父母代肉种鸡感染CIAV导致瘫痪的诊断试验

山东省潍坊市寒亭区一白羽父母代肉鸡场,出现大量趴地不起瘸腿关节肿大的病鸡,治疗效果差,瘫痪病鸡死淘率近乎100%。为查明病因,本试验对病死鸡进行剖检后,通过PCR/RT-PCR方法检测了鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synovialis,MS)、鸡呼肠弧病毒(Avian reovirus,REO)、鸡马立克氏病病毒(Marek's disease virus of chicken,MDV)和鸡传染性贫血病毒(Chicken infectious anemia virus,CIAV),并对肿大的关节进行细菌分离和耐药性分析。结果显示,MS、REO、MDV均为阴性,CIAV为阳性,经全基因组测序分析发现该CIAV毒株与疫苗毒株不属于同一分支,与分离毒株JS1501同源性最近;肿大关节处分离到金黄色葡萄球菌;耐药性分析显示,该株金黄色葡萄球菌只对强力霉素、恩诺沙星、卡那霉素和头孢噻呋钠4种抗生素敏感。以上结果表明,该鸡场发生的大规模关节腿病原因是鸡群在携带CIAV的基础上,混合感染金黄色葡萄球菌造成的;该金黄色葡萄球菌只对4种兽用抗生素敏感,这也是鸡群正常药物治疗效果差的原因之一。

应用PCR从AA肉种鸡鸡胚和1日龄雏鸡体内检测出CIAV和ALV-J

为了了解鸡传染性贫血病病毒(CIAV)和J亚群禽白血病病毒(ALV-J)对AA肉种鸡鸡胚和1日龄雏鸡的感染情况,试验直接从山东省3个不同AA肉种鸡场的鸡胚和1日龄雏鸡的肝、脾、肾、胸腺、骨髓、法氏囊等组织(器官)提取DNA,进行了PCR扩增及PCR产物的克隆和序列测定。结果显示,被检的3个肉种鸡场的鸡胚和1日龄雏鸡体内均有这2种病毒核酸的检出,其中CIAV的阳性率是20.42%,ALV-J的阳性率是15.83%,二者共感染的阳性率是6.25%;在阳性检出率中弱雏>死胚>健康雏>正常胚。病毒核酸在各感染组织(器官)的含量也有所差异,CIAV以脾的含量最多,ALV-J以肾的含量最多。对肝进行细菌分离鉴定时发现,3个鸡场还存在大肠杆菌、沙门氏菌和霉形体的混合感染。结果提示,在AA肉种鸡鸡胚和雏鸡体内存在CIAV、ALV-J的感染和二者的共感染以及继发性大肠杆菌、沙门氏菌和霉形体的混合感染。

江苏省某鸡场CAstV、CIAV和REV感染情况的调查及分析

为研究鸡星状病毒(Chicken-origin astrovirus,CAst V)、鸡传染性贫血病毒(Chickeninfectious anemia virus,CIAV)和禽网状内皮组织增生症病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)在江苏某鸡场的流行和混合感染情况,采集该鸡场1日龄雏鸡的脏器,应用PCR和RT-PCR检测CAst V、CIAV和REV的单独感染以及混合感染情况。结果显示:1日龄雏鸡CAst V、CIAV、REV单独检出率分别为45%、37.5%和0%,其中CAst V和CIAV双重感染率为25%。表明该鸡场CAst V阳性率较高,提示养禽企业需增强对该病毒的关注。

元宝鸡中ALV-J与CIAV混合感染的鉴定及其分子进化分析

为了诊断巢湖地区送检元宝鸡的病情,试验进行了剖检观察、制备病理组织切片、设计特异性引物用PCR扩增几种常见免疫抑制病毒序列,并将测序结果用DNAStar软件与已报道的序列进行比对分析。结果表明:测序所得结果与NCBI上报道的J亚群禽白血病病毒(ALV-J)和鸡传染性贫血病毒(CIAV)序列结果一致,并且ALV-J序列同源性在93.4%~98.2%之间,CIAV序列同源性在97.5%~99.2%之间。说明巢湖地区送检的元宝鸡感染了ALV-J和CIAV,并且元宝鸡感染的ALV-J基因序列与英国株Z46390.1同源性最高,为98.2%,而检测到的CIAV与国内外已报道的鸡传染性贫血病毒同源性最高,为99.2%。

感染鸡传染性贫血病毒(CIAV)雏鸡免疫器官抗体生成细胞的动态变化

对１日龄雏鸡感染鸡传染性贫血病毒（ＣＩＡＶ）后免疫器官法氏囊、脾脏和胸腺的ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ抗体生成细胞数量的动态变化进行了检测。结果发现，感染雏鸡法氏囊、脾脏和胸腺的３种抗体生成细胞数量均程度不同地低于未感染对照雏鸡，其中法氏囊的ＩｇＧ、ＩｇＭ抗体生成细胞和ＩｇＡ抗体生成细胞分别在感染后７～３５ｄ和１４～３５ｄ明显减少；脾脏红髓、白髓和淋巴小结的ＩｇＧ抗体生成细胞分别于７～３５ｄ、１４～３５ｄ和１４～２１ｄ明显减少，ＩｇＭ抗体生成细胞分别在７～４２ｄ、２８～３５ｄ和１４ｄ时明显减少，ＩｇＡ抗体生成细胞仅在红髓中（７～２８ｄ）明显减少；胸腺髓质的ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ抗体生成细胞分别在１４～２８ｄ、７～２１ｄ和２１ｄ时明显减少。结果表明，ＣＩＡＶ感染雏鸡免疫器官的体液免疫功能明显降低。

感染CIAV雏鸡血清IgS含量变化

对1日龄雏鸡感染鸡传染性贫血病(CIA)病毒(CIAV)后外周血液中免疫球蛋白含量的动态变化进行了研究。结果发现,感染 CIAV 雏鸡外周血液的 IgG、IgM 和 IgA 含量均程度不同地低于未感染 CIAV 的对照雏鸡。其中 IgG 和 IgM 分别在感染 CIAV 后14,21,28,35和7,14,21,28,35及42天明显降低;而 IgA 仅在感染后14,21和28天明显减少。表明感染 CIAV 的雏鸡体液免疫功能呈现抑制。

感染CIAV雏鸡免疫器官对ND疫苗的细胞免疫应答

对１日龄感染ＣＩＡＶ雏鸡接种ＮＤ疫苗后，其免疫器官组织Ｔ细胞数量的动态变化进行研究．结果，感染ＣＩＡＶ雏鸡ＮＤ疫苗免疫局，其胸腺和脾脏以及盲肠扁桃体和哈德尔腺的Ｔ细胞数量，于接种ＮＤ疫苗后较未感染ＣＩＡＶ免疫对照雏鸡明显减少，表明感染雏鸡的中枢和外周免疫器官及局部免疫组织对ＮＤ疫苗的细胞免疫应答功能明显降低．ＮＤ强毒攻击后，感染免疫鸡的免疫保护率明显低于未感染免疫对照鸡．

鸡传染性贫血(CIA)活疫苗免疫肛拭子排毒规律

为调查鸡传染性贫血(CIA)活疫苗免疫后的排毒规律,本研究在隔离器中免疫CIAV活疫苗,免疫后每隔一周采集肛拭子,持续采样至第7周,检测CIAV疫苗的排毒阳性率。结果显示:CIAV疫苗免疫后第10天排毒率为50%,免疫后第2周排毒率达到高峰为80%,免疫后第6周排毒率下降至27.27%,第7周不排毒,本研究为CIAV感染的监测提供了数据支持。

禽白血病病毒和鸡传染性贫血病毒二重荧光LAMP检测方法的建立及应用

【目的】建立同时鉴别ALV和CIAV的二重荧光环介导等温扩增(LAMP)检测方法,为临床上快速诊断及有效防控ALV和CIAV的单一或混合感染提供技术支持。【方法】参考ALV(A亚群、B亚群、C亚群、D亚群和J亚群)的pol基因和CIAV的VP2基因保守序列,设计2套用于LAMP的特异性引物,并在ALV和CIAV的F1c和B1c覆盖区域分别设计双标记探针[ALV-Probe(5'端标记FAM荧光基团,3'端标记BHQ3淬灭基团)和CIAV-Probe(5'端标记CY5荧光基团,3'端标记BHQ3淬灭基团)]。在Loopamp LA-320C实时浊度仪中反应结束后,将反应管置于多色荧光系统内进行观察分析;并通过特异性试验、灵敏度试验及临床样品检测验证二重荧光LAMP检测方法的适用性和可靠性。【结果】优化后的二重荧光LAMP反应体系20.0μL:DNA/cDNA模板2.0μL,2×ReactionMix 10.0μL,Bst DNA聚合酶0.8μL,内引物ALV-FIP、ALV-BIP、CIAV-FIP和CIAV-BIP(工作浓度40.0μmol/L)各0.8μL,外引物ALV-F3、ALV-B3、CIAV-F3和CIAV-B3(工作浓度5.0μmol/L)各0.4μL,ALV-Probe(工作浓度0.5μmol/L)0.4μL,CIAV-Probe(工作浓度0.5μmol/L)0.8μL,以ddH_(2)O补足至20.0μL。扩增程序:62℃反应60 min,80℃灭活5 min。建立的二重荧光LAMP检测方法能特异性同时检测ALV和CIAV,对其他禽类病原体无特异性扩增;检测CIAV和ALV单一模板的下限均为102拷贝/μL,检测混合模板时ALV的检测下限为102拷贝/μL、CIAV的检测下限为103拷贝/μL。应用建立的二重荧光LAMP检测方法对13份咽喉和泄殖腔棉拭子样品进行检测,其检测结果与常规PCR检测结果的吻合率达100%。【结论】建立的二重荧光LAMP检测方法能实现在同一反应管内鉴别诊断ALV和CIAV,具有特异性好、敏感性高及污染风险小等优点,且检测结果可通过多色荧光系统进行肉眼观察,适用于ALV和CIAV的临床快速筛查。

鸡传染性贫血病毒与禽网状内皮增生症病毒二重PCR检测方法的建立

当前养鸡业中鸡传染性贫血病毒、禽网状内皮增生症病毒混合感染的发生率日益增高,为提高CIAV、REV检测效率,根据GenBank上登录的CIAV全基因序列和REV的LTR序列分别设计了2对引物,建立了REV、CIAV二重PCR检测方法,另外还比较了2种不同的DNA提取方法。结果显示,该方法扩增目的条带清晰、敏感性高、特异性好。应用建立的方法对临床7份病料样品检测,检出5份CIAV、REV阳性,表明建立的二重PCR方法能有效用于CIAV、REV混合感染的临床诊断。

临床样品中禽类免疫抑制性病毒与细菌共感染的检测

为了解免疫抑制性病毒和细菌共感染在禽类中的流行情况,研究应用PCR方法对来自江苏地区不同鸡群和水禽群体的临床样品进行CIAV、MDV、REV和ALV的检测,同时进行细菌分离与鉴定。结果显示:临床鸡样品中CIAV、MDV、REV和ALV的检出率分别为29.75%、33.88%、5.79%和35.54%,四种病毒多重感染率为33.06%;水禽样品仅有个别检测出MDV或REV阳性。鸡源和水禽源样品细菌分离率分别为52.89%和54.41%,样品中大肠杆菌、沙门菌、葡萄球菌、巴氏杆菌等细菌与这四种免疫抑制性病毒共存。免疫抑制性病毒与细菌共感染检测结果经χ~2检验分析发现免疫抑制性病毒感染阳性与阴性的鸡病料其细菌感染率和未感染率存在极显著差异(P<0.01);经相关性分析发现鸡免疫抑制性病毒与细菌感染存在显著性相关。研究未发现水禽样品中存在免疫抑制性病毒与细菌的共感染。研究结果表明鸡群免疫抑制性病毒与细菌的共感染普遍存在,且免疫抑制性病毒与细菌感染显著相关。

禽弱毒疫苗中鸡传染性贫血病病毒nested-PCR检测方法的建立

疫苗中污染鸡传染性贫血病毒(CIAV)是造成CIAV感染的途径之一,而通常疫苗中CIAV污染剂量较低,应用一般的技术难以检测到。为了更灵敏地检测禽弱毒疫苗中CIAV的污染,根据Gen Bank已发表的CIAV基因序列,针对其保守区设计了外用引物和内用引物,通过优化反应体系和反应条件建立了检测CIAV的nested-PCR检测方法。结果显示,所建立的检测方法灵敏度比常规PCR高100倍,该方法可以检测到1 000羽份弱毒疫苗中1 EID_(50)的低剂量CIAV污染,应用该方法从送检的50个疫苗样品中检测出4个样品为CIAV阳性。该方法与禽白血病病毒、禽网状内皮组织增生症病毒以及马立克氏病病毒等的基因均无交叉反应,具有很好的特异性。提示所建立的nested-PCR灵敏度高、特异性强,可用于检测禽弱毒疫苗中CIAV低剂量的污染。

鸡传染性贫血病毒VP3蛋白单克隆抗体的制备

以原核表达的鸡传染性贫血病毒(CIAV)VP3蛋白作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,3次免疫后,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,融合阳性细胞用间接ELISA方法检测,阳性细胞株经3代克隆纯化后,获得3株能稳定分泌抗CIAVVP3蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为AG2、BC11、FG1。3株杂交瘤细胞株产生的细胞培养液上清和小鼠腹水的ELISA效价分别为2.5×102、1.5×102、1×102和2×106、1×106、2.5×105。与其它禽类病毒的交叉实验表明:这3株单抗具有良好的抗CIAVVP3蛋白特异性。该特异性单克隆抗体的研制成功为进一步研究VP3的生物学特性打下了基础。

鸡传染性贫血病毒感染鸡血清对骨髓造血祖细胞增殖功能的影响

本文研究了鸡传染性贫血病毒感染鸡血清对正常鸡骨髓ＣＦＵ－Ｅ和ＣＦＵ－ＧＭ集落生长的影响．结果发现，ＣＩＡＶ感染后第２１天的鸡血清对骨髓ＣＦＵ－Ｅ生长具有明显抑制作用（Ｐ＜０．０５），于感染后第７、１４、２１天的血清对ＣＦＵ－ＧＭ呈现明显仰制作用（Ｐ＜０．０５）。说明感染鸡血清中存在对骨髓造血祖细胞增殖具有抑制作用的因子．

鸡传染性贫血病毒感染胸腺集落刺激因子对骨髓粒单系祖细胞增殖功能的影响

本文研究了鸡传染性贫血病毒感染鸡胸腺ＣＳＦ对正常鸡骨髓粒单系祖细胞（ＣＦＵ—ＧＭ）增殖功能的影响．结果表明，雏鸡感染ＣＩＡＶ后１４天胸腺ＣＳＦ对ＣＦＵ—ＧＭ刺激作用与对照鸡比较未见明显异常．感染后２１天，刺激作用较对照鸡明显增强（ｐ＜０．０１）；感染２８天以后，其刺激作用达正常成水平．结果证明，ＣＩＡＶ感染引起的骨髓造血机能障碍与胸腺ＣＳＦ活性无关．

拯救鸡传染性贫血突变株对宿主细胞生长周期及凋亡的影响

通过流式细胞术,观察拯救鸡传染性贫血病毒突变株(CIAVM突变株)对宿主细胞MSB1的生长周期及凋亡的影响。拯救CIAVM突变株接于MDCC-MSB1细胞系,并相应设立阴性组(正常SPF鸡肝脏细胞液),阳性组(CUX-1标准毒株),进行培养24～48h。用PI及FITC Annexin V染色方法,用流式细胞仪测定宿主细胞生长周期及凋亡,并用SPSS13.0进行结果统计学分析。接种拯救CIAV M突变株的宿主细胞G0/G1期的累积细胞百分率为(59.33±4.04)%,S期为(32.92±3.65)%,G2/M期为(7.75±3.11)%,与阴性组相比,G0/G1期细胞累积百分率有所上升;与CUX组相比,G0/G1期有所下降,但结果经统计学分析,差异均不显著(P>0.05)。试验组宿主细胞凋亡率为(37.00±4.65)%,与阴性组相比,凋亡率上升,统计学差异显著(P<0.05);与阳性组相比,凋亡率下降,统计学差异显著(P<0.05)。试验结果显示,经过VP3基因突变的CIAV M突变株,经过病毒拯救并回归SPF鸡后,对宿主细胞MSB1的生长周期没有显著的抑制,但能引起宿主细胞的显著性凋亡,且凋亡程度与CUX-1引起的宿主细胞凋亡率相比有所降低。可以表明,通过VP3密码子移位的基因突变,能够将CIAV的致凋亡作用降低,从而相应降低病毒的致病性,为以后构建CIAV减毒疫苗株奠定理论基础。

鸡传染性贫血对生产鸡群的免疫抑制影响试验研究

鸡传染性贫血是我国近年来养禽生产中较为多发的一种免疫抑制性疾病，其致病原为鸡传染性贫血病毒（Chickeninfectionsanemiavirus），以鸡再生障碍性贫血和淋巴组织萎缩为主要病理特征。当鸡受到CIAV感染后，CIAV对T细胞的损害会影响细胞因子和辅助性T细胞的作用以及对体液免疫和局部黏膜免疫功能的降低，从而影响整个免疫调控系统的协调作用，引起机体的免疫抑制；