高加索三叶草种子内生细菌B7的分离鉴定及其促生特性

采用传统的分离培养手段从高加索三叶草种子内分离筛选出内生细菌B7,通过生理生化以及16S rDNA进行分子鉴定,结果表明菌株B7属于泛菌属(Pantoea sp.)。菌株B7在15%PEG6000干旱胁迫下能够正常生长,表现出较强的耐旱能力;在pH值5~11范围内均能生长,有良好的耐酸碱能力;兼具产IAA、分泌铁载体、固氮和溶磷能力,其中产IAA能力高达0.28 g/L,溶解有机磷、无机磷和产铁载体的指数分别是3.15、2.91和2.63,速率分别为2.15、1.91和1.63。菌株B7具有良好的促生效果,显著提高了高加索三叶草的株高、地上鲜重、地下鲜重与干重、叶长、叶宽、叶片数、叶面积、根长、根投影面积、根表面积、根尖数,促进了高加索三叶草的生长发育。

高加索三叶草与白三叶杂种F_(1)代表型遗传变异研究

对高加索三叶草(♀)、白三叶(♂)及其远缘杂交育成的8个F_(1)代株系的13个数量性状和7个质量性状进行调查,研究杂交F_(1)代表型的相对遗传力与杂种优势。结果表明:13个数量性状表型遗传多样性丰富,11个性状的变异系数超过10%;7个质量性状遗传多样性指数较低;F_(1)代表型遗传多为正向显性,相对遗传力a1最高可达1.92,母本对F_(1)代的相对遗传力较父本高;F_(1)代杂种优势最明显的是小花数与结实小花数,杂种优势率达65.03%和80.96%;聚类分析表明,8个F_(1)代与高加索三叶草距离较近,与白三叶距离较远。

三种三叶草幼苗期抗旱性差异的研究

在模拟干旱条件下测定了高加索三叶草、白三叶和红三叶幼苗期的抗旱生理指标。结果表明,随干旱时间的延续,三种三叶草都表现出相对含水量下降、细胞膜透性升高、游离脯氨酸含量增加、相对生长率下降等特征,但三种三叶草的反应速度及复水后各指标的恢复能力各不相同。综合评价后初步认为,高加索三叶草的抗旱性强于白三叶和红三叶。

高加索三叶草、白三叶及其杂种F_1代的ISSR分析

利用耐寒、耐旱的六倍体高加索三叶草与强固氮能力、生长能力的大兴安岭四倍体白三叶进行远缘杂交,通过胚拯救技术得到杂种F1,同时通过组培快繁技术建立了F1的再生体系。为了明确杂种F1与亲本在DNA水平上的差异,建立适用于F1的分子标记反应体系,利用ISSR技术对其进行了鉴定分析。结果表明,16个ISSR引物共扩增出170条条带,长度介于100～2000bp之间,多态性条带138条,多态性条带百分率为81.18%;4个供试材料间的遗传距离变幅为0.0756～0.6798,平均为0.5313;父本白三叶与母本高加索三叶草之间的遗传距离较大,F1与母本高加索三叶草的遗传相似系数较大,F1组培再生植株与杂种F1之间存在轻微差异;从分子水平鉴定了杂种F1的真实性,并确定了其与亲本之间的遗传差异。

高加索三叶草×白三叶胚萌发条件的探索

以六倍体高加索三叶草Trifolium ambiguum与四倍体白三叶T．repens为亲本，通过远缘杂交，采用组织培养手段对杂交胚的萌发条件进行探索。结果表明：以高加索三叶草为母本、白三叶为父本，在花期8：00-9：00授粉，授粉后12～13d取胚．用质量分数10％ NaCIO灭菌6．5～7min，在不加任何外源激素的改良MS培养基上，胚萌发率最高，达8％。高频扩繁时，再附加0．25mg／L2，4-D＋0．50mg／L6-BA可获得较高萌发率。

高加索三叶草和白三叶幼苗期抗旱性生理研究

试验在模拟干旱的条件下 ,测定了幼苗期高加索三叶草和白三叶在干旱胁迫下的抗旱生理指标 ,通过观测在干旱条件下的存活时间、叶片细胞质膜透性、游离脯氨酸含量、过氧化物酶活性等生理指标的变化 ,并与同期正常浇水组相比较。根据各指标的变化动态对幼苗期高加索三叶草和白三叶的抗旱性能进行了初步的研究和探讨。试验表明 。

高加索三叶草对不同降温模式的抗寒生理响应

为探究高加索三叶草(Trifolium ambiguum)对不同降温模式的生理响应,本研究通过非冷驯化降温(Non‐cold Acclimation,NA)和冷驯化降温(Cold‐Acclimation,CA)对高加索三叶草进行-6℃胁迫处理,观察叶片抗冻形态表现并测定6项生理指标,利用主成分分析筛选评价高加索三叶草在不同降温模式下的抗寒性的生理指标。结果表明:NA组和CA组的叶片在-6℃处理2 h后均能保持正常形态,且绝大部分叶片在24 h内能恢复正常;恢复7 d后,所有参试植株均重新长出新的叶片;随着冷冻胁迫时间的延长,CA组的丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、可溶性蛋白含量和可溶性糖含量均显著高于NA组;过氧化物酶(POD)活性、MDA含量和可溶性糖含量可作为NA组的抗寒指标,可溶性蛋白含量、SOD活性和叶绿素含量可作为CA组的抗寒指标。综上所述,高加索三叶草对于不同降温模式能启动相应的耐寒生理响应,具有较强的抗寒能力,具备在高寒草地引种栽培的潜力。

高加索三叶草和白三叶草再生体系的建立

高加索三叶草和白三叶草在饲料牧草中占有重要地位。本实验以其茎和叶为外植体材料,比较不同外植体的再生能力,探讨不同激素组合对愈伤组织诱导、继代培养以及植株分化的影响。结果表明茎的再生能力比叶片强。高加索三叶草在MS+2,4-D0.25?/L+6BA0.5/L的培养基中愈伤组织诱导生长最好,愈伤组织在MS+2,4-D0.2/L+6BA1.0/L+2%蔗糖培养基上生长迅速,质地良好,在MS+2,4-D 0.25/L+6BA 1.0/L培养基上植株分化率达75%;白三叶草在MB+在MB+2,4-D2.0/L+6BA 0.75/L培养基上诱导出完整植株。

基于代谢组学的‘蒙农三叶草1号’与结瘤相关的根系代谢物研究

为探究高加索三叶草与根瘤菌互作后根系代谢物的变化,本研究以‘蒙农三叶草1号’高加索三叶草(Trifolium ambiguum Bieb.‘Mengnong No.1’)为试验材料,通过设置接种与不接种根瘤菌处理,观察其结瘤效果,并运用代谢组学技术分析接种根瘤菌后根系代谢产物的变化。结果表明,在接种根瘤菌后,‘蒙农三叶草1号’根系出现结瘤现象,共有249个化合物含量发生显著变化,主要注释在“次生代谢产物生物合成”过程中;共有75个化合物富集在47个通路中,主要富集在“黄酮和黄酮醇的生物合成”和“类黄酮生物合成”过程中。其中有16个差异代谢物在结瘤过程中起重要作用,酮戊二酸、山奈酚、槲皮苷、根皮苷、杨梅素和黄豆黄甙促进了该三叶草结瘤过程,精氨酸促进根瘤的生长。本研究可为后期提高高加索三叶草结瘤效率提供理论参考。

高加索三叶草ISSR-PCR反应体系的建立与优化

高加索三叶草(Trifolium ambiguum Bieb.)是许多干旱和寒冷地区可以种植并在各方面表现优良的三叶草种,建立适用于高加索三叶草的ISSR反应体系,将为ISSR标记技术在三叶草属品种资源研究中的应用提供参考。本试验通过优化影响高加索三叶草ISSR-PCR的主要参数,建立适于高加索三叶草的ISSR反应体系和扩增程序。在25μL体系中各反应物的最适含量为:20 ng模板DNA,0.2 mmol/L dNTP,0.8μmol/L ISSR引物,1.0 U TaqDNA聚合酶,2.5μL 10×PCR Buffer,2.0mmol/L MgCl2。PCR扩增程序为:94℃预变性2 min,94℃变性30s,55℃退火45s,72℃延伸1 min,共30个循环;72℃延伸7min,4℃保温。

不同氮钾元素处理对白三叶与高加索三叶草杂交后代根系的影响

试验选取以白三叶为父本,高加索三叶草为母本的F_1株系,进行不同氮钾元素处理,分别测定根长、根直径和根表面积,以观察根部对不同氮钾的反应。结果表明:亲本和杂交后代在吸收钾离子的同时,也会受到氮元素的影响,根系各项指标均在施氮水平为N2和N3,施钾水平为K2和K3处理下出现最大值,在氮钾元素互作处理下,F_1和亲本表现为在N3K2处理下根系各项指标表现较好。

高加索三叶草响应不同降温模式低温胁迫的代谢组学分析

为探究高加索三叶草(Trifolium ambiguum Bieb.)对不同降温模式低温胁迫的代谢响应机制,本试验对其分别进行缓慢降温(Gradual cooling,GC)和骤然降温(Sudden cooling,SC)处理,利用广泛靶向代谢组学技术检测叶片代谢物,并比较2个处理组与常温对照组(CK)间的代谢物差异。结果表明:在高加索三叶草叶片中共检测出894种代谢物;与CK相比,在GC和SC处理组中分别筛选出124个和139个差异代谢物(Differential metabolites,DMs);2处理组的DMs均主要富集在氨基酸代谢和次生代谢产物的生物合成;紫铆因含量仅在GC组中显著增加(P<0.05),酪氨酸和新橙皮苷含量仅在SC组中显著增加(P<0.05);γ-氨基丁酸、亮氨酸、组氨酸、赖氨酸、柠檬酸、矢车菊素和木犀草素含量在2处理组均显著增加(P<0.05)。这些代谢物含量的增加可能是高加索三叶草适应低温胁迫的主要机制。

GA3和6-BA对高加索三叶草根蘖芽生长及内源激素含量的影响

为了研究植物生长调节剂赤霉素(GA3)和6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)对高加索三叶草根蘖芽生长发育及内源激素含量的影响,在不同浓度的GA3(0对照、300、600、900和1200 mg·L^-1)和6-BA(0对照、25、50、100和200 mg·L^-1),对其根蘖芽生长后的植株高度、叶片数、叶绿素含量和内源激素含量(地上部分和地下部分)进行测定与分析。结果表明:与对照相比,所有GA3处理均显著增加了株高(P<0.05)。尤其在600 mg·L^-1 GA3处理下,平均株高为21.33 cm(高于对照处理4.12倍)。GA3还促进了叶绿素a的合成,最显著效果是在600 mg·L^-1 GA3处理下,叶绿素a的浓度为0.92 mg·g^-1(高于对照76.92%)(P<0.05)。GA3对叶绿素b含量无显著影响(P>0.05)。在6-BA所有处理浓度下,株高约为对照处理2.6倍,并且对于叶片数,6-BA处理比GA3处理更敏感,在200 mg·L^-1时最多,高于对照2.99倍。6-BA显著促进了叶绿素a和b的积累(P<0.05)。内源激素含量在整个处理浓度下均显示出对外源激素应用的剂量反应。对于地上植物部分,600 mg·L^-1的外源GA3引起内源玉米素(ZT),GA3和生长素(IAA)分别增加约23.84%,55.71%和137.99%,而脱落酸(ABA)减少约44.09%。与对照相比,外源200 mg·L^-16-BA使内源ZT,GA3和IAA含量分别提高了约293.23%,49.71%和49.84%,而ABA降低了约52.48%。对于地下植物部分,内源激素变化与地上部分植物的响应大致相似,明显不同在于外源同样浓度GA3(600 mg·L^-1)和6-BA(200 mg·L^-1)处理引起的ABA降低要少(分别为15.15%和28.26%)。总之,600 mg·L^-1 GA3和200 mg·L^-16-BA是促高加索生长发育的最佳浓度。

不同降温模式下高加索三叶草的转录组比较分析

为探讨高加索三叶草(Trifolium ambiguum Bieb.)对不同降温模式低温胁迫的响应机制,本试验以缓慢降温(Gradual cooling,GC)和骤然降温(Sudden cooling,SC)处理对其进行了胁迫处理。通过转录组测序,比较了2个低温处理组与常温对照组(CK)间的转录组差异,并筛选了抗寒相关的基因和转录因子。结果表明:与CK相比,GC组和SC组中分别有8020个和6289个差异表达基因(DEGs);GC组的DEGs主要在光合作用、光合作用天线蛋白、淀粉和蔗糖代谢等通路显著富集,SC组的DEGs主要在淀粉和蔗糖代谢、倍半萜和三萜生物合成、类黄酮生物合成等通路显著富集。此外,2处理组共有的DEGs仅在淀粉和蔗糖代谢通路显著富集;一些涉及淀粉和蔗糖代谢与植物激素信号转导通路的基因在2种降温模式下均上调表达,可作为潜在的抗寒基因,如BAM3,BFRUCT1,SUS,GH3.1,SAPK2等。进一步分析发现响应低温胁迫的转录因子主要分布在AP2/ERF,ZFP,MYB等家族。

2种三叶草杂种F_1代胚性愈伤组织筛选

以高加索三叶草(Trifolium ambiguumBieb.)与白三叶(Trifolium.repensL.)杂交后胚离体培养产生的F1无菌苗的茎段为外植体,筛选诱导愈伤组织的最适培养基,将F1茎段产生的愈伤组织经过继代后转移到分化培养基中,研究不同浓度激素组合对体细胞胚胎产生的影响。结果表明:MS+6-BA+NAA是诱导F1茎段愈伤组织的适宜培养基;MS+2,4-D+6-BA+NAA+KT+CH为F1茎段愈伤组织的适宜分化培养基;对分化后的胚性愈伤进行组织学观察,可见其表面形成许多瘤状突起,即胚性细胞团,它们可以继续发育形成体细胞胚,为快速得到数量较多的杂种F1再生苗奠定基础。

高加索三叶草育种研究进展

高加索三叶草(Trifolium ambiguum M.Bieb.)作为一种具有耐寒耐热、抗旱抗病等优良特性的豆科牧草,具有饲用、水土保持、绿化、蜜源植物等多种用途。本文对高加索三叶草细胞学及系统分类、主要育种方法、栽培与管理等进行综述,以期为今后我国高加索三叶草育种改良提供参考依据。

高加索三叶草全长转录组测序及Dof转录因子家族分析

为探究面临长时间低温胁迫的高加索三叶草(Trifolium ambiguum Bieb.)的转录特征,本研究通过PacBio Sequel平台进行全长转录组测序,获得70590条全长转录本(isoforms)。Isoforms的功能注释结果为:与红三叶的同源相似率最高,涉及信号转导机制、刺激响应、淀粉和蔗糖代谢通路、植物激素信号转导通路的Isoforms较多。Isoforms的结构分析结果为:预测到19693个SSR、2668条LncRNA、2788个AS和2917条TFs序列,TFs中的ERF,C3H,Dof等家族含序列数量较多。Dof转录因子家族的生物信息学分析结果为:42个Dof家族成员全部为亲水蛋白,大部分定位于细胞核;系统进化树分析将高加索三叶草与拟南芥Dof蛋白聚类为11个亚族;保守基序Motif1和Motif2出现的频率较高。以上发现可为下一步抗寒基因挖掘和功能验证提供数据支撑,并为解析高加索三叶草耐受长时间低温胁迫的生理生化机制奠定理论基础。

江仓矿区高加索三叶草引种试验

青藏高原气候严寒,不利于引种牧草的生长和越冬。高寒矿区植被恢复过程中,可选用牧草种类.稀少,且以禾本科牧草为主,需要豆科植物成分来提高群落的稳定性。本研究在江仓矿区引进高加索三叶草,为一种在耐寒、耐旱、耐涝和耐牧性方面均表现良好的根茎型豆科牧草。高加索三叶草在江仓矿区的主要引种表现为:高加索三叶草在江仓矿区越冬率很高,连续三年维持在93%以上,不能开花结实,但绿期长达165 d,比当地优势植物的绿期长20d以上。引种后三年内,高加索三叶草的冠幅、分蘖数、根茎数、地上生物量、地下生物量、轴根数、轴根长、轴根直径、侧根数、侧根长等表征其生长特性和无性繁殖特性的指标均显著增长;绝对高度、自然高度、地上茎直径、根茎直径、鲜干比和叶量比等指标保持稳定,三年内差异不显著;此外,引种后高加索三叶草的结瘤性能表现良好,其结瘤数随年份增加显著增长,且90%以上为有效根瘤,标志着其固氮性能良好。总之,引种到江仓矿区的三年内,高加索三叶草在植株生长特性、无性繁殖、结瘤、固碳和固氮等方面均表现良好,适合于在江仓矿区引种、扩繁。

外源水杨酸对盐胁迫下三叶草种子萌发特征的影响

水杨酸是提高植物非生物胁迫的调节物质。研究采用裂区试验方法,进行了纸上发芽床试验。主处理为盐胁迫,副处理为水杨酸浸种,探究了水杨酸对盐胁迫下高加索三叶草杂交后代种子萌发的影响。实验结果表明:(1)盐胁迫抑制高加索三叶草杂交后代品系种子的萌发,种子的萌发状况随着盐浓度增高而变差;(2)适宜的水杨酸浓度对于缓解盐胁迫下高加索三叶草杂交后代品系种子萌发效果明显;(3)SA 0.4mM为盐胁迫下白三叶品系最适宜浓度;SA 0.1 mM是红三叶盐胁迫下萌发的最适宜浓度;0.3 mM SA为高加索三叶草、高加索三叶草与白三叶杂交后代盐胁迫下最适宜的浓度。