柠檬明串珠菌KM20中D-乳酸脱氢酶的特性

目的:分析柠檬明串珠菌中D-乳酸脱氢酶(D-LDH)的酶学特性。方法:对柠檬明串珠菌KM20中D-乳酸脱氢酶基因进行克隆表达并构建表达质粒,转化至Escherichia coli BL21(DE3)中实现过表达。结果:经Ni-NTA柱亲和层析纯化后,D-LDH-1与D-LDH-2编码的蛋白分子质量分别为40.0,38.5 kDa;比活力分别为2.18,153.10 U/mg;在丙酮酸还原中两种酶的最适pH值与最适温度均为8.0与40℃;而乳酸氧化时D-LDH-2的最适pH值与最适温度分别为12.0与30℃。D-LDH-1与D-LDH-2对草酰乙酸、苯丙酮酸和2-酮戊二酸具有较强的催化能力,且Ca^(2+)、Cu^(2+)和Na+对其酶活性均具有促进作用,Zn^(2+)与SDS对酶活性有极高的抑制作用。此外,两种酶对丙酮酸的Km值分别为2.98,6.11 mmol/L,对丙酮酸的K_(cat)/K_(m)分别为6.04×10^(2),2.28×10^(4)L/(mol·s),LDH-2对D-乳酸的K_(cat)/K_(m)为65.0 L/(mol·s)。结论:D-LDH-1与D-LDH-2为柠檬酸明串珠菌中催化D-乳酸合成的关键酶。

肠脂肪酸结合蛋白和D-乳酸在早期诊断嵌顿疝肠坏死中的应用研究

目的:探讨肠脂肪酸结合蛋白(I-FABP)和D-乳酸(D-LAC)早期诊断嵌顿疝肠坏死的价值。方法:选取36只SD大鼠,实验组(n=18)制作嵌顿疝动物模型,对照组(n=18)未制作。在术后30 min、2 h、4 h、6 h、8 h和12 h,采用ELISA检测两组血清D-LAC和I-FABP的水平;RT-qPCR鉴定嵌顿疝肠管组织中I-FABP的表达。通过嵌顿肠管大体标本、苏木素伊红(HE)染色和Chiu’s评分判定肠坏死情况。结果:与对照组相比,实验组在术后6 h时嵌顿肠管大体标本和HE染色呈典型肠绞窄表现,Chiu’s评分有统计学意义(P=0.001),血D-LAC明显升高(P=0.002);8 h时肠管逐渐向肠坏死过渡,血D-LAC进一步升高(P=0.012),血I-FABP也明显升高(P=0.001),并且肠组织中的I-FABP表达明显升高(P=0.002)。12 h时肠管呈现明显肠坏死特征、Chiu’s评分有统计学意义(P=0.001),血D-LAC和I-FABP均升至最高[(2019.60±16.17)μg/L vs(273.18±14.63)μg/L,P=0.001;(1210.94±5.96)μg/L vs(220.46±9.63)μg/L,P=0.001];肠管组织中的I-FABP表达最高[(8.20±0.60)μg/L vs(1.13±0.16)μg/L,P=0.001]。结论:嵌顿疝大鼠血清I-FABP和D-LAC水平升高,为早期诊断嵌顿疝肠管坏死的临床研究提供了依据。

高光纯D-乳酸生产菌株假肠膜明串珠菌HL64-1的分离鉴定及其发酵特性

从自然界中筛选分离产酸菌是获得高光学纯度乳酸生产菌株有效的途径之一。从腐烂果实中分离获得一株产高光学纯度D-乳酸菌株HL64-1,经形态学、16S rDNA序列分析、序列相似性Blast比对分析鉴定为假肠膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides)。在基础发酵培养基中摇瓶发酵24 h,产D-乳酸的量达到62.18 g/L,产酸速率达2.59 g/(L·h),光学纯度达99.90%(ee);在5 L发酵罐中放大培养,通过补加碳源,发酵72 h,D-乳酸产量达到78.74 g/L,平均产酸速率达1.09 g/(L·h)。该菌株可以有效利用农业副产物花生饼粉和棉籽粉作为替代氮源以降低发酵原料成本。该菌还可利用木糖产生D-乳酸,且葡萄糖能显著提高木糖的利用效率,极具工业应用前景。

厌氧表达乳酸脱氢酶以提高大肠杆菌产D-乳酸光学纯度

【目的】为解决在D-乳酸工业发酵生产中使用农业粗加工或废弃物等廉价原料(含有少量L-乳酸)而导致终产物D-乳酸光纯降低的问题。【方法】构建了带有不同启动子的L-乳酸脱氢酶基因lldD的表达质粒:pUC19-PLD(PpflBp6)、pUC19-NLD(PnirB)及pUC19-PNLD(PpflBp6-PnirB),并将它们分别转化入大肠杆菌D-乳酸工程菌HBUT-D中,得到菌株HBUT-D3、HBUT-D5和HBUT-D7。通过LldD的酶活检测以及对NBS培养基(添加1 g/L L-乳酸)发酵结果的TOPSIS多元评估,优选出可快速去除L-乳酸且不影响D-乳酸发酵的菌株,并使用农业廉价原料进行发酵。【结果】HBUT-D7的LldD比酶活为64 U/g,L-乳酸的消耗速率为34 mg/(L·h),D-乳酸的生产强度为4.09 g/(L·h),综合评估为最优菌株。以玉米浆为原料进行发酵时,HBUT-D及HBUT-D7的L-乳酸消耗速率分别为10.41 mg/(L·h)及34.75 mg/(L·h);D-乳酸生产强度分别为4.24 g/(L·h)及3.87 g/(L·h);D-乳酸光学纯度分别为99.07%及99.92%。以糖蜜为原料进行发酵时,HBUT-D及HBUT-D7的L-乳酸消耗速率为6.87 mg/(L·h)和17.18 mg/(L·h);D-乳酸生产强度分别为1.93 g/(L·h)及1.88 g/(L·h);D-乳酸光学纯度分别为99.22%及99.99%。【结论】厌氧诱导启动子的表达质粒可提高菌株HBUT-D7的L-乳酸脱氢酶酶活,使其在使用廉价原料发酵时能有效消除L-乳酸,提高发酵终产物D-乳酸的光学纯度。

血清内毒素、D-乳酸与慢性肾脏病肠源性尿毒症毒素的相关性研究

目的 研究肠道屏障指标血清内毒素、D-乳酸与慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)患者肠源性尿毒症毒素包括硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate, IS)、尿素氮的相关性。方法 选取2019年4月~2021年8月中国中医科学院望京医院肾病内分泌科门诊及住院患者共260例CKD患者,按照CKD分期分为CKD3期组(n=51)、CKD4期组(n=130)、CKD5期组(n=79)。记录患者年龄、性别、病程、既往病史,检测患者血清IS、尿素氮、血清内毒素、D-乳酸、血肌酐,估算肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate, eGFR),留取患者粪便,检测大肠杆菌、双歧杆菌菌落水平。分析血清内毒素及D-乳酸与肠源性尿毒症毒素的相关性。结果 一般资料比较,3组在年龄、性别、病程、既往合并糖尿病、双歧杆菌水平方面比较,差异无统计学意义(P>0.05),在既往合并高血压、冠心病、IS、血肌酐、尿素氮、eGFR、血清内毒素、D-乳酸、大肠杆菌方面比较,差异有统计学意义(P<0.05)。相关性分析:Spearman分析结果显示,血清内毒素、D-乳酸均与IS、尿素氮、血肌酐呈显著正相关(P<0.05),与eGFR呈负相关(P<0.05);Pearson分析结果显示,血清内毒素、D-乳酸均与大肠杆菌、双歧杆菌呈显著正相关(P<0.05)。多因素线性回归分析:IS是血清内毒素的独立影响因素(P<0.001),IS、尿素氮是D-乳酸的独立影响因素(P<0.05)。结论 CKD患者中血清内毒素及D-乳酸水平升高与肠源性尿毒症毒素相关。

D-乳酸对免疫低下小鼠的免疫调节作用

为探究酸奶中D-乳酸的免疫调节作用,该研究以环磷酰胺诱导的免疫低下小鼠为模型,评估低(75 mg/kg bw)、中(150 mg/kg bw)、高(300 mg/kg bw)3个剂量的D-乳酸对免疫低下小鼠的免疫调节作用。结果显示,中高剂量的D-乳酸可以显著恢复免疫低下小鼠的体质量、免疫器官指数和迟发型变态反应程度。此外,不同剂量的D-乳酸可以不同程度地改善骨髓抑制的相关指标,包括改善骨髓形态结构,恢复外周血细胞数量(白细胞和淋巴细胞),上调免疫细胞核转录因子(T-bet,GATA3)表达,提高血清细胞因子白细胞介素(interleukin,IL)-2、IL-4、免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)M水平等。综上,D-乳酸可以增强环磷酰胺诱导的免疫低下小鼠的免疫功能。

入院时CD11b平均荧光强度、血清锌、D-乳酸水平与轮状病毒肠炎患儿病情严重程度的相关性及其联合检测对患儿发生脓毒血症的预测价值

目的探讨中性粒细胞表面白细胞分化抗原11b(CD11b)平均荧光强度、血清锌、D-乳酸(D-LAC)水平与轮状病毒肠炎(RVE)患儿病情严重程度的相关性及其联合检测对患儿发生脓毒血症的预测价值。方法回顾性选取2022年1月至2023年12月驻马店市中心医院收治的168例RVE患儿纳入研究,根据是否并发脓毒血症分为发生组33例和未发生组135例。比较两组患儿的基线资料及CD11b平均荧光强度、血清锌、D-LAC水平,采用Spearman相关性分析各指标与RVE病情严重程度的相关性,采用受试者工作特征(ROC)曲线分析各指标对RVE患儿发生脓毒血症的预测价值。结果脓毒血症发生组患儿的轻、中、重病情程度占比分别为3.03%、9.09%、87.88%,未发生组轻、中、重病情程度占比分别为28.15%、60.00%、11.85%,发生组病情严重程度较未发生组严重,差异有统计学意义(P<0.05);发生组患儿入院时CD11b平均荧光强度、血清D-LAC水平分别为(91.25±5.36)AU、(8.35±2.74)mg/L,明显高于未发生组的(84.30±7.28)AU、(5.80±0.67)mg/L,血清锌水平为(51.95±6.77)μmol/L,明显低于未发生组的(70.59±8.34)μmol/L,差异均有统计学意义(P<0.05);Spearman相关性分析结果显示,入院时CD11b平均荧光强度、血清D-LAC水平与RVE患儿严重程度呈正相关(r=0.685、0.709,P<0.05),血清锌水平与RVE患儿严重程度呈负相关(r=-0.664,P<0.05);ROC曲线分析结果显示,入院时CD11b平均荧光强度、血清锌、D-LAC水平联合预测RVE患儿发生脓毒血症的AUC为0.897,明显大于上述指标单独检测的0.758、0.712、0.742。结论入院时CD11b平均荧光强度、血清锌、D-LAC水平与RVE患儿病情严重程度具有一定相关性,联合检测对RVE患儿脓毒血症的发生具有较高的预测价值,可为RVE患儿病情评估及制定预防脓毒血症的方案提供参考依据。

血清D-乳酸、二胺氧化酶和细菌内毒素对原发性肝癌放疗患者的意义

目的探讨血清中D-乳酸、二胺氧化酶和细菌内毒素水平在原发性肝癌放疗患者中的变化及其在肠道屏障功能评估中的临床意义。方法序贯纳入2020年1月至2021年12月150例原发性肝癌且均需行局部放射治疗的患者。住院24 h内进行患者主观整体营养评估(PG-SGA)、mGPS评分,并根据是否合并胃肠功能障碍分为胃肠功能障碍组和非胃肠功能障碍组,分别取患者放疗开始前、放疗完成时以及放疗完成后1个月3个时间段的外周血,以检测血清中D-乳酸、DAO和细菌内毒素的水平。比较3组血清中D-乳酸、DAO和细菌内毒素水平变化,进一步判断肝癌患者放疗前血清中D-乳酸、DAO和内毒素与PG-SGA、mGPS、胃肠功能障碍之间的关系。结果放疗开始前、放疗完成时及放疗完成1个月3组患者的血清中D-乳酸分别为[5.30(0.34~10.52)]mg/L、[16.25(14.73~20.01)]mg/L、[16.85(3.23~34.20)]mg/L,二胺氧化酶分别为[5.92(0.12~9.06)]U/L、[12.89(7.43~22.05)]U/L、[14.47(13.30~19.41)]U/L,细菌内毒素分别为[5.68(1.78~9.83)]U/L、[9.72(6.36~15.71)]U/L、18.45[(15.99~23.25)]U/L,3组间D-乳酸、DAO和细菌内毒素水平明显呈上升趋势,差异有统计学意义,且两两比较发现D-乳酸及DAO水平在放疗开始前与放疗完成时、放疗完成1个月后之间均有统计学差异(P<0.05),而放疗完成时与放疗完成1个月后无统计学差异(P>0.05);放疗前胃肠功能障碍组的患者血清D-乳酸、二胺氧化酶及细菌内毒素水平分为(22.92±16.62)mg/L、(13.95±9.18)U/L、(32.08±21.85)U/L,均高于非胃肠功能障碍组即分别为(17.63±13.75)mg/L、(9.43±8.05)U/L、(10.95±10.14)U/L,且放疗前D-乳酸、二胺氧化酶、细菌内毒素水平与PG-SGA、mGPS评分均呈显著正相关,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论监测原发性肝癌放疗患者血清中D-乳酸、DAO及细菌内毒素水平可作为评估患者胃肠功能障碍、营养状况及炎症状况的指标。

脓毒症患者肠道菌群生态特征与血清D-乳酸、sTREM1和MCP-1表达水平的相关性研究

目的研究脓毒症(sepsis)患者肠道菌群生态特征与血清D-乳酸(D-lactate)、可溶性髓样细胞触发性受体-1(soluble triggering receptor expressed on myeloid cells-1,sTREM1)和单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)表达水平的相关性。方法将遂宁市中心医院2019.06~2022.06期间接收的46例脓毒症患者纳为脓毒症组,患者符合Sepsis3.0中相关诊断标准;同期45例入住ICU但无脓毒症者纳为非脓毒症组,50例健康志愿者纳为对照组。收集其粪便标本,采用16S rRNA基因测序技术对三组粪便标本进行菌群检测分析,采集三组外周静脉血,检测血清D-乳酸、sTREM1及MCP-1水平,分析脓毒症患者肠道菌群与血清D-乳酸、sTREM1及MCP-1水平之间的关系。结果脓毒症组、非脓毒症组和对照组肠道菌群ACE指数(476.59±46.69,483.69±53.69,490.15±55.48)比较,差异无统计学意义(F=0.797,P>0.05),三组Chaol(365.45±43.58,465.69±50.37;473.58±52.15),Shannon(5.06±1.06,5.56±1.17,5.74±1.26)及Simpaon(0.83±0.17,0.94±0.21,0.96±0.22)指数比较,差异均有统计学意义(F=4.292~71.632,均P<0.05),其中脓毒症组患者Chaol,Shannon及Simpaon指数均低于非脓毒症组与对照组,差异具有统计学意义(t=8.773,2.234,2.811;12.360,2.911,3.311,均P<0.05)。对样本OTU聚类分析后发现,非脓毒症组与对照组患者肠道微生态中拟杆菌门+厚壁菌门占比均超过90%,脓毒症组拟杆菌门+厚壁菌门占比低于其余两组(69.24%vs 92.39%,91.67%),变形菌门占比高于其余两组(18.66%vs 5.46%,5.06%),差异具有统计学意义(F=16.584,6.741,均P<0.05),其中脓毒症组与非脓毒症组、对照组对比,差异均有统计学意义(χ^(2)=4.558,3.984;4.623,4.058,均P<0.05)。脓毒症组、非脓毒症组及对照组间血清D-乳酸(4.26±0.85,0.69±0.16,0.53±0.12),sTREM1(183.16±23.26,60.15±19.48,42.48±10.34)及MCP-1(563.15±63.69,365.73±55.78,311.42±51.74)水平呈依次下降趋势,差异均有统计学意义(F=822.762,806.300,311.42,均P<0.001);其中脓毒症组和非脓毒症组相比(t=28.557,27.435,15.716,均P<0.05),脓毒症组和对照组相比(t=21.417,38.888,22.411,均P<0.05),非脓毒症组和对照组相比(t=5.576,5.662,4.987,均P<0.05),差异均有统计学意义。相关性分析提示,脓毒症组患者肠道内拟杆菌门及厚壁菌门与其血清D-乳酸、sTREM1,MCP-1水平均呈负相关(r=-0.364,-0.377;-0.417,-0.302;-0.384,-0.312,均P<0.05),变形菌门与其血清D-乳酸、sTREM1和MCP-1水平均呈正相关(r=0.411,0.343,0.395,均P<0.001)。结论脓毒症患者肠道菌群多样性下降,肠道内拟杆菌门与厚壁菌门占比下降,变形菌门占比上升,肠道菌群失衡可能联合肠道屏障障碍与炎症反应共同参与脓毒症的发生。

血二胺氧化酶和D-乳酸水平预测脑外伤病人发生急性胃肠损伤的临床价值

目的探讨二胺氧化酶(DAO)和D-乳酸预测脑外伤病人发生急性胃肠损伤(AGI)的临床应用价值。方法选取2019年5月至2021年5月河北省人民医院收治的129例脑外伤合并AGI病人为研究对象,按照改良格拉斯哥昏迷量表(GCS)评分结合创伤性脑损伤临床分型标准,将病人分为轻度组(n=62)、中度组(n=32)和重度组(n=35);按照AGI分级标准,分为Ⅰ级66例、Ⅱ级35例、Ⅲ级16例和Ⅳ级12例。采用酶联免疫吸附测定检测DAO和D-乳酸在病人血清中的表达水平;Pearson相关性分析探索DAO与D-乳酸表达水平的相关性;受试者操作特征曲线(ROC曲线)分析血清DAO和D-乳酸水平预测重度脑外伤合并AGI病人的价值。结果轻、中、重度组脑外伤合并AGI病人血清中DAO(10.63±1.57,13.89±1.96,19.25±2.71)mg/L和D-乳酸(22.53±1.71,24.38±1.82,26.75±2.31)µg/L表达水平依次升高(P<0.05);Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级脑外伤合并AGI病人血清中DAO(10.59±0.82,14.45±1.07,18.75±1.55,22.63±2.05)mg/L和D-乳酸(22.33±1.08,24.31±1.22,26.85±1.33,28.09±1.48)µg/L表达水平依次升高(P<0.05)。脑外伤合并AGI病人血清中DAO和D-乳酸表达呈明显正相关(r=0.29,P<0.05);DAO和D-乳酸与急性生理学和慢性健康状况评价Ⅱ(APACHEⅡ)呈正相关,与GCS评分呈负相关(P<0.05)。血清DAO和D-乳酸水平重度脑外伤合并AGI的曲线下面积(AUC)分别为0.98、0.90,二者联合预测的AUC为0.99高于单一指标检测。结论DAO和D-乳酸在脑外伤合并AGI病人血清中表达水平与病情严重程度密切相关,二者联合检测对预测重度脑外伤合并AGI具有较好的临床应用价值。

血清D-乳酸、组氨酸脱羧酶和降钙素原水平预测内镜下逆行胰胆管造影取石术后胆道感染的临床价值

目的探究血清D-乳酸、组氨酸脱羧酶(histidine decarboxylase,HDC)和降钙素原(procalcitonin,PCT)水平预测内镜下逆行胰胆管造影(endoscopic retrograde cholangiography and pancreatography,ERCP)取石术后胆道感染的临床价值。方法选取2020年1月至2022年3月海南医学院附属儋州市人民医院收治的108例择期行ERCP取石术的胆总管结石患者作为研究对象,根据术后是否发生胆道感染将患者分为感染组27例(发生胆道感染者)与未感染组81例(未发生胆道感染者),比较两组患者一般资料、术前及术后1d血清D-乳酸、HDC及PCT水平,分析血清D-乳酸、HDC及PCT水平对胆总管结石患者ERCP取石术后发生胆道感染的预测价值。结果108例胆总管结石患者ERCP取石术后发生胆道感染者27例,胆道引流液样本共检出36株病原菌,其中革兰氏阴性菌占比66.67%(24/36),大肠埃希菌17株、铜绿假单胞菌6株、阴沟肠杆菌1株;革兰氏阳性菌占比33.33%(12/36),屎肠球菌7株、粪肠球菌5株。大肠埃希菌检出率最高,为36.11%。感染组患者年龄>65岁、多次插管、胆道手术治疗史及引流时长>3d占比高于未感染组,差异有显著性(P<0.05)。经logistic回归分析显示:年龄>65岁、多次插管、胆道手术治疗史均是造成患者术后胆道感染的危险因素(P<0.05)。两组术前血清D-乳酸、HDC及PCT水平比较差异无显著性(P>0.05),感染组患者术后血清D-乳酸、HDC及PCT水平均高于未感染组,差异有显著性(P<0.05)。患者血清D-乳酸、HDC均与PCT水平呈正相关(r=0.409、0.661,P<0.05)。三者联合预测术后胆道感染的价值最高,ROC曲线下面积为0.881,敏感度为81.48%、特异性为75.31%。结论ERCP取石术后患者血清D-乳酸、HDC及PCT水平对胆道感染手术并发症有较高预测价值,针对具备胆道感染高危因素患者,临床可通过联合检测术后血清D-乳酸、HDC及PCT水平预估患者胆道感染发生可能性,尽早采取防治措施。

高龄消化道穿孔治疗中应用腹腔镜修补术效果及 FABP2、DAO、D-乳酸水平的影响

目的:探究高龄消化道穿孔治疗中应用腹腔镜修补术效果及对脂肪酸结合蛋白-2(FABP2)、二胶氧化酶(DAO)、D-乳酸水平的影响。方法:选取本院普外科2020年1月—2021年12月收治的高龄消化道穿孔患者89例,随机数字表法分为开腹组和腹腔镜组,相应接受开腹修补术、腹腔镜修补术治疗,比较两组疗效及FABP2、DAO、D-乳酸水平变化。结果:两组手术时间比较差异无统计学意义(P>0.05),腹腔镜组术中出血量较开腹组更少,术后下床、住院时间及肠鸣音恢复、肛门排气及排便时间较开腹组更短(P<0.05)。腹腔镜组术后并发症总发生率低于开腹组(P<0.05)。术后7d两组FABP2、DAO、D-乳酸水平均低于手术当天,且腹腔镜组均低于开腹组(P<0.05)。结论:腹腔镜修补术治疗高龄消化道穿孔可获得较开腹修补术更满意的疗效,可更明显控制FABP2、DAO及D-乳酸水平,值得广泛推广。

高效液相色谱法同时测定乳酸菌发酵液中L/D-乳酸方法的建立与验证

该研究采用高效液相色谱结合手性色谱柱的方法,建立了一种对乳酸菌发酵液中L/D-乳酸定性定量检测的分析方法。该方法中在1.0~400.0μg/mL范围中,L/D-乳酸质量浓度与检测结果均呈良好线性关系,L/D-乳酸检出限为0.25μg/mL,定量限为0.80μg/mL。基于2株乳酸菌的发酵液对该方法进行验证,结果表明发酵液中L/D-乳酸得到良好分离,该方法精密度、重复性良好,回收率为90.0%~103.7%;在不同稀释度的发酵液中线性相关系数R 2均在0.999以上;稳定性的相对标准偏差5%以下;对涵盖4属8种的18株可用于食品的乳酸菌菌株产生L/D-乳酸的情况进行分析,结果表明乳酸菌产L/D-乳酸含量具有菌株差异性,同种乳酸菌产D-乳酸比例具有相同趋势。利用该方法对乳酸菌发酵液中L/D-乳酸的定性定量检测,结果准确稳定。该研究为食品用菌种的安全性评价中菌株代谢产物D-乳酸的检测提供了有效数据支撑和实践参考。

保加利亚乳杆菌D-乳酸脱氢酶同工酶基因在大肠杆菌中的表达

通过对保加利亚乳杆菌ATCC11842的D-乳酸脱氢酶基因的克隆,分离获得了ldb0101、ldb0813、ldb1010、ldb1147和ldb2021五种同工酶基因,并分别构建重组质粒转化大肠杆菌JM109,实现D-LDH同工酶基因的表达。结合重组大肠杆菌的摇瓶发酵实验和D-乳酸的合成,初步确定D-乳酸脱氢酶Ldb0101和Ldb1010在保加利亚乳杆菌中对D-乳酸的合成起着重要的作用。

酿酒酵母产D-乳酸重组菌的构建与发酵

采用基因工程方法对酿酒酵母进行代谢改造,使酵母产生乳酸代谢途径。将来源于L.mesenteroides和E.coli的D-乳酸脱氢酶基因,分别插入带有G418抗性的酵母穿梭质粒p YX212-kan MX上,电转化酵母,得到2株生产D-乳酸的酿酒酵母重组菌S.cerevisiae WE1510和S.cerevisiae WB1186。进一步摇瓶发酵试验表明:重组菌S.cerevisiae WB1186在YEPD培养基、20 g/L糖、p H 5的条件下生长条件最好,并具有更好的产乳酸能力。经3 L发酵罐条件下验证,S.cerevisiae WB1186分批发酵96 h,最终乳酸积累量达到18.0 g/L;发酵条件为培养基YEPD,接种量10%,溶解氧(DO)30%,转速150 r/min,初始葡萄糖质量浓度10 g/L,控制pH 5.0,通气量3 L/min,OD600最大值转为厌氧发酵。

创伤后肠道通透性改变血浆标志物D-乳酸的实验研究

目的 :观察创伤时循环 D 乳酸与内毒素的变化及其意义。方法 :采用 3种大鼠模型 :(1)肠系膜上动脉夹闭 1小时肠缺血再灌注损伤模型 ;(2 ) 30 %总体表面积深 ～ 度烫伤模型 ;(3)总胰胆管人工胆汁逆行灌注的急性坏死性胰腺炎 (ANP)模型。于各时间点采集颈动脉及门静脉血 ,分别检测 D乳酸及内毒素含量。结果 :(1)肠缺血 1～ 1.5小时血浆 D乳酸和内毒素均升高 ,再灌注后显著升高 ,二者存在明显正相关(r=0 .7198,P <0 .0 5 ) ;(2 )烫伤后 6小时血浆 D乳酸和内毒素显著升高 ,两者存在明显相关 (r=0 .8771,P<0 .0 1) ;(3) ANP大鼠血浆 D 乳酸和内毒素水平在伤后 2小时开始升高 ,2 4小时达峰值 ,两者存在明显相关性 (r=0 .7985 ,P<0 .0 1)。组织病理学检查发现 3组动物均有小肠绒毛脱落 ,粘膜下炎细胞浸润等改变 ,其严重程度与血浆 D 乳酸水平一致。结论 :血浆 D 乳酸可作为创伤所致肠粘膜损伤、肠通透性改变及肠源性内毒素血症形成的预警指标。

肺炎克雷伯氏菌D-乳酸脱氢酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

以肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增并克隆出D-乳酸脱氢酶的基因(ldhD),将其连接到表达载体pET-22b(+)质粒上,构建pET-22b(+)-ldhD重组质粒,测序结果 100%正确。将重组质粒pET-22b(+)-ldhD转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中,通过氨苄霉素抗性平板筛选,构建大肠杆菌BL21(DE3)-pET-22b(+)-ldhD基因工程菌。重组菌株经IPTG诱导表达,SDS-PAGE蛋白电泳分析,目标条带出现在分子量约37000处,表明D-乳酸脱氢酶基因ldhD在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达。采用紫外分光光度法测定其酶活,底物丙酮酸终浓度为10 mmol/L时,在丙酮酸还原为D-乳酸反应方向D-乳酸脱氢酶表现出119.04 U/mL的酶活力;底物D-乳酸终浓度为50 mmol/L时,在D-乳酸转化为丙酮酸的逆反应方向中表现出0.89U/mL的酶活力。比酶活则分别为9.16 U/mg和0.07 U/mg。通过Lineweaver-Burk双倒数作图法,计算出酶反应的米氏常数KM为10.54 mmol/L。经摇瓶发酵后,通过高效液相色谱测定产物,D-乳酸的产量达到3.09 g/L。

高效液相色谱法对泡菜中L-乳酸和D-乳酸的手性分离和测定

采用高效液相法和手性分离柱对泡菜发酵上清液中的L-乳酸和D-乳酸进行分离和测定。泡菜的培养上清液用8000r/min离心20min,再用0.45μm滤膜过滤。滤液用配备二极管阵列检测器的高效液相系统检测,检测波长为254nm。检测色谱柱为手性柱Chirex3126(D)-penicillami(4.6mmi.d×250mmL,5μm),流动相为2mmol/LCuSO4溶液(溶剂为5%的异丙醇溶液)。L-乳酸和D-乳酸的标准曲线在2.5-20.0g/L范围线性良好,两者的线性相关系数都为0.999。泡菜滤液的L-乳酸和D-乳酸的回收率分别是99.82%和100.02%。该方法操作简便,精密度和准确度高,适用于泡菜中L-乳酸和D-乳酸的测定。

D-乳酸脱氢酶基因克隆及其表达

构建了一株产D ,L 乳酸的乳杆菌 (Lactobacillussp .)MD 1的基因文库。利用乳酸脱氢酶和丙酮酸裂解酶缺陷的EscherichiacoliFMJ1 4 4作为宿主 ,在厌氧条件下通过互补筛选获得乳酸脱氢酶基因 (ldh) ,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Native PAGE)检测证明其阳性克隆表现出D 乳酸脱氢酶 (D LDH)活性。核酸序列分析表明 ,ldhD的ORF编码 331个氨基酸残基组成的蛋白质有两个保守区域 ,其中V1 47～D1 76 区是NADH的结合位点 ,R77～E1 0 7区据报道是酶的活性部位。该菌株D LDH和D羟基异己酸脱氢酶 (D HicDH)属于NADH依赖性脱氢酶家族 ,ldhD和其他乳杆菌属的ldhD及D HicDH基因和编码的氨基酸序列相似性较低 ,核酸序列相似性最高达 4 9 33% ,氨基酸序列相同性最高为 4 2 % ,是一个新的D