CRISPR-Cas系统在病原核酸检测中的研究进展

CRISPR-Cas系统作为原核生物获得性免疫系统,由簇状规则间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)和CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated proteins,Cas)构成,因其识别和切割特定DNA或RNA序列,而成为分子诊断领域研究的热点。研究人员利用Cas蛋白(Cas12、Cas13、Cas14、Cas3等)结合信号放大和转化技术(荧光法、电位法、比色法、侧向流动技术等),开发了许多高灵敏度、高特异性、低成本的诊断平台,为病原核酸检测提供了新途径。本文介绍了CRISPR-Cas系统的生物学机制及分类,总结现有的基于Cas蛋白反式切割活性开发的病原核酸检测技术,描述其特点、功能和应用场景,并对该系统的未来应用前景进行展望,期望CRISPR-Cas系统成为包括核酸检测在内的多靶标的理想检测平台。

CRISPR-Cas系统检测病原菌的研究进展

环境和食品中的病原菌威胁着人类和动物的生命健康,影响社会安定与经济发展。早期准确并快速检测病原菌,对监测和治疗人类与动物疾病起至关重要的作用。目前的病原菌检测技术主要包括分离培养鉴定法、免疫诊断方法以及基于核酸的分子生物学诊断技术。以上检测方法的特异性和准确性高,但存在检测周期长、对检测人员和设备的要求高等问题,亟待开发更加快速稳定、价廉简便的高灵敏度与高特异性的新型快速检测技术。近年来,以成簇的有规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白系统(CRISPR-Cas)系统为代表的新型基因编辑技术发展迅速。CRISPR-Cas系统不仅能够作为基因编辑工具,也在不同生物学领域中广泛应用,其中基于CRISPR-Cas系统开发的病原菌检测平台具有灵敏度高、特异性强、灵活性高、成本低廉、快速稳定等优势,在病原菌的快速检测方面具有较大潜力。本文旨在对近几年基于CRISPR-Cas系统开发的多种病原菌检测平台进行综述,包括CRISPR-Cas系统的基本作用原理及相关系统在各种病原菌检测中的应用,并展望其未来所面临的技术挑战与发展前景。

利用CRISPR-Cas系统研究食源性致病菌的基因编辑与调控

本文基于CRISPR-Cas系统,构建了食源性致病菌基因检测模型。利用基因编码测度技术对Cas蛋白基因中的向导RNA序列进行识别,提取其中的主要基因特征并进行分类。在此基础上,分别使用基因表达与分子诊断技术,根据序列特征,对基因表达数据的差异性与菌属分布概率进行分析。结果表明:通过设计特异性识别的向导RNA和基因差异表达的分析,实现对目标基因和致病菌的检测。这种方法为食源性致病菌的基因检测提供了一种精确、可靠且高效的工具。

基于CRISPR-Cas系统的分子诊断应用研究进展

CRISPR-Cas系统是细菌抵御噬菌体入侵的适应性免疫系统,按照其效应蛋白的不同分为两大类。其在特异性识别切割目标序列的基础上,还附带有切割周围单链DNA和RNA分子的反式切割特性,这种特异的识别机制为分子诊断带来了新机会,本文简单介绍了CRISPR-Cas的机制和类型,重点关注已经用于分子诊断的CRISPR-Cas系统,列举了其应用和相关研究进展。

Ⅴ型CRISPR-Cas系统相关移动遗传元件的研究进展

移动遗传元件是指一段可以发生转座的DNA。CRISPR-Cas是细菌中存在的适应性免疫系统,其进化起源与部分移动遗传元件存在密切联系。总结了V型CRISPR-Cas系统与相关移动遗传元件中不同蛋白质在功能与作用机制方面的异同,分析二者之间在进化上的联系,整理其在基因组编辑等方面的应用,并对其未来发展进行展望。

多杀性巴氏杆菌CRISPR-Cas系统生物信息学分析

【目的】了解多杀性巴氏杆菌中CRISPR-Cas系统的结构特征及cas基因的分布,为不同CRISPR亚型的应用及多杀巴氏杆菌的抗病毒进化研究提供基础。【方法】通过CRISPRCasfinder在线网站筛选多杀性巴氏杆菌基因组中的CRISPR簇和cas基因;通过生物信息学方法对各亚型系统中repeat和spacer序列保守性、repeat二级结构、cas基因核苷酸序列保守性、CRISPR簇相似性等进行分析。【结果】在选取的19株多杀性巴氏杆菌基因组中均存在Ⅰ-F、Ⅱ-C、Ⅲ-A亚型CRISPR系统。在相同亚型的CRISPR系统中repeat序列有着较保守的回文重复序列,但在不同CRISPR亚型中repeat序列差异较大。Ⅱ-C亚型的tracrRNA可以与crRNA形成保守的结构。在各亚型CRISPR系统中,新获取的spacer序列可以插入到CRISPR簇的5′-端、3′-端或中间位置。通过对各菌株spacer序列分析发现,在菌株内或菌株间的CRISPR序列中均存在着相同的spacer序列,这可能与细菌在遗传进化过程中repeat-spacer发生序列重组或基因水平转移产生的趋同进化有关。【结论】19株多杀性巴氏杆菌中含有Ⅰ-F、Ⅱ-C、Ⅲ-A 3种CRISPR-Cas系统,不同CRISPR亚型中repeat序列差异较大,spacer特征性重复的分布可能与多杀性巴氏杆菌在遗传进化过程中repeat-spacer发生序列重组有关。

CRISPR-Cas系统在结核分枝杆菌检测中的应用前景

结核病是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染性疾病。随着新型冠状病毒的大流行,2022年结核病成为全球仅次于新型冠状病毒感染传染病死因^([1]),严重危害全球人民的生命与健康。虽然目前有众多的检测手段,但据世界卫生组织(WHO)估计仍有近一半的病例未能确诊。近年来基于成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-Cas,CRISPRCas)系统发展迅速,其研发成果已应用于基因编辑和体外分子诊断。

CRISPR-Cas系统在病原微生物分子诊断中的研究进展

快速、灵敏、准确的病原微生物检测方法对感染性疾病的诊治及防控至关重要。基于成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)-CRISPR相关蛋白(Cas)系统的检测技术在病原微生物核酸检测中具有高灵敏度和高特异度的特点,该文概述了CRISPR-Cas系统的作用机制及不同Cas的核酸酶活性,总结了基于CISPR-Cas系统的检测技术在病原微生物核酸检测中的研究现状,对该系统在核酸检测应用中的挑战进行了综合分析,并提出了目前存在的一些解决方案。目前基于CRISPR-Cas系统的非核酸分析物检测仍处于前期研究阶段,但其在扩大检测范围、缩短检测时间、提高检测灵敏度等方面具有较大潜力,为开发基于CRISPR-Cas系统的病原微生物检测平台提供新思路。

CRISPR-Cas系统在植物中的研究进展与监管政策

基因编辑技术作为一种颠覆性新技术,现已广泛应用于作物的遗传改良,显示出巨大的发展潜力和应用价值。各国在加快技术研发的同时也十分关注其可能带来的安全性问题,相继出台了基因编辑作物的安全监管政策。综述了目前常用的CRISPR基因编辑系统的原理,最新开发的一系列CRISPR变体,CRISPR系统在植物中的应用,基因编辑植物检测方法及国际上的相关监管政策,以期为我国基因编辑作物监管政策的制定提供理论数据。

CRISPR-Cas系统与细菌和噬菌体的共进化

细菌在适应噬菌体攻击的过程中,进化了多种防御系统,噬菌体在细菌的选择压力下,也在不断进化反防御策略,双方的这种进化关系与发生机制一直尚不完全清楚。近年在细菌和古细菌中发现一种新的免疫防御系统,即CRISPR-Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated system)系统。在对其功能和作用机制深入研究的同时,也不断地揭示了细菌和噬菌体之间的共进化关系。为此,文章在介绍原核细胞中CRISPR-Cas系统介导的免疫机制基础上,重点综述了CRISPR系统在细菌和噬菌体进化中的作用。

基于CRISPR-Cas系统的基因组定点修饰新技术

CRISPR(clustered regulatory interspersed short palindromic repeat)序列源于原核生物的一种获得性免疫系统,协同Cas(CRISPR-associated)蛋白家族参与抵抗噬菌体或其它病毒的二次感染,广泛存在于细菌(60%)和古菌(90%)中.病菌和宿主的共同进化导致了CRISPR-Cas系统具有多样性,可分为3大类(Ⅰ-Ⅲ),又分为10亚类.在Ⅱ型CRISPR-Cas系统基础上建立了RNA介导的CRISPR-Cas系统来修饰(删除、添加、激活、抑制)靶细胞中特定的基因序列,现已在人类细胞、小鼠、斑马鱼、酵母、细菌、果蝇、线虫、拟南芥中得以应用.本文主要介绍了Ⅱ型CRISPR-Cas系统的结构特点、作用机理及作为新型基因组定点修饰技术的研究进展,分析该技术优势,并展望CRISPRCas系统的应用前景.

乳酸菌CRISPR-Cas系统研究进展

对乳酸菌CRISPR-Cas系统(即:成簇的、规律间隔的短回文重复序列及相关Cas蛋白系统)抗噬菌体机制以及噬菌体进化出的相应免疫逃逸机制进行综述,旨为进一步研究噬菌体抗性乳酸菌发酵剂奠定基础。

空肠弯曲菌CRISPR-Cas系统生物信息学分析

为分析GenBank中登录的国内外空肠弯曲菌及其亚种中所含CRISPR-Cas系统的结构特征及同源关系,本研究利用生物信息学方法预测GenBank中已登录的空肠弯曲菌所含的CRISPR-Cas系统的基因序列,对其进行比对、保守性分析、RNA二级结构预测、重复序列的GC含量分析及其遗传进化分析。结果显示,空肠弯曲菌及其亚种中所含CRISPR-Cas系统的重复序列高度保守、GC含量较低(28.57%以下),差异性主要呈现于两端游离部分;CRISPR中的间隔序列差异性较大致使CRISPR具有多态性;Cas蛋白序列同源性较高(96.8%以上),遗传动态变化较低,与基因水平转移产生的趋同进化有潜在相关性。空肠弯曲菌CRISPR-Cas系统中的间隔序列具有多态性与该菌的遗传进化差异有关,重复序列及cas基因保守性较强,与其共同进化有潜在相关性。通过对不同空肠弯曲菌CRISPR-Cas系统生物信息学分析,为进一步研究该菌CRISPR-Cas系统结构特征、基因进化关系奠定了基础。

CRISPR-Cas系统在生物学研究中的应用

成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,简称为CRISPR)系统是一种新的基因修饰技术,具有制作周期短、成本低和作用高效等优点。本文从结构、研究历史、分类和分布、作用机制和其在生物学研究中的应用等方面介绍CRISPR-Cas系统。

CRISPR-Cas系统介导的基因组编辑和基因转录调控

CRISPR是一个特殊的DNA重复序列家族,其基因结构的主体是由同向重复序列(repeat)与间隔序列(spacer)构成的多段R-S结构组成,称为CRISPR基因座(CRISPR locus)。在CRISPR位点的一端存在几组编码蛋白质的基因序列,称为CRISPR相关(CRISPR-associated,Cas)基因,其编码的蛋白质称为CAS蛋白。利用CRISPR-Cas9系统对DNA分子的靶向切割特性,使其可被用于定向的基因修饰。除用于定点的基因编辑,CRISPR-Cas系统也可用于干扰目的基因的转录。

基因编辑技术CRISPR-Cas系统与宫颈癌相关性的研究进展

CRISPR是细菌和古生菌经过亿万年的长期进化而产生出的一种适应性免疫防御系统,它能够通过crRNAs直接降解外源入侵DNA,从而保护自身结构的完整性和连续性。CRISPR-Cas基因编辑是一种由RNA引导的基因编辑技术,与锌指核酶、转录因子核酶等传统基因编辑技术相比,具有成本低、效益高、灵活性强、易于操作等优点[1]。

血流感染肺炎克雷伯菌中CRISPR-Cas系统的分布及其与毒力基因和耐药的关系

目的了解血流感染肺炎克雷伯菌中CRISPR-Cas系统的分布特征并分析其与毒力基因和耐药的关系。方法收集非重复血流感染肺炎克雷伯菌248株,使用Vitek2-Compact全自动微生物分析系统进行菌株鉴定及药物敏感性分析,PCR检测CRISPR-Cas系统3个相关基因(CRISPR1、CRISPR2和cas1)、筛查6种常见高毒力荚膜血清型(K1、K2、K5、K20、K54和K57)、12种毒力基因及检测13种耐药基因,用x”检验比较携带有CRISPR-Cas系统菌株与不携带CRISPR-Cas系统菌株毒力及耐药差异。结果CRISPR-Cas系统的检出率为29.8%(74/248);K1型是携带CRISPR-Cas系统肺炎克雷伯菌的主要荚膜血清型,占28.4%(21/74);除kpn基因外,携带CRISPR-Cas系统菌株的毒力基因检出率均大于不携带CRISPR-Cas系统菌株,其中7种差异有统计学意义;除对氨苄西林耐药率达100%外,携带有CRISPR-Cas系统菌株的其他抗菌药物耐药率均小于不携带有CRISPR-Cas系统菌株,其中13种差异有统计学意义;携带CRISPR-Cas系统菌株的耐药基因阳性率小于不携带CRISPR-Cas系统的菌株,且blape、blasy、qnrS基因差异有统计学意义。结论高毒力荚膜血清型肺炎克雷伯菌中主要为K1型携带CRISPR-Cas系统,携带CRISPR-Cas系统的肺炎克雷伯菌相对于不携带CRISPR-Cas系统菌株的毒力基因阳性率高,耐药率低,耐药基因的阳性率低。CRISPR-Cas系统可能能降低耐药基因在肺炎克雷伯菌中的水平传播,尤其是在K1型肺炎克雷伯菌。

血流感染肺炎克雷伯菌毒力基因分布及与CRISPR-CAS系统相关性研究

目的分析该院血流感染阳性肺炎克雷伯菌的常见荚膜血清型和毒力基因分布特征,探讨毒力基因与成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关序列(CRISPR-CAS)系统的相关性。方法收集Bac T/ALERT 3D全自动培养仪报告阳性的血培养瓶并经鉴定为肺炎克雷伯菌61株,运用纸片扩散法和Vitek-compact2仪器法检测菌株对临床常用抗生素的敏感性,用拉丝实验筛选高黏液型肺炎克雷伯菌,聚合酶链式反应(PCR)检测6种常见荚膜血清型(K1、K2、K5、K20、K54、K57)、7种毒力相关基因(rmpA、aerobactin、alls、Kfu、wcaG、magA、fimH)及3种CRISPR-CAS系统基因(CRISPR-1、CRISPR-2、CAS1)。结果荚膜血清型以K1、K2型为主,检出率分别是19.7%、13.1%。K5、K20、K57各检出1例,未检出K54型。毒力基因rmpA、aerobactin、alls、Kfu、wcaG、magA、fimH检出率分别是32.8%、23.0%、9.8%、31.1%、19.7%、19.7%、98.4%。高黏液表型筛选出14株。CRISPR-CAS系统阳性检出11株,检出率为18%,与CRISPR-CAS系统阴性菌株相比,其毒力基因携带率高,经χ~2检验,差异有统计学意义(P<0.05)。结论血流感染肺炎克雷伯菌荚膜血清型以K1、K2为主,毒力基因主要存在于表型为高黏液型的菌株,CRISPR-CAS系统阳性菌株毒力基因携带率高。

基于CRISPR-Cas系统的病原体检测研究进展

开发快速、灵敏、特异的检测方法对于新发突发人兽共患病、动物疫病的监测及防控至关重要。规律成簇的间隔短回文重复序列及相关蛋白(CRISPR-Cas)系统以高敏感性、特异性及可扩展性的DNA和RNA识别为特点,已成为新一代的分子诊断工具,在病原体快速检测技术研发中得到广泛应用。在新型冠状病毒肺炎疫情中,基于CRISPR-Cas系统开发的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)检测试剂盒(SHERLOCK和DETECTR)在美国相继获批,中国研发的基于CRISPR-Cas12系统的SARS-CoV-2检测试剂盒也已获批上市,这表明基于CRISPR-Cas系统的病原体检测方法在未来的应用前景非常可观。文章首先简述了CRISPR-Cas系统类型,尤其是常用于病原体检测的Cas9、Cas12和Cas13;介绍了CRISPR-Cas系统的作用机理以及广泛应用。同时分析了CRISPR-Cas检测平台研发的关键技术问题,包括靶标基因的序列保守性、靶标基因的富集与扩增、终信号不同的读取方式等,并对CRISPR-Cas系统的未来发展及应用前景进行了展望。

CRISPR-Cas系统在食品微生物中的应用研究进展

成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)及其关联蛋白(CRISPR-associated proteins,Cas)构成CRISPR-Cas系统,该系统作为高效、灵活、易于操作的基因编辑技术,开始广泛应用于微生物基因组位点的靶向编辑中。本文针对CRISPR-Cas9系统在食品微生物领域,特别是在食品酿造微生物和食品病原微生物中的应用进行综述,并进一步讨论影响该系统基因编辑效率的主要因素及发展方向,为CRISPR-Cas9系统在食品微生物中的应用提供参考和依据。