小麦TaLEA_4-1D基因的克隆及功能验证

干旱胁迫是影响小麦生长和产量的主要因素之一。胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA)能够响应多种非生物胁迫,在提高植物抗逆性方面发挥重要功能。为了探索LEA蛋白在小麦抵御干旱胁迫中的作用,本研究通过对小麦耐旱材料H611干旱胁迫前后的RNA-seq数据进行分析,筛选出10个TaLEA蛋白基因;克隆了TaLEA_4-1D基因,并对其进行生物信息学分析、表达分析和亚细胞定位,同时构建TaLEA_4-1D过表达拟南芥株系进行功能验证。结果表明,TaLEA_4-1D编码214个氨基酸,含有一个LEA_4保守结构域,蛋白分子量为21.97 kD,等电点为8.89,是亲水的稳定蛋白;二级结构和三级结构预测表明,此蛋白主要由α-螺旋(85.98%)和无规则卷曲(11.21%)组成。顺式作用元件分析发现,TaLEA_4-1D含有多个与植物激素诱导、生长发育和逆境胁迫响应相关的顺式调控元件。系统进化树分析显示,TaLEA_4-1D基因与节节麦、大麦、二穗短柄草、水稻等的LEA亲缘关系较近;亚细胞定位显示该蛋白位于细胞核和细胞质中。干旱胁迫下,过表达TaLEA_4-1D转基因拟南芥根长显著增加,其对干旱胁迫的耐受性增强,过表达植株表型优于野生型。

KMT2D基因新发变异致歌舞伎面谱综合征一例

歌舞伎面谱综合征(Kabuki syndrome,KS)是一种罕见的多系统发育异常的疾病,常在儿童期发病。报告1例因智力低下、发育迟缓就诊的患儿,经全外显子组测序检测相关致病基因,并对家庭成员进行Sanger DNA测序验证,发现患儿KMT2D基因存在c.6752delC(p.S2251Cfs*13)移码突变,经ClinVar和人类基因突变数据库(Human Gene Mutation Database,HGMD)等数据库搜索未发现此突变位点的记载,其父母未携带该变异,此突变为新发的致病性突变。基因检测结果提示患儿为KMT2D基因新发变异所致的KS1型,该突变位点丰富了KS的临床基因突变谱及临床数据,对于该病家系的遗传咨询具有重要意义。

细胞质雄性不育高粱叶绿体ndh D基因的序列变异(英文)

片段SAAU - 0 2 70 0 特异地扩增自 7种具可育细胞质的高粱材料的总DNA ,含有叶绿体psaC(88bp)和ndhD(192bp)基因的部分序列。该片段与EcoRⅠ +HindⅢ酶切的总DNA、线粒体DNA和叶绿体DNA杂交 ,在总DNA中获得了 0 .74kb的杂交带 ,而在叶绿体中获得 0 .74kb和 0 .4 5kb两条杂交带 ,与线粒体DNA无杂交 ;与经HaeⅢ酶切的总DNA杂交 ,在不育系中获得 4 .9kb的杂交带 ,而保持系的杂交带为 4 .4 5kb。参考GenBank中高粱的近缘物种玉米叶绿体基因组的序列 ,构建了ndhD基因区的酶切位点图谱 ,借此分析得出高粱不育系的叶绿体ndhD基因序列已发生改变。这种变异与高粱细胞质雄性不育发生的关系正在探讨中。

人工合成柞蚕抗菌肽D基因转化沙田柚

采用根癌农杆菌介导法将柞蚕抗菌肽Ｄ基因导入沙田柚上胚轴等外植体，经卡那霉素筛选，获得了若干转基因植株对这些植株进行胭脂碱电泳检测、点印迹杂交、ＰＣＲ扩增和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析。

2012年猪嵴病毒流行病学调查及3D基因的遗传变异分析

为了解猪嵴病毒(PKV)的流行及变异情况,本研究根据PKV的3D基因保守区域核苷酸序列设计一对特异性引物,并利用RT-PCR方法对2012年来自24个省市84个猪场的病料样品共计236份进行3D基因的检测。结果显示:在236份病料中,共有63份为PKV阳性,阳性率为36.69%;而在检测的84个猪场中,共有36个猪场显示PKV阳性,猪场阳性率为42.85%。此外,对2012年分离的9个PKV部分3D基因进行测序分析,并与GenBank中登录的人、牛、猪以及鼠等嵴病毒株相关序列进行遗传变异分析。结果表明9个PKV 3D基因与国内外其他PKV株无论是在核苷酸水平上还是在氨基端水平上均具有较高的同源性,表明PKV的3D基因具有较高的保守性,可以作为病原检测的靶基因。

抗菌肽D基因导入番茄及转基因植株的鉴定

用花粉管通道法将柞蚕抗菌肽D基因导入番茄 ,获得了转基因植株。应用PCR技术、DNA斑点杂交以及South ern印迹分析表明 ,抗菌肽D基因已整合到番茄基因组 ;而且 ,位于目的基因下游的胭脂碱合成酶基因有表达。青枯假单孢菌活体接种结合高发病大田种植试验结果显示 ,部分转基因植株的子一代具有较强的抗青枯病能力。

农杆菌法将抗菌肽D基因导入蕉柑胚性细胞的研究

用农杆菌介导的方法成功地将抗菌肽D基因导入到蕉柑胚性悬浮细胞 .再生芽经PCR、Southern杂交证明抗菌肽D基因已整合到其基因组DNA中 .在农杆菌介导的蕉柑胚性悬浮细胞转化过程中 ,共培养介质中的乙酰丁香酮 (As)能显著提高其转化效率 ,与对照相比 ,每克悬浮细胞转化后形成的抗卡那霉素细胞团数从 0提高到 0 .75 .悬浮细胞与农杆菌共培养时间对转化效率也具有显著影响 ,共培养 1、2、3d后 ,每克悬浮细胞转化后形成的抗卡那霉素细胞团数分别为 0 .2 0、0 75、0 .

昆明地区Rh阴性者RhD假基因(RhD ψ)和杂交RhD-CE-D基因的检测和医学应用

目的用PCR基因分型技术分析研究昆明地区常住人口Rh阴性血型的D基因多态性,建立和完善本地区Rh血型的PCRRhD基因检测方法。方法收集46例Rh阴性血型样本,首先采用外显子-SSP进行PCR扩增,筛选出5例D基因部分存在型,再采用内含子-SSP进行PCR扩增,扩增产物用于DNA测序。结果在46例Rh阴性血型样本中,D基因完整缺失者29例(63%);D基因完整存在者12例(26.1%),存在全部外显子;D基因部分存在者5例(10.9%)。DNA测序结果显示,2例仅存在D基因的第10外显子的样本均为RhD-CE(3-9)-D杂合基因,1例存在D基因的第4、6外显子为RhD-CE(2-3,5,7-9)-D杂合基因,是新发现的变异等位基因。结论(1)昆明地区常住人群存在高频率的RhD-CE(3-9)-D杂合基因。(2)在昆明人群发现一种新型D变异等位基因即RhD-CE(2-3,5,7-9)-D杂合基因。

I型鸭肝炎病毒VP1、3D基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据GenBank中的I型鸭肝炎病毒全基因序列设计了扩增I型鸭肝炎病毒VP1、3D基因的引物,用该特异性表达引物从I型鸭肝炎病毒cDNA模板中扩增得到目的基因VP1、3D,用相同的限制性内切酶酶切目的基因和表达载体pET32a后构建重组表达载体,转化宿主BL21(DE3),用不同浓度的IPTG诱导VP1、3D基因的表达,收集菌液进行SDS-PAGE电泳,Western-blotting分析蛋白免疫原性。结果表明,VP1、3D在大肠杆菌中表达量较高,表达产物的分子量约为48kD、68kD,并能被兔抗DHV-1血清所识别。I型鸭肝炎病毒VP1、3D蛋白在大肠杆菌中表达产物具有免疫原性。

儿科血液和脑脊液来源表皮葡萄球菌的抗生素敏感性和mecA/icaA/icaD基因研究

目的了解儿科血液和脑脊液来源表皮葡萄球菌的临床分布特征、抗生素敏感性和mecA/icaA/icaD基因的携带等情况,为临床表皮葡萄球菌感染的诊断和治疗提供一定的实验依据。方法儿科临床分离的表皮葡萄球菌采用VITEK 60全自动微生物分析仪结合GPI卡和GPS卡做常规鉴定和药敏,并运用WHONET5.4和SPSS13.0软件进行统计分析评价;用PCR方法检测mecA、icaA和icaD基因。结果 2010.01—2011.12期间,共检出442株表皮葡萄球菌,主要来自新生儿科110株(24.89%)、消化科72株(16.29%)、ICU 68株(15.38%)和呼吸科58株(13.12%);以血液来源为主(382株,86.43%)。所有表皮葡萄球菌中检出耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)378株(85.52%),总的β-内酰胺酶阳性率为86.43%。除万古霉素、利奈唑胺和利福平外,MRSE对克林霉素、氨苄西林/舒巴坦、庆大霉素、苯唑西林、复方磺胺甲噁唑、莫西沙星、红霉素、呋喃妥因、左氧氟沙星、青霉素G、四环素的抗生素敏感率低于甲氧西林敏感表皮葡萄球菌(MSSE),其差异有统计学意义(P<0.05)。对MRSE敏感率高的抗生素主要为:利奈唑胺(100%)、万古霉素(100%)、利福平(95.8%)、呋喃妥因(98.7%)、莫西沙星(72.8%)、左氧氟沙星(72%)等,而对MSSE敏感率高的抗生素主要为:利奈唑胺(100%)、万古霉素(100%)、苯唑西林(100%)、呋喃妥因(100%)、利福平(98.4%)、氨苄西林/舒巴坦(98.4%)、莫西沙星(92.2%)、左氧氟沙星(92.2%)等。未发现万古霉素和利奈唑胺耐药的表皮葡萄球菌。血/脑脊液组(412株)和非血/脑脊液组(31株)、2010年(256株)和2011年组(186株)不同来源组表皮葡萄球菌对上述所有抗生素敏感率差异均无统计学意义。mecA、icaA、icaD基因在血培养来源(50株)分别与非血培养来源(23株)和环境皮肤来源(22株)表皮葡萄球菌中的检出率比较无显著性差异。结论儿科临床分离的表皮葡萄球菌主要源自血液标本,以新生儿、消化科、ICU等科室检出率高;以MRSE和耐β-内酰胺酶阳性株为主,往往呈多重耐药,但尚无耐万古霉素和利奈唑胺的表皮葡萄球菌发现;MRSE和MSSE对大部分抗生素敏感性有差异,不同年份、不同标本组来源表皮葡萄球菌对常用抗生素敏感性尚较为稳定;表皮葡萄球菌mecA阳性率极高,icaA和icaD基因阳性率较低。

口蹄疫病毒3D基因在重组杆状病毒中的表达及检测

利用杆状病毒表达系统进行了口蹄疫病毒3D基因在Sf9细胞中的表达研究。首先克隆了3D基因片段,将pMD18_3D质粒及杆状病毒转座载体质粒pFastBacⅠ分别用EcoRⅠ及XbaⅠ酶切后,用T4DNA连接酶连接,构建了重组质粒pFastBac_3D;再将该重组质粒转化DH10Bac感受态细菌,在体内进行重组,并经三重抗性与蓝白斑筛选,得到杆状病毒重组质粒Bacmid_3D;将Bacmid_3D转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒,并进行表达水平的检测。经SDS_PAGE和West ernblot检测,结果表明,3D蛋白在重组杆状病毒中获得表达。

猪嵴病毒福建株3D基因的克隆及遗传进化分析

根据GenBank中登录的猪嵴病毒(porcine kobuvirus,PKV)3D基因序列特征设计特异性引物,采用RT-PCR方法从福建省某猪场采集腹泻粪便样品和小肠组织混合物中扩增猪嵴病毒3D基因,将扩增后的目的片段克隆后进行序列测定。结果表明,所扩增的目的片段编码有完整的3D开放阅读框,全长为1 407bp,编码有468个氨基酸。运用生物信息学软件,将获得3D基因序列和GenBank的猪嵴病毒株3D基因序列进行分析比较,该毒株的3D基因序列和SH-W-CHN/2010/China毒株的核苷酸同源性最高,为93.6%,与WH1株核苷酸同源性最低,为92%。从遗传进化上看,猪嵴病毒和其他中国株在遗传进化上处在一个同一分支,匈牙利分离株处在另一分支,表明猪嵴病毒可能在欧亚大陆上各自独立进化。

由反转录病毒载体转移的马立克病毒糖蛋白D基因在感染细胞中的表达

用ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ将已分离和克隆的马立克氏病病毒糖蛋白Ｄ（ｇＤ）基因从重组ｐＭｇＤ１８质粒中切出，克隆进反转录病毒质粒载体（ＲＣＡＳ）的连接质粒载体ｐＵＣＣｌａ１１２Ｎ的相同位点。用ＣｌａＩ再将ｇＤ重组ｐＵＣＣｌａ１１２Ｎ中的ｇＤ基因切出，构建于ＲＣＡＳ的ＣｌａＩ位点。通过原位杂交筛选重组ＲＣＡＳ，并结合酶切分析鉴定出ｇＤ插入方向正确的重组ＲＣＡＳ。用磷酸钙沉淀法将ｇＤ重组ＲＣＡＳ转染鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ），转染后第９天收集细胞上清，用其感染原代ＣＥＦ，在感染后第４天和第６天收集ＣＥＦ。提取ＣＥＦ基因组ＤＮＡ，用Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ（Ｄｉｇ）标记ｇＤ基因片段作为探针，通过Ｄｏｔ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ检测基因转移情况。用上述上清再次感染原代ＣＥＦ，在第６天用异硫氰酸胍－氯化铯离心法提取感染细胞总ＲＮＡ，用Ｄｉｇ和３２Ｐ标记ｇＤＤＮＡ为探针，分别用Ｄｏｔ和Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ检测ＭＤＶｇＤｍＲＮＡ。结果表明，转染的重组ＲＣＡＳ不仅在细胞内成熟为具传染性的完整病毒。

KMT2D基因突变所致的Kabuki综合征6例报告并文献复习

目的探讨KMT2D突变引起的Kabuki综合征(KS)的临床、遗传学特点及其在新生儿期的临床特征。方法采用全外显子组测序(WES)和临床panel的二代测序技术,结合复旦大学附属儿科医院分子诊断中心建立的数据分析流程,行相关基因测序和数据分析,对6例KMT2D基因突变患儿的临床及分子生物学特征进行总结。计算机检索Pub Med、中国知网、维普、中国生物医学文献和万方数据库,收集KS相关文献,检索时间从2012年4月至2017年4月,对描述新生儿期临床特征的文献进行提取、归纳和总结。结果 6例KS患儿,男4例,女2例。其中3例在婴儿期均因KS相关临床表现,家属要求行家系WES确诊,1例新生儿经临床panel检测后确诊,2例因家属要求对患儿进行WES测序确诊。6例KS患儿共检测到7个KMT2D基因的杂合突变,分别位于11、39、51和53号外显子,包括1个终止、4个错义和2个移码突变。其中c.12697C>T(p.Q4233X)、c.16498C>T(p.R5500W)、c.16273G>A(p.E5425K)为人类基因突变数据库(HGMD)已收录的致病突变位点。c.12696G>T(p.Q4232H)、c.3495del C(p.Pro1165Leufs Ter47)、c.10881del T(p.Leu3627Argfs Ter31)、c.12560G>A(p.G418E)为新发突变位点。经SIFT、Polyphen 2和Mutation Taster软件预测为有害突变。纳入18篇KS新生儿期起病文献加上本文2例(34例),新生儿期表现为喂养困难(19例),心脏发育异常(20例),特殊容貌(17例),骨骼发育异常(15例),低血糖(10例)和肌张力低下(9例)等。结论 KS的典型临床表型在新生儿期还未完全呈现,当新生儿有喂养困难、心脏发育异常、特殊容貌等临床特征时需考虑KS,并尽早完善相关基因检测,实现早诊断、早干预。

转柞蚕抗菌肽D基因辣椒的目的基因及表达产物检测

应用现代生物技术,从核酸和蛋白质水平对转柞蚕抗菌肽D基因辣椒第4代的目的基因进行了检测。发现所分离的柞蚕抗菌肽D基因与原设计的序列一样;辣椒组织中也含有抑菌物质,经与天然抗菌肽D对比,表明抗菌肽D基因得到了表达。

韧皮部特异启动子驱动密码子优化的抗菌肽D基因的植物表达载体构建

根据177个GenBank中登录的柑橘编码蛋白密码子用法的分析结果,优化并重新设计和合成了含柑橘偏爱密码子、对柑橘黄龙病有杀灭作用的柞蚕抗菌肽D基因(命名为CAPD),克隆入pUC19克隆载体并经测序验证后,获得了含新抗病基因的重组质粒pUC19-CAPD。用限制性内切酶BamHI和SacI双酶切pUC19-CAPD克隆载体和pBI121植物表达载体的质粒DNA,回收pUC19-CAPD克隆载体中的CAPD基因小片段和pBI121植物表达载体中去掉GUS报告基因的大片段,经连接、转化和鉴定后,构建了由CaMV35S组成型启动子(35SP)驱动CAPD目的基因的新植物表达载体(命名为pHZ05);用限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切含笋瓜韧皮部特异启动子(PSP)的pUCm-PSP克隆载体和pHZ05植物表达载体的质粒DNA,分别回收pUCm-PSP克隆载体中的PSP小片段和pHZ05植物表达载体中去掉CAPD目的基因上游35SP的大片段,经连接、转化和鉴定后,构建了由PSP驱动CAPD目的基因的新植物表达载体(命名为pHZ06)。利用细胞感受态法直接将2个由不同启动子驱动的含CAPD目的基因的新重组植物表达载体分别导入根癌农杆菌LBA4404、GV3101、EHA105和发根农杆菌Ri15834等4个农杆菌菌株中,为利用农杆菌介导的遗传转化技术培育抵抗由韧皮部传导的毁灭性和检疫性病害柑橘黄龙病的新种质奠定了基础。

聚合酶链反应检测日本血吸虫5D基因的实验研究

目的：寻找一种有效的日本血吸虫病诊断及疗效考核方法。方法：以血吸虫的成虫、虫卵、尾蚴ＤＮＡ为模板，利用聚合酶链反应（ＰＣＲ）对日本血吸虫编码免疫原性毛蚴抗原的５Ｄ基因进行扩增，检测其敏感性与特异性。结果：用ＰＣＲ检测日本血吸虫的成虫、虫卵、尾蚴ＤＮＡ，均出现明显特异性条带。通过引物１、引物２单扩增，即能检测到单个虫卵、单个尾蚴或针尖大小的成虫组织。采用Ｎｅｓｔ－ＰＣＲ和非同位素探针能将敏感性进一步提高。常见的肠道细菌及人基因组ＤＮＡ无交叉阳性出现。结论：ＰＣＲ方法检测日本血吸虫基因的敏感性与特异性均满意。

口蹄疫病毒3D基因的克隆及其编码蛋白的结构和功能预测

采用RT-PCR技术,对AsiaⅠ型口蹄疫病毒的3D基因进行克隆,并对其序列进行比对,同时利用Ex-pasy等生物软件对3D蛋白的二级、三级结构及生物学特性进行预测和分析.结果表明:3D蛋白在口蹄疫各血清型间高度保守,分子中含有一个糖基化位点及多个酪氨酸、苏氨酸、丝氨酸位点,并存在一个单股正链RNA病毒依赖RNA多聚酶的催化区;结构特点显示3D蛋白为口蹄疫病毒复制所需的多聚酶.

中国荷斯坦奶牛EEF1D基因的SNPs检测及其与产奶性状的关联分析

试验旨在研究中国荷斯坦奶牛真核生物翻译延伸因子1 D(eukaryotic translation elongation factor 1delta,EEF1D)基因的多态性及其与产奶性状的相关性。利用Sequenom MassARRAY SNP分型技术对宁夏地区1 252头中国荷斯坦奶牛EEF1 D基因的多态性进行了检测,并对其多态位点不同基因型和组合基因型与产奶性状进行了关联分析。结果显示,EEF1 D基因的5′侧翼区存在2个SNPs位点,即EEF1D-1和EEF1D-3;经检测发现,EEF1D-1存在2种基因型,EEF1D-3存在3种基因型。χ2检验表明,中国荷斯坦奶牛在EEF1D-1位点偏离Hardy-Weinberg平衡状态(P<0.05),在EEF1D-3位点未偏离Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05);EEF1D-1和EEF1D-3位点多态信息含量(PIC)分别为0.10和0.28,分别呈现低度多态和中度多态。在试验群体中,EEF1D-1位点对乳脂率和乳蛋白率性状的效应均达到极显著水平(P<0.01),对305d产奶量性状的效应达到显著水平(P<0.05);EEF1D-3位点对305d产奶量、乳脂率和乳蛋白率性状的效应均达到极显著水平(P<0.01);EEF1 D基因的优势基因型组合GG-AG和GG-GG个体乳脂率均显著高于GG-AA组合个体(P<0.05)。说明EEF1 D基因可以作为影响中国荷斯坦奶牛产奶性状的候选基因用于标记辅助选择。

117名RhD阴性个体RHD基因序列分析

目的研究调查辽宁地区RhD阴性个体的分子机制及RHD基因的多态性。方法用间接抗球蛋白方法(IAT)确认RhD阴性个体,采用序列特异性引物-聚合酶链反应(PCR-SSP)扩增RHD基因特异性的外显子1～10,测序分析RHD基因全长编码序列;同时用特异性Rh盒子进行RHD基因的纯合性测定。结果在117名RhD阴性个体中,84例(71.80%)RhD阴性个体完全缺失RHD基因,23例(19.66%)RhD阴性个体携带RHD1227A等位基因,8例(6.84%)携带RHD-CE-(2-9)-D2融合基因,2例(1.71%)携带RHD 711delC等位基因。完全或部分含有RHD基因的个体均含有RhC抗原。结论辽宁地区RhD阴性个体的RHD基因具有丰富的多态性和不同的遗传背景,主要以RHD基因完全缺失为主,其次部分缺失和无缺失,并存在其他稀有基因型。