基于RAA-CRISPR/Cas12a技术的桃成分单管一体化快速检测方法

通过设计特异性的桃重组酶介导的等温扩增(recombinase-aided amplification,RAA)和CRISPR RNA(crRNA)引物,建立RAA技术结合CRISPR/Cas12a系统的单管一体化桃成分快速检测方法,并分析该方法的特异性、灵敏度和检出限,同时对市售样品进行检测。结果显示,该方法不依赖大型仪器设备,在30 min内即可完成桃成分的快速检测;与其他常见水果物种之间无交叉污染,表现出良好的特异性;该方法的灵敏度为1.0×10-1 ng/μL;检出限为1%;通过对20份市售样品检测,结果显示本方法与实时聚合酶链式反应法检测结果一致。因此,本研究建立的RAA-CRISPR/Cas12a单管一体化桃成分快速检测方法具有特异性好、灵敏度高的优点,为桃成分快速检测提供了一种新的技术。

基于CRISPR/Cas12a的叶酸代谢位点MTHFR基因C677T多态性检测方法的建立

目的开发一种基于CRISPR/Cas12a技术的叶酸代谢位点c.677(MTHFR C677T)的高效检测方法,以实现对C677T多态性的快速、准确分析。方法采用重组酶聚合酶扩增(RPA)结合CRISPR/Cas12a建立单管检测反应体系,建立人MTHFR基因C677T基因分型策略;测试200例孕妇人群样本MTHFR基因C677T多态性,并与常规PCR产物测序结果进行一致率比较。结果基于CRISPR/Cas12a检测人MTHFR基因C677T多态性的检测方法结果准确、特异性好,与PCR产物测序结果具有高度一致性。结论建立的基于CRISPR/Cas12a检测技术的人MTHFR C677T基因分型方法简单、快捷、精准,为叶酸代谢位点MTHFR C677T基因型检测提供了新的途径,具有潜在的临床应用前景。

CRISPR/Cas12a系统:核酸检测的多功能工具

规律成簇的间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)是原核生物的适应性免疫系统,对抗外来遗传物质(如质粒和噬菌体)的攻击。近年来,科学家们发现了一种新型基因编辑工具,一种强大的分子剪刀CRISPR/Cas12a系统,该系统在对靶标DNA进行切割的同时还具有对体系内单链DNA进行任意切割的活性,并将其转移到体外检测系统。本文对CRISPR/Cas12a系统组成、结构、Cas12a与Cas9的对比和CRISPR/Cas12a系统在核酸检测中的应用进行了综述。

CRISPR/Cas12a技术在动物疫病检测方面的应用

CRISPR/Cas系统是由簇状规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关蛋白(Cas)组成的一种基因编辑技术,可以特异地切割和识别靶标核酸基因。该技术具有检测速度快、灵敏度高和特异性强的优势,因此被广泛应用于动物疫病检测领域。本文就CRISPR/Cas12a结合等温核酸扩增技术和可视化技术在动物疫病检测中的应用进行综述,并对其应用前景进行展望,以期为我国的养殖业和进境动物疫病的监测提供技术支撑。

CRISPR-Cas12a系统及其在家禽病原检测中的应用研究进展

病原微生物是影响家禽健康的重要因素之一,严重阻碍了家禽养殖业的快速发展,因而开发快速高效的病原检测方法对于家禽疫病的有效预防和控制具有十分重要的意义。CRISPR-Cas12a是一门新兴的基因编辑工具,具有高度的特异性、敏感性以及操作简便等优点,通过与聚合酶链式反应(PCR)、等温核酸扩增(LAMP)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、重组酶介导等温扩增(RAA)等方法相结合,可大大提高检测效率及准确性,通过使用荧光信号、侧向层析试纸条等技术,还可使检测结果可视化,在病原检测中发挥了重大作用。本文综述了CRISPR-Cas12a系统作用机制及其结合多种核酸扩增技术在家禽病原检测中的应用研究进展,以期为家禽疫病的诊断和防控提供参考,为未来开发更有效的检测平台奠定基础。

基因Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒RAA-CRISPR/Cas12a检测方法的建立

为建立一种特异性强、灵敏度高、操作便捷的Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV-Ⅱ)检测方法,研究利用重组酶介导链置换核酸扩增技术(Recombinase-aid amplification,RAA)与成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统相结合,构建了GCRV-Ⅱ病毒RAA结合CRISPR/Cas12a可视化“一步”快速检测方法。首先选择GCRV-Ⅱ毒株间序列保守,不同基因型GCRV间差异明显的s6基因(GQ896337)的保守区设计5对RAA候选引物和2对crRNA,合成并筛选出特异性引物和crRNA组合。其次测试反应的特异性、灵敏度和准确性。最后建立下层扩增相、上层检测相的“一步法”反应体系。该检测方法在37℃恒温下反应可检测出GCRV-Ⅱ,最低检测限为10^(2) copies/μL。对24份临床样本进行检测,该检测方法阳性检出率高于现行国标PCR法。研究建立的GCRV-Ⅱ检测方法操作便捷、特异性高、灵敏度好、可重复性强、与设备兼容性好、在蓝光灯下可通过肉眼判断检测结果。

RT-RAA联合CRISPR/Cas12a快速检测新型冠状病毒方法的建立与评价

目的建立一种基于反转录酶-重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)联合簇状规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)/Cas12a系统的快速检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的方法,并对其进行评价。方法根据NCBI数据库中SARS-CoV-2的核衣壳(N)基因设计RT-RAA引物和CRISPR来源RNA(crRNA),优化检测体系中乙酸镁(MgAc)用量、RT-RAA反应温度和时间以及LbCas12a反应温度。以100~106 copies/μL重组质粒和其他呼吸道病原体分别评估该方法灵敏度和特异性。采用RT-RAA-CRISPR/Cas12a法和RT-PCR法对70份临床标本进行平行检测,比较两种方法的符合率。结果优化后的RT-RAA-CRISPR/Cas12a检测方法可在37℃条件下50 min内完成SARS-CoV-2检测。荧光法检测灵敏度为10 copies/μL,侧流层析法为1×102 copies/μL。该方法能特异检测SARS-CoV-2,与其他呼吸道病原体无交叉反应。RT-RAA-CRISPR/Cas12a法检测70份临床标本的结果与RT-PCR法完全一致,符合率为100%。结论建立的RT-RAA-CRISPR/Cas12a法检测SARS-CoV-2快速、经济、灵敏度高、特异性强,无需昂贵仪器设备,可由经验不足的人员操作,为临床快速诊断和现场大规模筛查SARS-CoV-2提供了新的思路和方法。

基于RPA-CRISPR/Cas12a的美国白蛾可视化快速检测新方法

美国白蛾Hyphantria cunea Drury是我国重要林业害虫,寄主植物众多且分布范围广泛。本试验基于重组酶聚合酶扩增(RPA)和CRISPR检测技术,构建美国白蛾RPA-CRISPR/Cas12a分子检测体系。根据NCBI数据库中的美国白蛾及近缘种、近似种线粒体COⅠ基因片段信息以及昆虫样本CO I基因测序比对结果为模板,设计美国白蛾特异性RPA引物和CrRNA,通过RPA扩增目标序列,结合CRISPR检测技术并对反应条件进行优化,最终该体系灵敏度可检测的最低限度1.0×10^(-1) ng/μL,较RPA结合普通凝胶电泳提高了100倍,检测体系在30 min内即可实现对害虫的现场快速、可视化、精准鉴定。为美国白蛾现场检测提供理论和实践依据,有助于保护森林资源和生态环境的安全。

基于CRISPR Cas12a的等温核酸检测技术用于新型隐球菌高敏诊断的临床研究

目的:构建基于CRISPR Cas12a的高敏等温核酸检测方法,并评估其在支气管肺泡灌洗液及脑脊液中对于新型隐球菌的诊断能力。方法:利用NCBI Blast确定新型隐球菌保守序列,针对保守序列,设计等温重组酶聚合酶扩增引物及crRNA序列。利用新型隐球菌标准菌株及其他菌株(白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、金黄色葡萄球菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌),提取其核酸,以评估方法的特异性及最低检测限。进一步收集临床确诊的10例肺部及10例中枢神经系统新型隐球菌感染患者的支气管肺泡灌洗液及脑脊液,以评估本研究构建的核酸诊断方法的临床检测性能。结果:共设计6组引物及crRNA组合,经筛选得到1组最佳组合。本研究构建的检测方法特异性高(与7种其他类型菌株无交叉反应),最低检测限达到5 copies/μL,整个检测流程速度快(在1 h内完成)。针对10例支气管肺泡灌洗液及10例脑脊液临床标本的阳性检出率均为100%。结论:本研究构建的新型核酸检测方法,具有高度的特异性和良好的检测限,在临床标本检测中同样具有优良检测性能,具备了较强的临床新型隐球菌核酸检测的应用潜力。

NoV GⅡ.2亚型RT-RPA-CRISPR/Cas12a检测方法的建立

近年来,一种新的诺如病毒GⅡ.2亚型(norovirus GⅡ.2,NoV GⅡ.2)通过牡蛎等生食海鲜感染人群,引发急性胃肠炎,并在全球广泛传播。为实现NoV感染的现场诊断和快速疫情响应,亟需建立快速便捷的NoV GⅡ.2亚型核酸检测方法。本研究通过设计引物、crRNA,经优化反应条件后,建立了NoV GⅡ.2亚型RTRPA-CRISPR/Cas12a检测方法。结果显示:利用引物NoV-GⅡ.2-F1B和NoV-GⅡ.2-R1对NoV GⅡ.2标准RNA进行RT-RPA扩增,结合crRNA1介导的CRISPR/Cas12a报告体系,能在40 min内完成NoV GⅡ.2核酸检测;该方法检测灵敏度为10 copies/μL,且与轮状病毒、腺病毒、星形病毒、人副肠孤病毒、博卡病毒和札如病毒无交叉反应;应用该方法和qRT-PCR法,分别对30份临床模拟样本进行检测,发现总符合率达96.67%。结果表明,本研究建立的NoV GⅡ.2亚型RT-RPA-CRISPR/Cas12a检测方法无需依赖昂贵设备,具有灵敏度高、特异性强、操作便捷快速等特点,为NoV GⅡ.2感染的现场检测和防控提供了新方法。

基于RPA-CRISPR/Cas12a的番茄花叶病毒可视化检测方法的建立

番茄花叶病毒(tomato mosaic virus,ToMV)属于植物杆状病毒科Virgaviridae烟草花叶病毒属Tobamovirus成员,主要危害番茄和辣椒,多数茄科植物易感染,严重影响果实的品质和产量。本研究根据ToMV编码的外壳蛋白的基因保守序列,设计重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)特异性引物和簇状规则间隔短链重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)及相关蛋白12a(CRISPR-associated 12a,Cas12a)的crRNA并挑选报告基因。通过优化反应体系建立了ToMV的快速可视化检测方法,当荧光报告基因FQ终浓度为400 nmol/L、Cas12a/crRNA比例为1∶5、终浓度为200 nmol·L^(-1)/1000 nmol·L^(-1)时检测信号最强,只需RPA和CRISPR/Cas12a分别反应15 min,即可在便携式蓝光照射设备下直接观察到阳性信号。该方法可特异性检测ToMV,对携带ToMV样品的RNA检测灵敏度可以达到172 ag/μL,是普通RT-PCR检测灵敏度的10000倍,可用于ToMV快速灵敏的可视化检测。

基于CRISPR/Cas12a的生物传感平台的机制研究及应用

CRISPR/Cas12a系统能够由可编程的RNA引导,准确识别特异的单链DNA或含有PAM序列的双链DNA,而后在目标底物进行切割的同时完成对非特异性单链DNA的迅速切割,该特性使其在生物传感应用中显示出巨大前景。近年来,CRISPR/Cas12a系统被广泛应用于生物标志物的辅助检测,其生物标志物传感平台已在可视化细胞途径、体内活体诊断等生物分子传感器的构建方面得到应用。本文基于CRISPR/Cas12a生物传感平台的构建原理,对不同应用情景下CRISPR/Cas12a系统的变体进行了总结,并对基于该系统的体外、体内传感平台的应用进行了重点介绍和归纳,进一步讨论了不同传感平台的特点。最后对目前应用的优点和局限性做出总结和展望,以期为该领域的研究与应用提供一定参考。

辣椒轻斑驳病毒RT-RAA-CRISPR/Cas12a可视化检测方法的建立

辣椒是重要的园艺作物,辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus,PMMoV)严重威胁辣椒等茄科园艺作物的生产安全。为提高PMMoV的防控效率,根据其编码外壳蛋白(Coat protein,CP)的基因保守序列,基于重组酶介导等温核酸扩增技术(Recombinase?aided amplification,RAA),设计了特异性RAA引物,实现对PMMoV的快速等温扩增,并基于CRISPR/Cas12a的设计原则,设计了crRNA靶向RT-RAA扩增产物。优化结果显示,总反应体系在报告基因FQ终浓度为400 nmol/L,Cas12a/crRNA比例为1∶5、终浓度为200 nmol/L和1000 nmol/L条件下检测信号最强,最终的RT-RAA反应和CRISPR显色体系分别仅需15 min,即可在便携式蓝光照射设备下直接观察到阳性信号。该方法可特异性检测PMMoV,对携带PMMoV的辣椒样品RNA的检测极限可达到1.34 pg/μL,分别是普通RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测灵敏度的1000倍和10倍。对实际样品中的检测结果显示,建立的RT-RAA-CRISPR/Cas12a检测技术可以在PMMoV侵染的辣椒和番茄叶片、果实及土壤中检测到PMMoV,可用于辣椒轻斑驳病毒的快速、灵敏、可视化检测。

鼠伤寒沙门氏菌CRISPR/Cas12a检测方法的建立与应用

目的建立快速、超灵敏检测食品中鼠伤寒沙门氏菌的方法。方法根据鼠伤寒沙门氏菌fliC基因保守片段设计并合成特异性CRISPR RNA(crRNA),并根据crRNA所在的基因序列区域设计重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)特异性引物,利用RPA技术扩增样本核酸,并对扩增产物进行CRISPR/Cas12a荧光检测。结果该检测方法克服了传统鼠伤寒沙门氏菌检测方法的缺陷,耗时短且具有较高的灵敏度,对鼠伤寒沙门氏菌的检出限低至1copy/μL,与乙型副伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、阪崎肠杆菌、大肠埃希氏菌等常见食源性致病菌核酸检测无交叉反应,且建立的方法在检测人工污染的食品样品时具有较高的灵敏度和准确性。结论本研究建立的检测方法耗时短、灵敏度高,可用于鼠伤寒沙门氏菌的快速检测。

基于AIEgens增强的CRISPR/Cas12a荧光探针设计及在单核细胞增生李斯特菌快速检测中的应用

研制了一种基于聚集诱导发光染料(aggregation-induced emission fluorogens,AIEgens)增强的荧光探针,建立了基于重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)结合CRISPR/Cas12a高灵敏检测单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)的新方法。利用阳离子AIEgens与双链DNA结合荧光极大增强的特性,构建了一种含双链以及单链DNA的探针。该探针5’末端携带一个荧光淬灭基团,双链DNA片段结合了多个AIEgens;利用crRNA可准确识别靶标序列并激活Cas12a反式切割活性的特点,切割荧光探针单链DNA产生荧光信号,从而实现LM高灵敏检测。将AIEgens增强型荧光探针与CRISPR/Cas12a结合,在无扩增情况下检测DNA片段的检出限为0.37 pmol·L^(-1),灵敏度较传统荧光探针高40倍。将以上检测体系与RPA反应联用,检测LM的检出限为3×10^(1) CFU·mL^(-1);该方法检测人工污染LM的牛奶以及金针菇样本,批内以及批间平均回收率介于91.14%~108.47%,变异系数小于12.71%。构建了一种基于AIEgens增强的CRISPR/Cas荧光探针,极大地提高了基于荧光信号输出的CRISPR/Cas方法检测灵敏度,实现了食源性致病菌的高灵敏检测。

基于CRISPR-Cas12a系统的鼠伤寒沙门氏菌可视化检测方法的建立

为了建立一种特异性强、灵敏度高的鼠伤寒沙门氏菌可视化检测方法,试验将聚合酶链式反应(PCR)与成簇的有规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated, CRISPR-Cas)系统相结合,首先根据鼠伤寒沙门氏菌的spy基因序列3′末端的保守区设计crRNA及靶标序列扩增引物,根据可视化检测原理设计单链DNA(single-stranded DNA, ssDNA)荧光报告探针;然后对靶标序列进行PCR扩增,将扩增产物加入CRISPR-Cas12a系统,在蓝光下通过肉眼观察是否产生绿色荧光实现对靶标的检测;最后进行特异性试验和灵敏度试验。结果表明:建立的方法仅能检测到鼠伤寒沙门氏菌,检测不到除鼠伤寒沙门氏菌外其他血清型的沙门氏菌及大肠杆菌、巴氏杆菌、鸭疫里默氏杆菌,能检测到循环数为14个的PCR产物和0.53 copies/μL的重组质粒,灵敏度优于常规PCR方法和实时荧光定量PCR方法。说明本试验建立的方法可以实现鼠伤寒沙门氏菌的可视化检测,具有特异性强、灵敏度高的特点。

基于CRISPR/Cas12a的侧流层析检测HPV技术的建立

目的建立一种基于CRISPR/Cas12a的侧流层析技术检测人乳头瘤病毒(HPV)的方法,以实现对HPV的简单、准确、快速筛查。方法通过将CRISPR/Cas12a结合PCR技术与侧流层析技术对常见的10种高危型HPV质粒亚型进行检测验证其可行性;着重对HPV16、HPV52、HPV58、HPV59四种亚型进行灵敏性及特异性验证;并对31例HPV临床样本进行检测,验证基于CRISPR/Cas12a的侧流层析技术(Lateral Flaw Assay based CRISPR,LFAC)的临床检测效能。结果通过应用LFAC检测,结果表明10种高危型HPV质粒均能产生明显的检测条带,表明该检测系统具有稳定性;对HPV16、HPV52、HPV58、HPV59四种高危型HPV质粒检测结果表明,该方法具有高特异性与高灵敏度,灵敏度检测下限为1.04×10^(4)copies/μL;31例临床样本检测结果总符合率为96.77%,根据LFAC检测结果绘制ROC曲线,灵敏度为0.920,特异度为0.626。结论通过将PCR技术、CRISPR/Cas12a和侧流层析法结合建立一种基于CRISPR/Cas12a的侧流层析技术,实现对HPV的可视化检测,为HPV的快速筛查与诊断提供了技术思路。

基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的猪繁殖与呼吸综合征病毒快速检测方法的建立

[目的]本研究将CRISPR/Cas12a系统与反转录重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)结合,拟建立一种基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)快速检测方法。[方法]分析不同基因型PRRSV全基因组序列,在3′-UTR端保守区设计重组酶介导等温核酸扩增技术(RAA)引物、crRNA及DNA报告底物分子,筛选RT-RAA最佳引物对。表达纯化AsCas12a蛋白,并以质粒为标准品,经RT-RAA扩增后,将产物加入CRISPR/Cas12a系统,建立PRRSV的CRISPR/Cas12a-RT-RAA检测方法,分别以PRRSV、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)核酸为模板验证建立方法的特异性,以不同浓度的pMD18T-PRRSV为模板验证建立方法的敏感性。以5.62×10^(6)、5.62×10^(3)、5.62拷贝数/μL的质粒为模板进行重复性试验,最后进行临床效果评价,将所建立的方法与实时荧光定量逆转录PCR方法进行比较。[结果]本研究成功表达并纯化获得具有良好剪切活性的AsCas12a蛋白,蛋白分子质量大小为196 ku;所建立的CRISPR/Cas12a-RT-RAA方法的检测下限可达5.62拷贝/μL;该方法具有良好的特异性,可特异性检测出PRRSV,不能检出其他猪病病毒PCV2、PEDV、CSFV和PRV,并具有良好的重复性。应用该方法对121份猪组织样品进行检测,与实时荧光定量逆转录PCR的阳性符合率为93.75%,阴性符合率为99.05%,总符合率为99.17%。[结论]本研究成功建立基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的PRRSV快速检测方法,该方法特异性强、灵敏性高、重复性好且不依赖复杂设备,可在现场和基层实验室使用。

猫杯状病毒RAA-CRISPR/Cas12a-LFS检测方法的建立及初步应用

为建立猫杯状病毒(FCV)基于重组酶介导的等温核酸扩增(RAA)结合CRISPR-Cas12a系统及侧向流层析试纸条(LFS)(RAA-CRISPR/Cas12a-LFS)的快速检测的方法,本研究基于FCV衣壳蛋白(VP1)基因序列保守区设计RAA引物、4对针对VP1靶标的扩增引物、4对VP1-cr RNA扩增引物和1条报告探针。利用4对VP1-crRNA扩增引物经退火和T7 RNA聚合酶转录合成4条靶标crRNA:VP1-1/2/3/4-crRNA,利用4对VP1靶标扩增引物经退火合成4条靶标双链DNA:VP1-1/2/3/4,经EnGen Lba Cas12a (Cpf1)核酸酶试剂的切割反应和Cas12a试纸条检测,根据出现条带的强弱筛选最佳VP1-crRNA。结果显示,VP1-2-crRNA对应的T线条带最强且C线不完全切割的条带最弱。因此选择VP1-2-crRNA进行后续试验。分别以FCV VR-782株及6株分离的FCV RNA为模板,利用RAA引物扩增其VP1基因,并通过琼脂糖凝胶电泳检测并评估RAA引物的扩增效果;利用Cas12a (Cpf1)核酸酶,以上述RAA扩增的VP1基因(来自FCV VR-782株RNA)为模板,在37℃恒温水浴30 min进行CRISPR/Cas12a-LFS检测,评估RAA产物、Cas12a、VP1-2-crRNA和ss DNA报告基团对CRISPR/Cas12a-LFS检测体系的重要性。RAA扩增效果的评估结果显示,从FCV VR-782株及6株分离的FCV RNA中均扩增到282 bp的VP1基因目的条带。重要性评估结果显示,只有上述4种试剂全部存在时CRISPR/Cas12a-LFS检测体系才能有效扩增。利用该方法检测FCV、猫疱疹病毒I型、支气管败血波氏菌、猫细小病毒、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、F81细胞,结果显示,该方法仅能够特异性检测FCV,而其他病原的检测结果 均为阴性,且分别在42℃30 min内和37℃40 min内完成对FCV的RAA扩增及CRISPR/Cas12a-LFS检测;利用该方法检测10倍倍比稀释的重组质粒标准品p MD18T-FCV-VP1以评估其敏感性,结果显示,该方法的检测限为37.5拷贝/μL,与本研究室建立的Taq Man荧光定量PCR方法的敏感性相当;分别利用同一批次和3批次配置的RAA-CRISPR/Cas12a-LFS体系分别检测不同浓度的重组质粒标准品p MD18T-FCV-VP1,以评估该方法的重复性,结果显示,该方法批内和批间重复性检测结果均一致;利用该方法和Taq Man荧光定量PCR方法同时检测临床采集的76份猫呼吸道拭子样品。结果显示,该方法检测到37份FCV阳性样品,39份阴性样品;Taq Man荧光定量PCR检测到36份FCV阳性样品,40份阴性样品。二者的阳性符合率达97.30%,阴性符合率97.50%,总符合率98.68%。本研究初步建立的FCV RAA-CRISPR/Cas12a-LFS检测方法简单、快速,且特异性强、敏感性高、重复性好、不依赖昂贵设备,为现场FCV的检测提供新的技术手段。

跨越式滚环等温扩增技术结合CRISPR/Cas12a定量检测海产品中的副溶血性弧菌

将CRISPR/Cas12a系统与跨越式滚环等温扩增技术(saltatory rolling circle amplification,SRCA)相结合,建立一种快速、灵敏定量检测海产品中副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)的方法(SRCA-Cas12a)。通过SRCA扩增靶标DNA,CRISPR/Cas12a系统识别靶标DNA并裂解单链报告探针,从而建立SRCA-Cas12a检测方法。分析该方法的特异性与灵敏度,并进行加标回收实验和实际样品检测。结果显示该方法可区分副溶血性弧菌和其他食源性致病菌,特异性良好。在最优检测体系下,建立了副溶血性弧菌菌液浓度的对数与荧光信号强度的线性关系,线性方程为y=1.8472x+2.4738(R^(2)=0.9866),检出限为3.6 CFU/mL(R_(SN)=3)。在人工污染样品中副溶血性弧菌的加标回收率为95.5%~104.4%。在实际样品检测中,该方法的敏感性为100.0%、特异性为95.2%、符合率为97.2%。本研究所建立的SRCA-Cas12a方法具有特异性好、检测限低的优点,为副溶血性弧菌的快速定量检测提供了一种新策略。