血清的分化培养基体外诱导C2C12成肌细胞分化,利用Western blot检测分化过程中Brd2的表达。利用慢病毒介导的过表达和RNA干扰技术在C2C12成肌细胞中分别过表达和敲低Brd2,诱导后用细胞免疫荧光实验检测肌管形成情况,通过Western blot检测分化标志物蛋白表达水平的变化。通过转录组测序及相关实验探究Brd2在上述过程中发挥调控作用的分子机制。结果 Brd2在肌营养不良患者的骨骼肌中低表达;体外诱导C2C12成肌细胞分化,第2天时Brd2表达升高,第8天时表达降低;敲低Brd2可以抑制成肌细胞的分化,过表达Brd2则可以促进成肌细胞分化;Wnt/β-catenin信号通路的活性受到Brd2的调控。结论 Brd2通过Wnt/β-catenin信号通路调控成肌细胞的分化,初步提示Brd2可能有利于骨骼肌的再生。

“神舟10号”空间飞行对骨骼肌C2C12成肌细胞可塑性的影响

目的研究空间飞行对骨骼肌C2C12成肌细胞增殖和分化可塑性的影响。方法利用"神舟10号"飞船(Shenzhou-10,SZ-10)舱内环境,开展空间细胞学实验,并在地面同步模拟空间舱环境进行实验。进行天基与地基实验细胞的同步活细胞影像监测和细胞固定,天基实验细胞返回后与地基细胞同步开展细胞影像与免疫细胞化学的对比分析。结果 1)活细胞影像监测提示,与地基培养细胞相比,天基细胞培养48 h单核细胞(增殖)减少,且96 h仅见地基培养细胞中出现多核肌管(分化)。2)免疫细胞化学分析表明,地基细胞48 h增殖标志蛋白Myo D表达显著增加,96 h有所下降,而天基培养细胞Myo D表达均显著减少;3)地基实验中48 h细胞开始融合分化,中间结蛋白Desmin阳性单核细胞数目明显增加,但在分化96 h后,Desmin阳性单核细胞数目减少,而3个核以上的肌管明显粗大且数目较多;而天基细胞48 h虽有Desmin阳性单核细胞,但比地基阳性细胞数目明显较少,分化96 h后肌管融合率(约30%)比地基96 h(约78%)显著减少。结论空间飞行期间骨骼肌成肌细胞增殖分化的可塑性显著降低,这可能参与了空间飞行中失重性肌萎缩的形成。

周期性机械拉伸对C2C12成肌细胞增殖的影响

目的:探讨不同的周期性拉伸应变条件对C2C12成肌细胞增殖的影响。方法:周期性拉伸的各种力学条件通过BioFlex加载系统实现,采用应用流式细胞术和BrdU法对拉伸应变下的细胞增殖动力学变化进行分析,反映成肌细胞增殖情况。结果:不同的周期性机械拉伸条件影响C2C12细胞的增殖,拉伸的频率对C2C12细胞增殖有较大的影响。在0.5Hz拉伸频率下,2.5%、5%和10%的细胞变形幅度都不能促进细胞的增殖,其中10%(0.5Hz)的拉伸幅度抑制C2C12成肌细胞的增殖;而在0.125Hz拉伸频率下,10%的细胞变形幅度明显地促进C2C12成肌细胞的增殖。结论:较低的拉伸频率有利于成肌细胞的增殖,高频率的拉伸抑制成肌细胞的增殖。

ShRNA介导的Smad4基因沉默对C2C12成肌细胞纤维化的影响

目的:研究慢病毒介导的Smad4-shRNA对TGF-β1诱导的纤维化进程的影响。方法:(1)设计并选择抑制效能最高的Smad4-shRNA,包装生产慢病毒,转染C2C12成肌细胞,并检测转染后细胞的Smad4表达;(2)根据TGF-β1诱导C2C12成肌细胞向成肌纤维细胞分化的模型,以慢病毒介导的Smad4-shRNA转染细胞,将不同处理的细胞分为A、B、C、D四组,分别为C2C12细胞组、TGF-β1诱导组、C2C12细胞转染组和TGF-β1诱导后转染组。通过荧光Realtime-PCR和Westerblot检测各组collagen I和α-SMA表达水平。结果:(1)慢病毒介导Smad4-shRNA1转染C2C12细胞后,其Smad4 mRNA和蛋白表达显著低于未转染组(P<0.05);(2)TGF-β1诱导组α-SMA和Collagen I mRNA及蛋白表达均显著高于C2C12细胞组(P<0.05);(3)TGF-β1诱导后转染组α-SMA与collagen I mRNA及蛋白表达显著低于TGF-β1诱导组(P<0.05),与C2C12细胞组和C2C12细胞转染组相比则无明显差异(P>0.05)。结论:降低Smad4表达能有效抑制成肌细胞及受TGF-β1诱导成肌纤维细胞的纤维化过程,提示Smad4可能成为拮抗骨骼肌纤维化的靶点。

干扰E2F7对C2C12成肌细胞增殖的影响

【目的】探究转录因子E2F7在骨骼肌细胞发育过程中的作用。【方法】以C2C12成肌细胞为研究对象,通过设计小干扰RNA干扰C2C12成肌细胞中E2F7的表达,分为干扰组和对照组,并利用RT-PCR、CCK-8和EdU等技术检测在C2C12成肌细胞中干扰E2F7后对成肌细胞增殖的影响。【结果】E2F7 mRNA表达水平在C2C12成肌细胞增殖期极显著高于分化期(P<0.01);与对照组相比,干扰组的细胞活率和新生细胞比率皆极显著高于对照组(P<0.01);干扰E2F7显著提升了C2C12成肌细胞中Cyclin E的表达水平(P<0.05),极显著促进Cyclin D和CDK4的表达(P<0.01);并且干扰E2F7可显著促进E2F2 (P<0.05)和极显著促进E2F1及E2F3的表达(P<0.01),同时极显著促进与成肌细胞增殖相关microRNAs (miR-7、miR-25、miR-27和miR-92a)的表达(P<0.01)。【结论】干扰E2F7可促进C2C12成肌细胞的增殖,E2F7可能是通过调控经典E2Fs信号通路和成肌细胞增殖相关microRNA发挥作用。

Reversine对小鼠C2C12成肌细胞增殖与分化作用的初步研究

目的初步探讨Reversine对小鼠C2C12成肌细胞增殖分化的影响。方法体外培养C2C12成肌细胞系.实验第一步分三组:A组:正常对照组,B组:1μM Reversine处理12h组,C组:1μM Reversine处理24h组。上述三组用Annexin-V/PI双染法处理C2C12成肌细胞并用流式细胞仪技术检测三组C2C12细胞凋亡的影响;实验第二步分五组:D组:正常对照组,E组:单独1μM Reversine处理7d,F组:单独成骨诱导7d,G组:1μM Reversine诱导12h+单独成骨诱导7d,H组:1μM Reversine诱导12h+1μM Reversine联合成骨诱导7d。上述五组光镜下观察细胞形态的变化,并通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测五组C2C12成肌细胞分化抑制因子(ID2),肌肉发生调节因子(Myogenin),生肌因子后结蛋白(Desmin)mRNA的表达。结果与A组相比,C组1μM Reversine处理24h能引起C2C12细胞明显的凋亡,B组1μM Reversine处理12h的C2C12细胞未见明显的凋亡。与D组相比,E组和H组的细胞增殖明显受到抑制,F组和G组细胞逐渐增殖并融合。结论 Reversine能够显著的抑制成肌细胞的增殖分化过程。

周期性张应力对C2C12成肌细胞增殖的影响

背景:在力学刺激下,肌肉组织发生改建,其中的成肌过程是一个多阶段的发育过程,细胞外基质的许多信号参与了成肌过程,其中力学信号是肌肉形成和再生的重要外界因子。目前国内外有许多关于周期性张应力刺激成肌细胞凋亡和增殖的报道,但是力学刺激在成肌作用中的具体机制目前还明确。目的:探讨周期性张应力对C2C12成肌细胞增殖的作用及影响机制。方法:采用FX4000T应力加载系统对体外培养的C2C12成肌细胞施加10%的周期性张应力,分别作用6,12,24 h。结果与结论:MTT结果显示,随着加力时间的延长C2C12成肌细胞的增殖情况及S期的细胞周期率逐渐增加,在应力作用12 h时增殖效果最明显(P<0.05),随后开始降低。Western blot检测显示,C2C12成肌细胞中核转录因子κB蛋白的表达随加力时间增加而不断减少,加力24 h时表达量又开始上升。结果提示,周期性张应力可以诱导C2C12成肌细胞增殖,能够改变其细胞周期,核转录因子κB可能也参与了此调节过程。

力学信号的拮抗剂或激动剂对体外培养的C2C12成肌细胞自身抗原相关因子表达的影响

目的探讨力学信号的拮抗剂或激动剂对体外培养的C2C12成肌细胞自身抗原表达的影响。方法根据不同的处理方法将C2C12细胞分成对照组、EGTA、A23187、钙调蛋白抑制剂calmidazolium chloride、钙调蛋白(calmodulin)、一氧化氮合成酶抑制剂NG-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)、硝普钠(SNP)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、MMP-2抑制剂1、重组肝细胞生长因子(HGF)、抗HGF抗体、肝细胞生长因子受体C-met和抗C-met处理组。用Western blot法检测不同处理条件下NuRD脱乙酰酶复合物可重构成分(Mi-2)、组氨酰-tRNA合成酶(HRS)、DNA依赖蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)和Ku-70蛋白的表达变化。结果与对照组相比,A23187、calmodulin组、SNP、重组HGF组、重组C-met处理后,自身抗原表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),EGTA、calmidazolium chloride、L-NAME、抗HGF兔多克隆抗体、抗C-met兔多克隆抗体处理后,自身抗原蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。MMP-2组的自身抗原蛋白水平表达与对照组相比无显著性差异(P>0.05)。结论细胞外钙离子和钙调蛋白、L-NAME和SNP、HGF、C-met参与介导成肌细胞自身抗原的表达。

MyHC基因在C2C12成肌细胞分化过程中的时序表达

以体外培养的C2C12成肌细胞为研究对象,然后利用荧光定量PCR检测肌球蛋白重链(myosin heavy chains,MyHC)的3种亚型MyHC1、MyHC2x和MyHC2b在成肌诱导分化中(0-8 d)中的时序表达规律.结果表明,MyHC1基因在诱导分化的0-4 d表达呈上升趋势,4-8 d又呈下降趋势,在第4 d和第6 d的表达水平显著高于其他天数(p<0.05).MyHC2x基因在诱导分化的0-6 d表达呈上升趋势,但在第8 d又开始下降.MyHC2b在诱导分化的0-8 d中表达一直呈上升趋势,第6 d和第8 d表达水平显著高于其他天数(p<0.05).

PGC-1α对C2C12成肌细胞增殖的影响

PGC-1α(Peroxisome Proliferators Activated Receptor gamma coactivator 1 alpha)是一种核受体转录辅助激活因子,广泛参与机体的生物氧化和能量代谢活动.本实验以小鼠C2C12成肌细胞为材料,通过转染pc DNA3.1-flag-PGC-1α真核表达载体,并且与转染空载体的实验对照组比较,利用荧光定量PCR检测转染效果,利用MTT比色法检测PGC-1α对成肌细胞增殖的影响;结果显示,PGC-1α在C2C12成肌细胞中被成功超表达,在转染后的2-5 d,转染真核表达载体组与转染空载体组相比,显著抑制细胞增殖(P<0.05),但在第6 d差异不显著.

miR-143-3p促进C2C12成肌细胞分化

MicroRNAs(miRNAs)是一类小非编码RNA,近年研究发现其在骨骼肌发育调控中发挥重要作用.为探明miR-143-3p在C2C12成肌细胞分化中的调控作用,采用real-time PCR检测了miR-143-3p在小鼠各组织及C2C12成肌细胞分化过程中的表达;使用miR-143-3p的模拟物和特异性抑制剂分别处理细胞,采用real-time PCR和Western印迹分别检测成肌因子MyoG和成肌标志基因MyHC mRNA和蛋白水平的变化;用免疫荧光染色的方法观察肌管的形成.结果显示,miR-143-3p在小鼠各组织中均有表达,并且随着细胞分化表达量逐渐增加;C2C12成肌细胞过表达miR-143-3p,与对照组相比,成肌调控因子MyoG和成肌标志基因MyHC的mRNA和蛋白表达均显著升高,肌管数量明显增多;抑制剂处理结果显示,细胞分化被显著抑制.检测miR-143-3p对MyHC各亚型表达的影响发现,miR-143-3p表达的变化并不直接影响MyHC各亚型的表达.以上结果说明,miR-143-3p在骨骼肌和成肌细胞中均有表达,能够促进C2C12成肌细胞分化,但并不直接调控MyHCs的表达.

铅导致C2C12成肌细胞的氧化应激和凋亡损伤

通过细胞毒性实验、氧化应激检测和凋亡检测，研究醋酸铅（1ead acetate）对C2C12成肌细胞的毒性机理，结果表明，醋酸铅（10~200μmol／L）呈剂量依赖模式显著增加C2C12成肌细胞的乳酸脱氢酶（LDH）释放量、上调活性氧（ROS）、下调过氧化氢酶（CAT）活力，导致胞内DNA损伤严重，流式细胞仪检测细胞周期结果显示高剂量醋酸铅处理细胞48h后，出现凋亡峰；蛋白印迹结果显示，与正常组相比，抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调、促凋亡蛋白Bax表达上调、Caspase-3酶活力上调，综上结果表明醋酸铅导致的细胞毒性可能与氧化应激和凋亡损伤相关．

香烟烟雾提取物下调小鼠C2C12成肌细胞组蛋白去乙酰化酶2表达并增强炎性细胞因子释放

目的 观察香烟烟雾暴露后, 小鼠C2C12成肌细胞内炎症介质、 组蛋白去乙酰化酶2（HDAC2）和核因子κB（NF-κB）的变化。方法 培养小鼠C2C12成肌细胞, 用香烟烟雾提取物（CSE）进行处理。采用MTT法观察CSE对细胞生长的影响, 以确定作用于细胞的合适浓度。将培养6-7 d的C2C12细胞接种到6孔板, 分为对照组和（6.25、12.50、25.0）mL/L CSE组, 培养24 h。ELISA测定各组细胞上清液白细胞介素8（IL-8）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的含量; 实时定量PCR（qRT-PCR）检测各组细胞HDAC2 mRNA的表达; Western blot法检测各组细胞中HDAC2的蛋白相对表达量; 免疫共沉淀技术检测细胞内HDAC2/NF-κB复合物。结果MTT结果提示终浓度为50 mL/L的CSE抑制C2C12细胞的生长; CSE刺激24 h后, C2C12细胞IL-8和TNF-α释放增加, HDAC2的mRNA及蛋白相对表达量减少, 并在一定程度上具有浓度依赖性; 免疫共沉淀技术证实存在HDAC2/NF-κB复合物。结论 CSE下调C2C12细胞HDAC2表达, 引起炎症因子释放增加。

香烟提取物通过减少HDAC2表达诱导小鼠C2C12成肌细胞衰老

目的:探讨香烟提取物(CSE)能否引起小鼠C2C12成肌细胞衰老,并研究成肌细胞衰老与组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)的关系。方法:培养C2C12细胞株,分化为成熟成肌细胞,观察CSE干预对成肌细胞衰老和HDAC2表达的影响,采用real-time PCR和Western blot方法分别检测HDAC2 mRNA和蛋白的表达;β-半乳糖苷酶染色检测衰老细胞的百分率。结果:MTT法测定最佳CSE浓度与干预时间分别为60 m L/L和24 h。CSE干预后β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数增加,同时伴有HDAC2 mRNA和蛋白表达的减少。四溴苯三唑(TBB)在促进HDAC2 mRNA和蛋白表达的同时,β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数减少;用HDAC2的特异性阻滞剂丙戊酸抑制HDAC2 mRNA和蛋白的表达时,β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数增加。结论:香烟提取物可通过减少小鼠C2C12成肌细胞HDAC2的表达促进细胞老化。

人参皂苷Rg1对体外培养C2C12成肌细胞凋亡的影响

目的：研究人参皂苷Rg1对体外无血清诱导培养的C2C12成肌细胞凋亡的影响及其可能机制。方法：采用MTT法、人参皂苷Rg1处理48h后hoechst33258－PI染色，以及RT-PCR方法观察不同浓度人参皂苷Rg1对C2C12成肌细胞凋亡的影响。结果：MTT法结果显示人参皂苷Rg1处理48h后可抑制C2C12成肌细胞凋亡；Hoechst33258－PI染色可见C2C12成肌细胞凋亡率人参皂苷处理前后差异有统计学意义，人参皂苷处理后C2C12成肌细胞凋亡率显著下降；RT-PCR法结果显示人参皂苷Rg1可抑制Caspase-3、Bax和AIFmRNA表达，并能诱导Bcl－2mRNA表达。结论：人参皂苷Rg1对C2C12成肌细胞凋亡具有保护作用。

circRNA-Zfp609对C2C12成肌细胞增殖和分化的影响

【目的】试验旨在探究circRNA-Zfp609调节C2C12成肌细胞增殖和分化的潜在分子机制。【方法】利用RT-PCR和测序分析小鼠骨骼肌组织和C2C12成肌细胞中circRNA-Zfp609的表达,实时荧光定量PCR检测小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、小肠、骨骼肌组织及增殖12、24、36、48 h和分化0、1、3、5 d的C2C12成肌细胞中circRNA-Zfp609的相对表达量;实时荧光定量PCR检测分化0、1、3、5 d的C2C12成肌细胞中肌细胞生成素(MyoG)和肌球蛋白重链(MyHC)的相对表达量。用circRNA-Zfp609的干扰表达载体(siRNA)干扰细胞,通过CCK-8测定siRNA对C2C12成肌细胞增殖率的影响;用实时荧光定量PCR检测siRNA干扰对circRNA-Zfp609、MyoG和MyHC相对表达量的影响。通过TargetScan 7.0和miRDB软件预测circRNA-Zfp609上与肌肉分化相关的miRNA位点,将筛选的miRNAs的过表达载体转染HEK293T细胞,利用双荧光素酶报告试验验证circRNA-Zfp609与miRNA的互作关系。根据miRNAs对circRNA-Zfp609的互作,构建circRNA-Zfp609的野生型和突变型载体并转染HEK293T细胞,利用双荧光素酶报告试验验证circRNA-Zfp609对miRNA的靶向关系。【结果】PCR和测序结果表明,小鼠骨骼肌中可表达circRNA-Zfp609;circRNA-Zfp609在小鼠骨骼肌中表达水平最高,在其他组织中的表达量由高到低依次是肾脏、肺脏、心脏、肝脏、胃、脾脏和小肠。与12 h相比,在C2C12成肌细胞增殖的36和48 h circRNA-Zfp609的相对表达量显著增加(P<0.05);与分化第0天相比,在C2C12成肌细胞分化的第1、3和5天circRNA-Zfp609的相对表达量均显著增加(P<0.05),MyoG、MyHC的相对表达量均极显著增加(P<0.01)。与NC组相比,siRNA组C2C12成肌细胞的增殖率和circRNA-Zfp609相对表达量均极显著降低(P<0.01),MyoG和MyHC的相对表达量显著降低(P<0.05)。circRNA-Zfp609上有miR-150-5p、miR-327、miR-344g-3p和miR-615-5p 4种与肌肉分化相关的miRNAs。circRNA-Zfp609与miR-615-5p的吸附能力最强,具有靶向结合作用。circRNA-Zfp609可以作为分子海绵与调控肌肉分化相关的miR-615-5p相互作用。【结论】circRNA-Zfp609在小鼠的组织中广泛表达,在骨骼肌中表达水平最高;circRNA-Zfp609在C2C12成肌细胞增殖和分化的不同时期差异表达,circRNA-Zfp609上有4个与肌肉分化相关的miRNAs,其中miR-615-5p与circRNA-Zfp609具有靶向关系。本研究结果可为与家畜骨骼肌生长发育相关的研究提供参考。

C2C12成肌细胞诱导肌性分化过程中miR-101a的表达

以C2C12成肌细胞为模型,在分化培养基中诱导C2C12建立体外肌性细胞分化模型。以poly(A)3'-端加尾和实时定量PCR方法研究miR-101a在C2C12细胞分化过程中的表达情况。结果发现,在细胞转入分化培养基进行肌性分化的1-5 d中,miR-101a的表达量逐渐增加,提示miR-101a可能在肌肉发生中发挥调控作用。

丁酸盐对C2C12成肌细胞的增殖和分化作用

目的探讨丁酸盐对C2C12成肌细胞的增殖和分化作用。方法2020年11月—12月,对共和新路街道及甘泉路街道的14例社区老年人进行肌少症评估。根据亚洲肌少症工作组的标准将受试者分为肌少症组(n=6)和非肌少症组(n=8),分析受试者粪便样本中的代谢物水平。通过丁酸盐处理C2C12成肌细胞48h后,CCK-8细胞增殖实验和免疫荧光染色观察丁酸盐对C2C12成肌细胞的增殖效应;检测MyoD、Myf5、MyHC的蛋白表达水平,评估丁酸盐对C2C12成肌细胞分化的影响。结果与非肌少症组比较,肌少症组丁酸盐水平降低[(30.79±1.48)μmol/g vs(14.37±8.32)μmol/g,P=0.032]。丁酸盐刺激C2C12成肌细胞48h后,细胞增殖率上调。丁酸盐组Ki-67+细胞核增多(35.96%vs16.82%,P=0.009)。与对照组比较,处理48h后丁酸盐组C2C12成肌细胞MyoD、Myf5的蛋白表达水平升高(P<0.05);分化96h后丁酸盐组C2C12成肌细胞MyHC的蛋白表达水平升高(P<0.01)。结论丁酸盐可能对C2C12成肌细胞的肌生成具有促进作用。