含第一内含子猪生长激素cDNA基因在COS7细胞中的表达

以CMV真核生物启动子构建了含第一内含子猪生长激素(pGH)cDNA基因(pGHcDNA in)的表达载体,经DEAE 葡聚糖介导在COS7细胞进行了瞬时表达,通过PP95生物学测定法测定,证明含第一内含子pGHcDNA基因能够在真核细胞中进行分泌性表达,表达出的pGH具有生物学活性。这说明通过该基因转录出的前体mR NA能够在COS7细胞中进行正确剪接,从而翻译出具有生物活性的pGH。加入第一内含子在一定程度上可提高pGHcDNA基因的表达效率。

SMAD3介导TGF-β1抑制MMP9在COS7细胞中的表达

用明胶酶谱的方法检查了野生型和Smad3ex8 ex8纯合突变小鼠血清中基质金属蛋白酶(MMP9)的活性 .发现突变小鼠血清中MMP9的含量较正常小鼠的明显增高 ,提示SMAD3有抑制MMP9表达的功能 .通过细胞转染实验证实 ,TGF β1和野生型的SMAD3可以抑制COS7细胞分泌MMP9,而C端缺失的突变型Smad3基因过表达可以解除这种抑制作用 ,说明SMAD3介导TGF β1信号抑制MMP9在COS7细胞中的表达 .

大鼠热休克蛋白72基因真核表达载体构建及在COS7细胞中的表达

背景:体外克隆、表达热休克蛋白,尤其正常时少量或不表达,而应激时大量表达的热休克蛋白72对研究其缺血再灌注损伤中的作用尤为重要。目的:构建热休克蛋白72基因真核表达载体并于COS7细胞内表达,为HSP72蛋白免疫调节功能的研究奠定基础。方法:采用RT-PCR技术从BABL/C大鼠肝细胞中扩增出热休克蛋白72cDNA,经限制性核酸内切酶消化后,插入真核表达载体pcDNA3.1(+)的相应酶切位点,并将重组质粒转染COS7细胞,进行基因表达鉴定。结果与结论:重组质粒插入基因序列检测证实为热休克蛋白72cDNA,并能在COS7细胞稳定表达。成功构建热休克蛋白72真核表达载体,并于COS7细胞中成功转录与表达。

人可溶性IL-6R及其突变体基因在COS7细胞中的表达及活性分析

目的：研究人可溶性ＩＬ６Ｒ（ｈｓＩＬ６Ｒ）的空间构效关系，为小分子拮抗剂设计提供理论依据。方法：首先利用ＰＣＲ技术扩增天然人ｓＩＬ６Ｒ基因片段，然后将第２８０位Ｈｉｓ残基突变成Ｉｌｅ。天然基因和突变体基因分别转染ＣＯＳ７细胞，经ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测证实转染细胞上清中的表达产物，并利用ＢｉｎｄｉｎｇａｓａｙＥＬＩＳＡ和生物学功能分析法检测表达产物与ＩＬ６的结合能力以及它们所介导的ＩＬ６信号转导功能的差异。结果：突变体Ｈ２８０Ｉ比天然ｓＩＬ６Ｒ具有更高的ＩＬ６结合能力，但拮抗ＩＬ６在两种效应细胞系上的信号传递功能。结论：第２８０位Ｈｉｓ残基对ｓＩＬ６Ｒ发挥正常生物学功能具有重要影响，是符合拮抗剂设计要求的一个很好的候选位点。

pEGFP-植酸酶基因质粒重组构建及其在COS7细胞中表达分析

采用PCR技术扩增细菌酸性植酸aPPA2基因ORF序列,其DNA分子为1 299 bp,编码432氨基酸,蛋白质分子量约为48 kD a。此植酸酶基因被克隆到pEGFP-N3表达载体的BamH1和Pst1克隆区域,重组的pEG-FP-aPPA2重组质粒经转化到哺乳类培养细胞COS7中。重组的pEGFP-N3-aPPA2在COS7细胞中正常表达并检测出高的植酸酶活性。本研究提出的pEGFP-N3-aPPA2重组质粒构建和在哺乳类COS7细胞表达体系为植酸酶生产提供了新的技术线路。

突变型和野生型MBL基因在COS7细胞中的瞬时表达

采用PCR技术,从质粒pMBLm52、pMBLm54和pMBLm57中分别获取含CGT52TGT、GGC54GAC和GGA57GAA点突变的人甘露聚糖结合凝集素(MBL)突变体全长编码区cDNA序列,将其分别插入质粒pcDNA4/HisMax C中,构建成相应的3种真核表达载体。将各突变型MBL基因的真核表达载体和野生型MBL基因真核表达载体以脂质体法分别转染COS7细胞。72 h后,以双抗体夹心ELISA技术检测各细胞培养上清中目的蛋白的含量分别为0.980μg/ml、0.971μg/ml、0.900μg/ml和1.047μg/ml;用One-way ANOVA分析这些目的蛋白的含量无显著性差异(P>0.05)。因此,MBL结构基因的点突变并不影响MBL蛋白的合成与分泌。

鸡Igλ轻链基因克隆、序列分析及其在COS7细胞膜上的定位表达

为了研究鸡B细胞膜免疫球蛋白(mIg)的功能,深入了解鸡免疫系统抗体基因的特点,从鸡法氏囊B细胞cDNA中扩增出Igλ轻链基因,对其核苷酸序列和氨基酸序列进行了分析和比较。该基因cDNA全长873bp,编码含226个氨基酸的Igλ轻链,N-端21个氨基酸构成轻链信号肽,随后是2个Ig样结构域。运用融合PCR的方法将该基因与牛IgG Fc受体γRⅡ跨膜区序列嵌合形成重组跨膜分子,构建真核表达载体pcDNA-λR2T,转染COS7细胞,荧光抗体染色及流式细胞术检测到重组鸡Igλ轻链在细胞膜上的表达。所扩增的鸡Igλ轻链基因以及构建表达于细胞膜上的重组鸡Igλ轻链跨膜分子,为研究鸡免疫系统中的抗体轻链基因,探索Igλ轻链和B细胞膜免疫球蛋白的功能奠定技术基础。

HBV基因T1862突变真核表达载体的构建及在Cos7细胞中的表达

目的研究ＨＢＶＴ１８６２变异的生物学意义。方法 采用分子生物学方法，构建 ＨＢＶ前Ｃ／Ｃ基因ＥＢ病毒真核表达 载体，利用体外定点突变技术诱导前Ｃ／Ｃ基因Ｔ１８６２变异，经ＰＣＲ－ＲＦＬＰ初筛并经测序终鉴定出阳性克隆后，以脂质体 介导方法将突变前后的重组质粒转染Ｃos７细胞，以 ＥＬＩＳＡ检测 ＨＢeＡg的表达量。结果 未突变的重组质粒可稳定表 达ＨＢｅＡｇ，突变后的重组质粒未能检测到ＨＢｅＡｇ表达。结论ＨＢＶ前Ｃ／Ｃ基因１８６２点突变的真核表达载体的构建， 为体外研究该点突变引起ＨＢＶ的一系列生物学改变奠定基础。

TIF3转基因CHO和COS7细胞株的构建与鉴定

目的 构建 TIF3转基因 CHO和 COS7细胞株并对其构建的细胞株进行鉴定。方法 采用磷酸钙介导转染技术和 G4 18细胞筛选法 ,以 pc DNA3.1/ V5 - His- TOPO为表达载体 ,构建 TIF3转基因 CHO和 COS7细胞株 ;并应用 Western Blot技术对转基因表达产物进行分析与鉴定。实验设计分无转染组、载体转染组和目的基因转染组。结果 在 7株转染的 CHO细胞株中 ,有 3株具有高效稳定表达的 TIF3编码蛋白质 ;在 4株转染的 COS7细胞株中有 2株同样具有高效稳定的 TIF3编码蛋白质表达。结论 本研究成功地构建了 3株 TIF3转基因 CHO细胞株和 2株 TIF3转基因 COS7细胞株 。

鸡Igλ轻链绿色荧光蛋白融合分子在COS7细胞膜的表达

将牛IgG Fc受体γRⅡ的跨膜区序列嵌合入鸡Igλ轻链基因中,并将鸡Igλ轻链信号肽与Pegfp-C1载体的绿色荧光蛋白N端融合产生带有信号肽的中间载体Pegfp-C1-SP。鸡Igλ轻链基因嵌合分子定向克隆入载体的多克隆位点,构建了带有信号肽的鸡Igλ轻链/GFP融合蛋白真核表达载体。转染COS7细胞后,荧光显微镜观察,重组鸡Igλ轻链/GFP蛋白在COS7细胞膜及膜周围有明显表达,而载体pEGFP-C1转染的COS7细胞GFP则分布在细胞及细胞核。结果表明,牛IgG Fc受体γRⅡ的跨膜区能介导融合蛋白在细胞膜上的表达。

鸡免疫球蛋白λ轻链绿色荧光蛋白重组分子在COS7细胞的分泌表达

将鸡Igλ轻链信号肽与pEGFP-C1载体的绿色荧光蛋白N端融合产生带有信号肽的中间载体pEGFP-C1-SP,通过对鸡Igλ轻链基因的定向克隆,构建了带有纯化标签的鸡Igλ轻链绿色荧光蛋白真核表达载体.转染COS7细胞后,荧光显微镜观察及Western blotting检测均证明融合蛋白在COS7细胞的分泌表达.

TIF3转基因CHO和COS7细胞株的构建与鉴定

[目的 ]TIF3(MouseTranslationInitiationFacfor 3)是从镉转化BALB/c 3T3细胞中克隆出来的新基因 ,其在基因文库 (Gen Bank)的新添编号为AF2 710 72。为了对该基因的生物学功能进行研究 ,构建了TIF3转基因CHO和COS7细胞株并作了鉴定。[方法 ]采用磷酸钙介导转染技术和G418细胞筛选法 ,以pcD NA3 1/V5 His TOPO为表达载体 ,构建TIF3转基因CHO和COS7细胞株 ;应用WesternBlot技术对转基因表达产物进行分析与鉴定。实验设计分无转染组 (空白对照 )、载体转染组 (载体对照 )和目的基因转染组 (载体 +TIF3cDNA )。 [结果 ]结果显示 ,无论在CHO细胞还是COS7细胞 ,经转染和G418筛选后 ,无转染组的细胞 10 0 %死亡 ,而载体转染组和TIF3cDNA转染组的细胞形成较多的细胞集落。提示克隆化基因的细胞转染及G418筛选效果良好。经WesternBlot分析与鉴定 ,在 7株转染和经G418反复筛选的CHO细胞株中 ,有 3株具有高效稳定表达约 36kDa的TIF3编码蛋白质 ;在 4株转染和经G418反复筛选的COS7细胞株中有 2株也具有高效稳定的TIF3编码蛋白质表达 ,而无转染组和载体对照组的CHO和COS7细胞均缺乏此蛋白质表达。 [结论 ]本研究成功地构建了 3株TIF3转基因CHO细胞株和 2株TIF3转基因COS7细胞株。这两类TIF3转基因哺乳动物细胞稳定?

SV40载体在COS7细胞中的复制及外源基因的表达

为评价SV4 0载体 COS7稳定表达系统的可能应用价值 ,将含人组织型纤溶酶原激活剂 (t PA)编码区的SV4 0载体pctPA转染COS7细胞 ,并以G4 18选择培养 2 8d ,得到稳定的抗性细胞库 .Southern印迹和溶圈法分别分析该细胞库在随后的细胞传代中细胞内附加体拷贝数及t PA表达水平的变化 .在经选择培养 2 8d的COS7细胞库中 ,质粒pctPA以染色体外附加体的形式存在 (30 0拷贝 细胞 ) ,t PA的表达水平为 1 1μg d(10 6细胞 ) .在随后 3个月的动态观察中 ,随着细胞传代 ,该COS7细胞库tPA的表达水平虽逐渐递减 ,但在第 1个月内可保持在 1μg d(10 6细胞 )以上 .基于SV4 0载体 COS7稳定表达系统无需筛选克隆 ,在稳定的抗性细胞库形成后的 1个月内可能保持目的基因的高水平表达 ,因而较适合于需同时制备多种重组蛋白的实验 .

人重组IL-6在COS7细胞中的表达

应用多聚酶链反应(PCR)和脱氧核糖核酸(DNA)重组技术,构建了人白细胞介素6(IL-6)重组表达载体pTSMIL-6。利用DEAE-Dextron法将该表达载体转染COS7细胞,获得了有生物活性IL-6的暂时性高效表达。对收集的上清进行检测表明:IL-6的生物活性在转染后24小时为14208IU/ml,48小时为4770IU/ml;SDS-聚丙稀酰胺电泳证明有IL-6糖蛋白区带,分子量为25794.6D(26kD)。

草鱼生长激素基因在COS7细胞中转染表达的研究

应用RT-PCR技术克隆草鱼生长激素(gcGH)的cDNA,将此cDNA定向插入真核表达载体VR1020中,构建成重组真核表达质粒VgcGH.利用脂质体法使质粒VgcGH转染哺乳动物细胞COS7,对转染后的COS7细胞进行RT-PCR、ELISA和免疫荧光检测,分别在转录和翻译水平证实gcGH基因在COS7细胞中得到了持续和正确的转染表达.

脊髓损伤修复相关10号蛋白在COS7细胞中的表达、纯化与鉴定

目的:在COS7细胞中表达脊髓损伤修复相关10号蛋白(SCIRR10),并对表达产物进行纯化和鉴定。方法:在实验室前期研究基础上,用PCR方法扩增SCIRR10基因,将其克隆入pcDNA3.1/myc-HisA穿梭质粒中,转染COS7细胞进行表达;对表达产物用金属螯合层析方法纯化,并进行SDS-PAGE和Western印迹检测。结果及结论:构建了含有SCIRR10基因的穿梭质粒pcDNA3.1/myc-His-SCIRR10,并使其在COS7细胞中得到表达,纯化后的重组蛋白SCIRR10-His-myc的纯度在80%以上,可用于下一步的实验研究。

转译优化对EPO基因在COS7细胞中表达的影响

利用COS7细胞暂时表达系统,研究转译起始序列对EPO-cDNA表达的影响。通过DNA重组技术,构建了原EPO-cDNA表达载体pCSV-EPO(1),其转译起始序列为5＇AATTCATGG3＇。同时通过定点突变技术,将起始序列改变成5＇CCACCATGG3＇,而构建了另一表达载体pCSV-EPO(2)。后者经序列分析证明无误后和前者均通过DEAE-dextran法转染COS7细胞,用ELISA法定量测量EPO表达水平,转染后48小时及72小时收集含pCSV-EPO(1)的COS7细胞上清,测定结果为1580pg/ml及954pg/ml,而含pCSV-EPO(2)的上清则为25300pg/ml和17450pg/ml。这表明经优化起始序列的基因表达远高于未经优化的。

Nudel基因的克隆及在COS7细胞中的表达研究

本实验克隆并构建了携带红荧光报告基因的Nudel真核表达载体,为后续研究Nudel基因的功能打下基础。查阅Gene card可知,Nudel基因在肺组织中的RPKM值为7.97,本研究以人肺癌细胞A549细胞为材料,提取总RNA并反转录出cDNA,再以cDNA为模板扩增Nudel基因;将目的基因与pMD18-T载体连接,测序鉴定并命名为pT-Nudel;然后再将Nudel基因亚克隆至含红荧光报告基因的载体pDsRed-C1,构建的表达载体命名为pRed-Nudel;提取去内毒素的超纯质粒,转染COS7细胞,检测Nudel的表达情况以及抑癌基因Pten对Nudel表达的影响。结果表明,克隆的Nudel基因经测序鉴定正确;将Nudel基因亚克隆至红荧光表达载体pDsRed-C1,成功构建pRed-Nudel,并在COS7中成功表达。同时观察到与突变型的PtenC124S相比,野生型的Pten有抑制Nudel表达的可能,需要后续的实验进一步验证。

人可溶性IL-6R基因在COS7细胞中的表达及活性分析

目的在ＣＯＳ７细胞中表达具有生物学功能的人可溶性ＩＬ－６Ｒ（ｓＩＬ－６Ｒ），作为研究ｓＩＬ－６Ｒ结构与功能关系的基础。方法首先利用ＰＣＲ技术扩增出人可溶性ＩＬ－６Ｒ（ｈｓＩＬ－６Ｒ）编码基因片段，并重组入克隆载体ｐＡＬＴＥＲ－１。通过基因序列分析确定了目的基因的核苷酸序列，并进一步构建了由ＳＶ４０晚期启动子和ＨＣＭＶ早期启动子控制的表达质粒ｐＳＶＬ６Ｒ和ｐＣＭＶ６Ｒ。用脂质体介导的方法将表达质粒转染ＣＯＳ７细胞，并分别在ｍＲＮＡ水平（斑点杂交）和蛋白水平（ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ）检测ｓＩＬ－６Ｒ基因在ＣＯＳ７细胞中的表达。在７ＴＤ１，ＬＴ１２两种ＩＬ－６反应细胞系上检测转染细胞上清（含ｓＩＬ－６Ｒ）的生物学活性。结果在ｍＲＮＡ水平和蛋白水平分别检测到ｓＩＬ－６Ｒ基因在ＣＯＳ７细胞中的表达，表达产物分子量约为５００００。表达产物在７ＴＤ１，ＬＴ１２细胞系上检测到明显的生物学活性。