白菜种子cDNA酵母文库的构建及BrTTG1互作蛋白的筛选及分析

【目的】通过构建白菜种子的cDNA文库,筛选WDR 40蛋白TRANSPARENT TESTA GLABRA 1(TTG1)的互作蛋白,探究TTG1参与MBW三元复合体调控种皮原花青素形成的分子机制。【方法】以棕籽白菜自交系‘B147’的种子为材料,提取总RNA并建立cDNA文库,通过gateway技术构建诱饵载体pGBKT7-TTG1并进行酵母双杂交筛库。【结果】酵母文库库容为1.2×10^(7)CFU,文库滴度是5.0×10^(7)CFU/mL,插入片段平均长度大于1000 bp,诱饵载体在酵母中无自激活活性。通过构建的诱饵载体pGBKT7-TTG1与构建的cDNA文库杂交,共获得了38个阳性互作蛋白,功能预测显示其中一个蛋白注释为MYB转录因子,注释为MYB73,序列分析结果显示该基因含有R2R3-MYB型抑制子保守基序C1和C2,推测该基因为白菜中参与种皮颜色形成的R2R3-MYB型抑制子,暗示着白菜中可能存在不同MYB转录因子参与的调控网络,影响着原花青素的形成。【结论】本研究构建了白菜种子组织的酵母双杂交cDNA文库,获得了38个TTG1阳性互作蛋白,首次挖掘到了可能影响白菜种皮颜色原花青素形成的R2R3-MYB型抑制子MYB73,为后期探究白菜种皮原花青素的调控网络奠定良好的基础。

玉米大斑病菌cDNA文库的构建及转录因子StMR1互作蛋白的筛选

【目的】筛选玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)转录因子的互作蛋白,解析黑色素调控转录因子StMR1调控玉米大斑病菌致病性的分子机制。为解析玉米大斑病菌侵染过程中转录因子的调控网络,阐明病菌的致病机理提供参考。【方法】收集玉米大斑病菌菌丝和孢子不同萌发阶段作为试验材料,采用Gateway方法构建玉米大斑病菌cDNA文库,使用同源重组的方法构建转录因子StMR1的诱饵载体,采用酵母双杂交技术筛选其互作蛋白并进行一对一验证。【结果】构建的玉米大斑病菌文库插入的平均片段长度大于1000 bp,初级文库及次级文库的库容量为1.2×107和1.04×107CFU,重组率为100%,可以用于酵母双杂交筛选。成功构建可以用于筛库的诱饵载体pGBKT7-StMR1,经初筛与复筛得到3个互作蛋白,一对一验证短链脱氢酶、糖基转移酶、富含亮氨酸重复序列蛋白均与转录因子StMR1存在互作。【结论】成功构建了丰富度高且质量好的玉米大斑病菌cDNA文库并筛选到了与转录因子StMR1互作的蛋白。

灰霉菌胁迫下番茄叶片cDNA文库构建及SlbZIP1互作蛋白筛选鉴定

为筛选番茄在灰霉菌侵染下与bZIP转录因子SlbZIP1(Solyc01g008730.2.1)互作的蛋白,以感病番茄Moneymaker为材料,提取接种灰霉菌胁迫处理后0、24、48、72、96 h的番茄叶片的总RNA,通过三框法构建cDNA酵母文库,计算文库库容量、重组效率。同时,以SlbZIP1为诱饵,利用构建的文库探索其在灰霉菌侵染过程中的互作蛋白,并对其中可能参与病原菌防御反应的潜在蛋白在酵母中进行互作验证。结果表明,酵母文库库容达到1.5×10^(6)CFU,重组效率为98%。酵母双杂交共计筛选到14个与SlbZIP1互作的潜在蛋白。进一步互作验证表明,SlbZIP1与谷氧还蛋白SlGRXC9、SlGRXC6、bZIP转录因子SlTGA2.2及钙调蛋白SlCaM1均存在互作。上述结果可为进一步阐明SlbZIP1对腐生型真菌病害的抗病分子机制奠定基础。

矢车菊不同颜色花瓣酵母cDNA文库的构建

【目的】矢车菊花瓣的蓝色呈色和品种间花色变异的分子调控机制尚不明晰。本研究采用Gateway技术构建了矢车菊6个不同花色品种花瓣的酵母cDNA文库,以期进一步通过酵母单杂交或双杂交技术筛选参与调控花瓣呈色的关键互作蛋白。【方法】本研究以白色、粉色、红色、蓝色、紫色和墨色矢车菊花瓣为材料,提取总RNA后分离和纯化mRNA,合成双链cDNA后依次进行BP重组反应和LR重组反应,分别获得初级和次级文库。最后将次级文库质粒转化酵母Y187,获得矢车菊不同颜色花瓣的酵母cDNA文库。【结果】质量鉴定结果显示:初级文库的库容量为1.3×10^(7) CFU,重组率为100%,且插入片段长度均在1000 bp以上;次级文库的库容量为1.6×10^(7) CFU,重组率为100%,且插入片段长度均在1000 bp以上。酵母文库的滴度为3.5×10^(7) CFU/mL,随机挑选的24个单克隆经PCR检测后均扩增出明亮条带,重组率为100%,插入片段长度均大于1000 bp。【结论】本研究构建的矢车菊不同颜色花瓣酵母cDNA文库的质量较高,能满足酵母文库筛选的试验要求,为后续探究矢车菊花瓣的蓝色呈色和品种间花色变异的分子调控机制提供了材料基础。

橡胶树棒孢霉落叶病菌酵母单杂交cDNA文库及CcCas5启动子诱饵载体的构建

为了筛选出与CcCas5启动子结合的转录因子,本研究构建了橡胶树棒孢霉落叶病菌的酵母单杂交cDNA表达文库和CcCas5启动子诱饵载体,并对3-氨基-1,2,4-三唑(3-amino-1,2,4-triazole,3-AT)的最佳抑制浓度进行了筛选。结果显示,构建的酵母单杂交cDNA表达文库总容量为3.49×10^(6)cfu,插入片段主要分布于750~2000 bp之间,重组率为95.8%;克隆了CcCas 5基因2600 bp的启动子序列,预测获得真菌主要的10大类转录因子的结合位点165个;构建了分别携带1500 bp和1000 bp启动子序列的酵母单杂交启动子诱饵载体,10 mmol/L的3-AT能抑制pHis2.1-pCcCas5-1000和pHis2.1-pCcCas5-1500的背景表达。试验结果为通过酵母单杂交筛选与CcCas5启动子结合的转录因子和进一步研究转录因子对CcCas5表达的调控作用奠定基础。

cDNA文库构建策略及其分析研究进展

cDNA文库构建和筛选是基因克隆的重要方法之一,它是目前发现新基因和研究基因功能的基本工具。从cDNA文库中可以筛选到目的基因,并直接用于该基因的表达。经典cDNA文库存在克隆的片段短等缺点,而全长cDNA文库则能提供完整的mRNA信息,从而克隆cDNA全长;对文库进行均一化处理即均一化cDNA文库,可以增加克隆低丰度mRNA的机会;差减cDNA文库在研究生物体某一时期基因差异表达上具有重要的意义;改进的固相cDNA很大程度上提高了建库的效率和质量。本文以阐述基本原理为主,介绍几种近年来常用的cDNA构建的方法及其优缺点。

麦根腐平脐蠕孢cDNA文库的构建及BsTup1互作蛋白筛选

【目的】深入探究麦根腐平脐蠕孢(Bipolaris sorokiniana)生长发育及致病力的分子作用机制,并鉴定BsTup1的互作蛋白。【方法】利用麦根腐平脐蠕孢(B.sorokiniana)孢子和不同时期的菌丝体为材料,构建酵母双杂交cDNA文库,以BsTup1基因为诱饵来筛选酵母双杂交文库,确定与BsTup1相互作用的蛋白。【结果】1)利用SMART(switching mechanism at 5′end of the RNA transcript)技术首次成功构建了麦根腐平脐蠕孢(B.sorokini-ana)分生孢子和菌丝体的混合cDNA文库。文库鉴定结果表明,构建的cDNA文库库容为4.8×10^(7) cfu·mL^(-1),文库插入片段重组率达100%且平均大小为1000 bp。2)构建了pGBKT7-BsTup1诱饵载体,无自激活活性。3)使用诱饵蛋白载体pGBKT7-BsTup1对麦根腐平脐蠕孢(B.sorokiniana)酵母双杂交cDNA文库进行筛选,经测序、序列比对和酵母回转验证,获得38个与BsTup1相互作用的候选蛋白。【结论】成功构建了麦根腐平脐蠕孢(B.sorokiniana)的cDNA文库,并鉴定出38个与BsTup1相互作用的候选蛋白。

cDNA文库的构建及其在兽医研究中的应用

cDNA文库是一个包含特定组织或细胞类型全套基因表达信息的克隆集合,是进行基因表达分析和功能研究的重要工具。构建高质量的cDNA文库对于捕获全面的转录信息至关重要,这涉及样本的选择、处理、cDNA的合成和文库的构建等一系列步骤的优化。该文介绍了cDNA文库的概念、构建技术及其在兽医学中的应用,并对技术进展和未来的研究方向进行了展望。

橡胶树膜系统酵母双杂交cDNA文库构建及HbSRPP7互作蛋白筛选

橡胶树橡胶粒子上的蛋白质在橡胶生物合成一系列反应过程中起着关键作用,它们直接决定着橡胶烃分子的数量和大小,影响天然橡胶的产量和质量。小橡胶粒子蛋白(small rubber particle protein,SRPP)是丰度仅次于橡胶延伸因子(rubber elongation factor,REF)的橡胶粒子蛋白组分,与橡胶粒子发育和橡胶生物合成密切相关。目前已知橡胶粒子上存在多种SRPP家族蛋白,但大部分成员的功能尚不清楚。SRPP可能通过与其他橡胶粒子蛋白相互作用发挥功能。为了筛选SRPP蛋白家族成员之一Hb SRPP7的互作蛋白,本研究利用位点特异性重组技术构建了原始库容为1.5×10^(7)CFU的均一化橡胶树胶乳膜蛋白酵母双杂交系统(membrane yeast two-hybrid system,MYTH)cDNA文库,该文库插入片段平均长度大于1500 bp,重组率约为100%。构建了用于MYTH系统筛选HbSRPP7互作蛋白的pBT3STE-SRPP7和pBT3SUC-SRPP7诱饵载体并确认其能在NMY32酵母菌株中正确表达,无自激活活性。使用pBT3STE-SRPP7诱饵质粒对胶乳MYTHcDNA文库进行筛选,获得21个HbSRPP7候选互作的蛋白,包括3个REF家族蛋白(HbREF1、HbREF3和HbREF8)、2个SRPP家族蛋白(HbSRPP1、HbSRPP2)、2个活性氧清除相关蛋白(thioredoxin H-type-like、L-ascorbate peroxidase 2)以及5个胁迫相关蛋白(high mobility group Bprotein 2-like、RPM1-interacting protein 4-like、stress-related protein-like、salt stress-induced hydrophobic peptide ESI3-like和F-box/kelch-repeat protein)。结果显示HbSRPP7除了可能通过与橡胶生物合成相关的橡胶粒子蛋白互作参与橡胶生物合成,也可能通过与生物和非生物逆境胁迫相关蛋白互作,响应橡胶树乳管生物和非生物逆境胁迫系统信号,参与橡胶粒子上的橡胶生物合成调控。该研究结果有助于了解SRPP家族蛋白的功能,为揭示橡胶粒子上参与橡胶生物合成的蛋白复合体组成,阐明橡胶生物合成及其调控的分子机制奠定基础。

盐碱胁迫诱导的猴樟酵母cDNA文库构建及CbP5CS上游调控因子筛选

盐碱土壤环境是限制猴樟引种推广的主要因素,脯氨酸是植物适应盐碱胁迫过程中主要的渗透调节物质,筛选并鉴定出调控脯氨酸合成的转录因子对于猴樟耐盐碱分子机理研究具有重要意义。以猴樟实生苗为材料,在水培培养基础上,采用0 mmol/L和10 mmol/L的Na_(2)CO_(3)溶液分别进行处理,选取处理6 h、48 h的根系组织,提取总RNA,构建盐碱胁迫诱导的猴樟根系酵母c DNA文库;以猴樟根系总DNA为模板,克隆CbP5CS启动子序列,采用Y1H酵母单杂交技术筛选出与CbP5CS启动子存在互作的蛋白,并通过高通量测序技术鉴定出调控猴樟脯氨酸合成的转录因子。结果表明,所构建的cDNA文库库容为4.88×10^(7)CFU/mL,总克隆数为9.76×10^(7)CFU,文库插入片段平均长度在1000 bp左右,cDNA片段重组率为100%,符合酵母杂交试验的要求。克隆出的CbP5CS启动子序列长2012 bp,成功构建出诱饵质粒pHIS2-CbP5CS,利用共转化方法从文库中筛选到31个与CbP5CS互作的EST序列。经酵母回转验证,31个EST序列均与CbP5CS存在互作。经NGS测序和BLAST比对搜索,获得6个转录因子基因,分别为锌指CCCH结构域蛋白25异构体x1、AtbHLH104、转录因子TFIIIC、RING/FYVE/PHD锌指超家族蛋白、GATA型锌指转录因子家族蛋白、AtbHLH96。以上结果为进一步研究植物脯氨酸代谢响应盐碱胁迫的分子机制奠定基础。

少棘蜈蚣毒腺RACE cDNA文库的构建及β-actin基因的克隆与序列分析

运用SMART技术首次构建了少棘蜈蚣(Scolopendrasubspinipes)毒腺cDNA文库。经琼脂糖电泳检测,文库所含全长cDNA主要分布在5 0 0bp以上,大于2 0 0 0bp的区域尚有很长拖尾,中间有几条高丰度mRNA亮带。以此文库为模板,通过5′RACE(RapidamplificationofcDNAends,快速扩增cDNA末端)方法获得了细胞质肌动蛋白βactin基因5′末端5 98bp片段,其中包括开放阅读框5 46bp ,编码1 82个氨基酸。将该基因片段推导的氨基酸序列通过BLAST软件与蛋白质公共数据库Swissprot比对,发现与蜜蜂(Apismellifera)的βactin基因同源性高达96% ,说明本实验所构文库质量完全可以满足用RACE方法进行功能基因的cDNA克隆。通过基于双参数模型的NJ法对部分动物βactin基因进行系统重建,较好地反映了这些动物的系统发生关系。

超高速细胞分选平台结合cDNA microarray技术筛查宫颈癌细胞潜在分子标志物

目的:通过超高速细胞分选平台结合cDNA microarray技术,筛查宫颈癌细胞可能潜在的分子标志物。方法:采用MoFlo XDP型超高速细胞分选平台纯化细胞膜表面表达CD38和不表达CD38的宫颈癌细胞,利用RNAlater技术得到cDNA microarray实验所需RNA,然后进行基因芯片分析。结果:利用MoFlo XDP型超高速细胞分选平台可以获得纯度为99.0%以上的CD38阳性表达宫颈癌细胞。结论:cDNA microarray分析发现了RORA、PLIN4、AUTS2、IFITM1等宫颈癌细胞潜在分子标志物,为宫颈癌研究提供了新的技术方法。

基于cDNA-AFLP技术的辣椒果实发育相关基因的差异表达分析

以辣椒育种资源9-68为研究对象,利用cDNA-AFLP技术对辣椒果实不同发育期进行分析,并进行生物信息学分析,探索辣椒果实发育中相关基因的差异表达,以期获得辣椒果实发育的相关基因及表达信息。结果表明:利用42对引物组合共扩增出1 926条TDF(transcriptic derived fregment),其中包括上调表达、下调表达、无差异表达等类型。选择特异表达的25个TDF进行回收测序,获得19个清晰的序列结果。其中8个TDF序列在Blastn库中检索到相似性较高及功能确定的mRNA、cDNA或基因序列,8个TDF序列与Blastx库中已登录的mRNA或cDNA序列相似性较高,但是具体功能未确定。另外3个TDF在GenBank、EST库的比对分析中,没有搜索到与3个TDF有较高相似性的结果,可能为首次发现的碱基序列。

不结球白菜酵母杂交cDNA文库构建及BcFT上游调控因子筛选

FLOWERING LOCUS T(FT)是调控植物开花途径中的关键基因,前期研究中,在比较晚开花wym-97和早开花cx-49两个品种的BcFT启动子时,发现cx-49的BcFT启动子存在一个1577 bp的插入片段。为探索该插入片段对不结球白菜开花的影响,本研究构建不结球白菜酵母杂交cDNA文库,继而利用酵母单杂交技术筛选与BcFT启动子互作的蛋白。结果显示,本研究所得cDNA文库的库容为1.8×10^(6)CFU,重组率为100%,插入片段长度分布范围约400~2000 bp,平均长度大于1000 bp,表明不结球白菜酵母杂交cDNA文库构建成功。自激活试验表明,800 ng·mL^(-1)的金担子素(AbA)可以抑制诱饵载体的自激活。通过酵母单杂交试验筛选到结合BcFT启动子插入片段的上游蛋白BcSAP18和BcDEAR2。综上,本研究成功构建了不结球白菜酵母杂交cDNA文库并获得了BcFT启动子插入片段的互作蛋白,为进一步研究BcFT在不结球白菜开花中的调控机制奠定了基础。

猫杯状病毒HRB-SS株感染性cDNA克隆的构建与病毒的拯救

为构建猫杯状病毒(FCV)HRB-SS株的感染性克隆,本研究合成3’端含有丁肝病毒核酶(HdvRz)序列的HRB-SS株全长基因组序列,将该序列插入p OK12-CMV载体,获得含FCV HRB-SS全长基因组cDNA克隆的重组质粒p FCV-HRB-SS。将重组质粒p FCV-HRB-SS转染猫肾细胞(CRFK),48 h即可观察到典型细胞病变,将病变细胞的上清接种未感染的CRFK细胞进行传代培养,连续传5代,从感染的细胞上清中获得拯救病毒。采用FCV VP1蛋白MAb,经间接免疫荧光试验检测,结果显示拯救病毒与亲本病毒均可观察到特异性绿色荧光,而未感染病毒的对照组细胞无荧光信号;各组细胞负染色后经电镜观察均可见病毒粒子呈典型的杯状结构。提取拯救病毒和亲本病毒基因组RNA,反转录为c DNA作为模板,经RT-PCR扩增、Kpn I酶切鉴定及测序分析,结果显示,拯救病毒含C^(5724)G位点突变的分子标记,消除了Kpn I酶切位点,不同于亲本病毒。上述结果表明获得拯救病毒r FCV HRB-SS。采用蚀斑形成试验和绘制病毒的一步生长曲线进一步检测r FCV HRB-SS,结果显示,r FCV HRB-SS与亲本病毒具有一致的复制水平和体外生长能力。本研究利用真核启动子构建的FCV HRB-SS株全长感染性cDNA克隆系统可直接在细胞内转录,减少了体外操作流程,有效防止了操作污染,具有操作简便,拯救效率高的优势,为后续FCV基因功能的研究和新型疫苗的研发奠定了基础。

海湾扇贝g型溶菌酶基因cDNA的克隆与分析

通过EST和锚定PCR技术,从海湾扇贝(Argopecten irradians)中克隆得到一种溶菌酶基因的全长cDNA(全长659bp,编码200个氨基酸).BLASTx分析的结果显示,它和脊椎动物g型溶菌酶相似性较高,却不同于无脊椎动物中已发现的c型和i型溶菌酶.在其编码的氨基酸序列中发现了g型溶菌酶的活性中心(Glu 82, Asp 97, Asp 108),同时6个保守的半胱氨酸也与鸟类和鱼类的g型溶菌酶相一致.结合BLASTX分析的结果,可以确认所获得的cDNA序列是一种在无脊椎动物中首次发现的g型溶菌酶的编码序列.采用Clustalw 软件,对多种脊椎动物c型、g型溶菌酶和无脊椎动物c型、i型溶菌酶以及本研究发现的无脊椎动物g型溶菌酶进行了分析,结果发现,无脊椎动物c型、i型溶菌酶和脊椎动物c型溶菌酶同源性较高,而海湾扇贝g型溶菌酶和脊椎动物g型溶菌酶同源性较高.由此说明c型、g型溶菌酶从无脊椎到脊椎动物的进化是平行发生的,这对进一步研究溶菌酶及其分子进化具有重要意义.

芍药种子休眠解除过程的酵母杂交cDNA文库构建

【目的】芍药具有极佳的观赏价值,但其种子的双重休眠难以解除,严重阻碍芍药的育种进程。本研究利用gateway技术构建芍药种子休眠解除关键时期的酵母杂交cDNA文库,可用于筛选调控芍药种子休眠解除相关基因的转录因子及互作蛋白。本文库的构建可为丰富芍药种子休眠调控研究提供科学支撑,能为芍药栽培育种和野生资源保护及利用奠定分子理论基础。【方法】本研究以休眠解除过程中5个关键时期的芍药种子为试验材料,进行总RNA的提取和m RNA的分离,使用gateway方法构建cDNA初级文库,再通过LR重组,将初级文库重组到pGADT7-DEST次级文库载体上,构建出次级文库,最后经过酵母转化试验,将次级文库质粒转化到酵母Y187感受态细胞中,构建出芍药种子休眠解除过程的酵母文库。【结果】经鉴定,cDNA初级文库库容量为1.28×10^(7) CFU,平均插入片段长度在1000 bp以上,重组率为100%;cDNA次级文库库容量为1.12×10^(7) CFU,平均插入片段长度在1000 bp以上,重组率为100%;酵母文库滴度为7.0×10^(7) CFU/mL,平均插入片段长度在1000 bp以上,重组率为96%。23个阳性克隆测序结果经NCBI比对后,按照功能将20个已知蛋白序列划分为8类,其中7个序列已被报道参与种子的休眠与萌发。【结论】芍药种子休眠解除过程的酵母杂交cDNA文库构建的质量较高,具有较完整的基因信息,符合酵母文库筛选试验所需的标准,为构建芍药种子休眠解除过程的分子调控网络提供基础。

盖塔病毒SC483株cDNA感染性克隆的构建

【背景】盖塔病毒(Getah virus,GETV)是一种由蚊虫传播的病毒,分类学上属于披膜病毒科甲病毒属成员。该病毒宿主范围广,可感染猪、马、牛、狐狸等多种哺乳动物,人也可以感染,但在人群中造成的危害尚不知晓。动物感染主要临床表现为发热、皮疹、关节炎、繁殖障碍和死胎。GETV在世界范围内流行较为广泛,近年来在我国的流行呈上升趋势,2018年我国南方多个猪场爆发该病,GETV在畜禽养殖及公共卫生方面的危害渐渐受到人们的关注。目前,尚无用于预防和治疗盖塔病毒感染的商业化疫苗和药物。由于对GETV研究较少,其生物学特性、对不同物种的致病性和致病机制以及流行趋势在很大程度上均是未知的。【目的】建立高效的GETV反向遗传操作平台,为深入研究GETV基因组结构与功能、致病机制以及开发新型疫苗奠定基础。【方法】采取化学合成的方式人工合成了两端分别含有锤头状核酶(HamRz)和丁肝病毒核酶(HdvRz)序列的GETV SC483株基因组全长,并克隆至低拷贝pOK12-CMV载体中,从而获得含有GETV SC483株基因组全长cDNA克隆的重组质粒pGETV-SC483。将纯化的重组质粒pGETV-SC483转染BHK-21细胞进行病毒拯救。对拯救病毒进行连续传代、鉴定以及生物学特性分析,并对感染性克隆质粒pGETV-SC483在大肠杆菌中的遗传稳定性进行验证。【结果】重组质粒pGETV-SC483转染BHK-21细胞后,48 h即可观察到GETV感染引起的典型细胞病变,获得的拯救病毒命名为rSC483。分别提取拯救病毒和亲本病毒基因组RNA,对病毒基因组进行RT-PCR扩增、Not I酶切以及序列测定。结果表明,拯救病毒不同于亲本病毒,其含有人为引入以消去Not I酶切位点的G4332A突变的分子标记。使用GETV特异性抗体作为检测抗体的间接免疫荧光试验和病毒粒子形态学电镜负染观察结果进一步表明,GETV拯救成功。噬斑形成试验和一步生长曲线试验结果表明,拯救病毒与亲本病毒具有相似的复制能力和增殖特性。另外,感染性克隆质粒pGETV-SC483在大肠杆菌DH5α中连续传代后的测序结果表明,该重组质粒具有良好的遗传稳定性。【结论】成功构建了稳定、高效的GETV SC483株全长cDNA感染性克隆,为GETV生物学特性及致病机理研究以及新型疫苗开发提供了技术平台。

cDNA末端快速扩增技术的研究进展

cDNA末端快速扩增技术是一种基于多聚酶链式反应的技术 ,它的发展大大便利了应用其它方法获得的部分cDNA序列后克隆全长cDNA 5’和 3’末端的工作。不仅RACE方法能在短时间内得到完整的cDNA末端序列 ,而且一些截短的cDNA末端常常也能在RACE的过程中被扩增 ,而这些截短的产物破坏了全长cDNA克隆的获取。许多研究者对RACE的流程提出了改进方案 ,从而提高了该技术的效力。本文介绍了许多已发表的RACE技术关键步骤的改良 ,包括一些具体有效的操作流程 ,如RNA连接酶介导的RACE/连接锚定PCR等 ,还有其有效性的例证。

cDNA文库的构建策略

cDNA文库在基因分离和克隆中具有重要作用 .近年来 ,随着分子生物学技术的发展 ,cDNA文库构建方法有了很大改进和提高 .