DDX46调控食管鳞癌TE-11细胞恶性生物学行为的机制探讨

背景与目的:DDX46是一种三磷酸腺苷依赖的RNA解旋酶,在mRNA前体剪接和核糖体组装中发挥核心作用,其在人类肿瘤中的表达及与肿瘤的相关性少见报道。该研究旨在探讨DDX46与食管鳞癌细胞恶性生物学行为之间的关系及可能的调控机制。方法:构建慢病毒载体和shDDX46质粒,转染食管鳞癌TE-11细胞,建立沉默DDX46表达的稳转细胞株,采用反转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)鉴定转染效果;采用细胞计数和克隆形成实验检测细胞增殖能力;采用Annexin V-APC单染法流式细胞术检测细胞凋亡情况;采用Western blot检测PI3K-Akt-mTOR信号通路相关分子及自噬相关蛋白的表达水平。结果:慢病毒介导的RNAi有效抑制DDX46在TE-11细胞中的表达(P<0.001)。与对照组相比,靶向沉默DDX46基因后细胞计数显示,TE-11细胞生长被显著抑制(P<0.01);克隆形成实验显示,细胞克隆形成能力被显著抑制(P<0.01);流式细胞术凋亡检测显示,细胞凋亡率显著增加(P<0.01);Western blot检测发现,PIK3CG、Akt、P-Akt和mTOR表达水平显著下降(P<0.01),PTEN表达水平无显著变化(P>0.05),而Beclin 1和LC3表达显著上调(P<0.01)。结论:DDX46与食管鳞癌细胞增殖和凋亡相关;沉默DDX46可能通过PI3K-Akt-mTOR信号转导通路,同时激活了细胞凋亡和自噬,进而影响食管鳞癌细胞生长增殖。

解旋酶DDX46基因对食管鳞癌Eca-109细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨RNA解旋酶DDX46基因对食管鳞癌细胞株Eca-109增殖和凋亡的影响及可能的作用机制。方法:以人永生化食管鳞状上皮细胞Het-1A为对照,实时荧光定量PCR(qPCR)检测DDX46 mRNA在Eca-109细胞中的相对表达水平。应用sh RNA干扰技术沉默Eca-109细胞DDX46基因后,分别采用MTT实验、克隆形成实验及流式细胞术检测细胞增殖情况、克隆形成能力以及细胞周期和细胞凋亡情况。并用Western blot检测DDX46基因沉默后Eca-109细胞DDX46蛋白和凋亡信号转导通路关键分子Caspase-3和PARP-1蛋白表达的变化。结果:与Het-1A细胞相比,Eca-109细胞DDX46 mRNA的表达水平显著升高(P<0.01)。与对照组相比,靶向沉默DDX46基因后MTT实验显示Eca-109细胞活力明显减弱,增殖能力被显著抑制(P<0.01);克隆形成实验显示Eca-109细胞克隆形成能力被显著抑制(P<0.01);流式细胞术检测显示处于G1期的细胞增加,而处于S期的细胞减少(P<0.05),细胞周期停滞于G0/G1期;凋亡实验显示细胞凋亡率显著增加(P<0.01)。Western blot检测显示,与对照组比较,DDX46-sh RNA干扰使Eca-109细胞DDX46蛋白表达水平显著下降(P<0.01),而cleaved Caspase-3和cleaved PARP-1蛋白表达水平显著上升(P<0.01)。结论:DDX46mRNA在食管鳞癌Eca-109细胞中高表达,DDX46基因沉默可能通过激活细胞凋亡信号转导通路而发挥抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡的作用。

DDX46基因慢病毒载体的构建及其在人膀胱癌细胞中的表达

目的构建DDX46基因低表达慢病毒载体,并检测其在人膀胱癌细胞中的表达效果,为DDX46基因在人膀胱癌细胞中的研究奠定基础。方法应用实时荧光定量检测5637细胞和T24细胞中DDX46 m RNA表达水平,以寻找合适的细胞系进行实验。分别以DDX46基因序列和普适型阴性序列为模板,设计合成靶点序列,并合成寡核苷酸双链,定向克隆到慢病毒质粒GV115,合成重组质粒sh DDX46和sh RNA,分别称之为实验组和对照组。将不同重组质粒与pHelper 1.0和pHelper 2.0分别转染293T细胞以包装成慢病毒颗粒后感染5637细胞和T24细胞。应用实时荧光PCR定量检测重组慢病毒感染5637细胞和T24细胞后DDX46 m RNA表达水平,判断其干扰效率。结果 5637细胞和T24细胞均高丰度表达DDX46m RNA,其结果(用ΔCt值表示)分别为(6.53±0.08)和(8.48±0.11);重组慢病毒感染膀胱癌细胞后,在5637细胞中,实验组DDX46 m RNA的表达水平(用ΔCt值表示)为(0.32±0.01),低于对照组(1.00±0.10),差异有统计学意义(P<0.05),其敲减效率为67.70%;在T24细胞中,实验组DDX46 m RNA的表达水平(用ΔCt值表示)为(0.11±0.01),低于对照组(1.00±0.03),差异有统计学意义(P<0.05),其敲减效率为89.00%。结论成功构建DDX46基因低表达慢病毒载体,为研究DDX46基因在膀胱癌细胞中的作用奠定了基础。

DDX46在恶性肿瘤发生发展中的作用

随着分子生物学的深入发展,人们对癌症发生机制的理解愈发深刻。近年来,大量研究发现DDX46在结直肠癌、食管鳞状细胞癌、胃癌等多种恶性肿瘤中过表达能促进多种恶性肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移,抵抗细胞凋亡,并参与细胞周期,因此可能成为潜在的抗肿瘤药物靶点和标志物。为了更直观地了解DDX46在癌症中的作用,系统地阐述其在肿瘤发生和发展的各个方面的功能及相关机制,为DDX46靶向药物的研发提供新思路。

DDX46基因调控TE-1食管鳞状细胞癌细胞侵袭转移行为的相关性研究

目的 探索DDX46基因与TE-1食管鳞状细胞癌(鳞癌)细胞侵袭和转移行为的相关性及可能的分子机制。方法 荧光标记shRNA慢病毒转染TE-1食管鳞癌细胞敲减DDX46基因为实验组(shDDX46组),空载体转染为对照组(shCtrl组)。镜下绿色荧光蛋白表达率评价细胞转染效率,实时荧光定量聚合酶链式反应和蛋白质印迹法(Western blotting,WB)分别检测DDX46基因在mRNA和蛋白表达水平的敲减效率。采用划痕实验、侵袭实验、Transwell小室实验检测DDX46基因敲减前后TE-1食管鳞癌细胞侵袭和转移能力的变化。采用生物信息学方法进行经典通路分析探讨信号通路的变化,进一步通过WB检测纤连蛋白表达,探讨DDX46在食管鳞癌细胞侵袭和转移过程中可能存在的作用机制。结果 shRNA慢病毒转染TE-1食管鳞癌细胞后DDX46基因在mRNA和蛋白水平上的表达受到显著抑制。划痕实验提示shDDX46组TE-1食管鳞癌细胞在划痕后8 h细胞迁移率相比shCtrl组明显降低(P=0.001)。侵袭实验表明shDDX46组TE-1食管鳞癌细胞在培养24 h后侵袭细胞数量低于shCtrl组(P<0.001)。Transwell实验结果显示shDDX46组在24 h观察点的转移细胞数少于shCtrl组(P<0.001)。经典通路分析结果表明整合素信号通路活性被抑制,进一步探究其作用机制发现,敲减DDX46基因后与细胞黏附相关的纤连蛋白表达下降11%。结论 DDX46基因与TE-1食管鳞癌细胞的侵袭和转移行为相关,敲减DDX46基因可能是通过下调整合素通路信号,降低细胞黏附性及细胞骨架重构,从而抑制食管鳞癌细胞侵袭和转移过程。

靶向沉默DDX46基因对食管鳞癌TE-1细胞增殖及凋亡的影响

目的通过sh RNA干扰技术,探讨靶向沉默RNA解旋酶DDX46基因对食管鳞癌TE-1细胞增殖及凋亡的影响。方法以人永生化食管鳞状上皮细胞Het-1A为对照,实时定量聚合酶链反应(q RT-PCR)检测DDX46基因m RNA在TE-1细胞中的相对表达;DDX46基因RNAi靶点序列慢病毒感染的TE-1细胞为实验组,阴性对照序列慢病毒感染的TE-1细胞为对照组,进行细胞计数、克隆形成和细胞凋亡实验;Stress and Apoptosis Signaling Antibody Array Kit检测DDX46基因靶向沉默前后信号通路关键分子的变化。结果与对照组相比,靶向沉默DDX46基因后细胞计数显示TE-1细胞生长被显著抑制(P<0.01),克隆形成实验显示细胞克隆形成能力被显著抑制(P<0.001),Annexin V-APC单染法流式细胞仪凋亡检测显示细胞凋亡显著增加(P<0.001)。Path Scan?Antibody Array检测发现Akt(Ser473,phosphorylation)和IκBα(total,N/A)表达水平显著下降(P<0.01),Caspase-3(Asp175,cleaved)表达水平升高(P<0.05)。结论 DDX46基因在食管鳞癌TE-1细胞中高表达;RNAi靶向沉默DDX46基因可抑制TE-1细胞增殖、诱导细胞凋亡;DDX46基因沉默可能是通过下调Akt/NF-κB信号转导通路,进而发挥抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用。

敲减DDX46后食管鳞癌细胞差异表达基因筛选及相互作用的生物信息学分析

目的探讨DDX46基因对食管鳞癌发生发展的作用机制。方法应用基因芯片技术检测DDX46基因敲减前后食管鳞癌TE-1细胞中全基因mRNA表达丰度,筛选差异表达的基因,并对其进行生物信息学分析。对表达谱筛选的其中6个差异基因进行实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)定量分析以验证结果的可靠性。结果按照表达差异倍数之绝对值≥2,且P<0.05的筛选条件,筛选出差异基因1006个,其中表达下调基因644个,表达上调基因362个。生物信息分析显示,差异基因主要涉及细胞周期、增殖、凋亡、黏附、能量代谢及免疫应答等生物学过程,磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)为重要节点分子。qRT-PCR检测结果与基因芯片结果的验证符合率为100%。结论利用生物信息学方法能有效挖掘DDX46敲减后食管鳞癌基因芯片数据,为进一步研究DDX46与食管鳞癌发生发展的关系,以及寻找潜在的治疗靶点提供有价值的线索。

DDX46基因对裸鼠食管鳞癌移植瘤生长的影响

目的观察DDX46基因沉默后食管鳞癌Eca-109细胞裸鼠皮下移植瘤的生长变化,在活体动物模型中进一步研究DDX46在食管鳞癌发生发展中的作用。方法 4周龄健康雌性BALB/c裸鼠25只随机分为3组。应用RNA干扰技术通过慢病毒载体构建获得DDX46基因沉默的慢病毒颗粒(实验组:DDX46-shRNA-LV,n=10)及空载体慢病毒颗粒(对照组:Control-LV,n=10),分别感染食管鳞癌Eca-109细胞株,每只4×10~6个细胞量注射至BALB/c裸鼠右腋皮下;以人永生化食管鳞状上皮细胞Het-1A为空白对照组(n=5),每侧4×10~6个细胞量分别注射至BALB/c裸鼠双侧腋皮下。检测各组移植瘤生长情况,活体成像仪观察各组荧光表达量。Western blotting检测DDX46基因沉默后移植瘤组织凋亡信号通路关键分子表达的变化。结果与对照组相比,沉默DDX46基因使裸鼠移植瘤体积减小、重量减轻,生长减缓(P<0.001);小动物活体成像显示DDX46-shRNA-LV组荧光区总荧光表达量和平均荧光表达量均明显低于Control-LV组(P<0.001);Het-1A细胞接种裸鼠不成瘤。Western blotting检测显示,与对照组比较,沉默DDX46基因使移植瘤DDX46蛋白表达水平显著下降(P<0.01),而cleaved Caspase-3和cleaved PARP-1蛋白表达水平显著上升(P<0.01)。结论沉默DDX46基因可显著抑制裸鼠移植瘤的生长,其机制可能是通过激活细胞凋亡信号通路而发挥抑瘤作用。

结直肠癌DDX46蛋白表达及其与C-erbB-2、Ki-67、p53和nm23蛋白表达的相关性

目的研究结直肠癌中DDX46蛋白的表达及其与C-erbB-2、Ki-67、p53和nm23蛋白表达的相关性:方法收集2010年1月至2012年12月南京医科大学附属无锡第二医院149例结直肠癌手术后肿瘤组织及45例癌旁组织,应用免疫组织化学法检测DDX46蛋白表达水平及肿瘤组织中C-erbB-2、Ki-67、p53和nm23蛋白表达水平,分析DDX46蛋白表达水平与结直肠癌患者临床病理特征的相关性及结直肠癌组织样本中C-erbB-2、Ki-67、p53和nm23蛋白与DDX46蛋白表达的相关性:结果149例结直肠癌组织中.DDX46蛋白低表达50例(33.6%),高表达99例(66.4%);45例癌旁组织中,DDX46蛋白低表达37例(82.2%),高表达8例(17.8%),癌组织与癌旁组织DDX46蛋白高表达率差异有统计学意义(χ^2=33.09,P<0.01 )。DDX46蛋白表达水平与肿瘤分化程度、浸润程度、淋巴结转移、TNM分期有关(均P<0.05 ),分化程度越低、浸润程度越高、有淋巴结转移、TNM分期越晚的患者中.DDX46高表达者所占比例越高。DDX46蛋白表达水平与p53、Ki-67、nm23蛋白表达有关(均P<0.05 ),其中与p53 ,Ki-67蛋白表达呈正相关(r值分别为0.161 ,0.347 ),与nm23蛋白表达呈负相关(r=-0.561 )结论DDX46蛋白在结直肠癌组织中的高表达与肿瘤的恶性生物学行为和重要的癌基因相关。DDX46蛋白可作为结直肠癌患者潜在的诊断、靶向治疗的标志物。

The RNA helicase DDX46 inhibits innate immunity by entrapping m^6 A-demethylated antiviral transcripts in the nucleus

With the support by the National Natural Science Foundation of China,the research team directed by Prof.Cao Xuetao(曹雪涛)at the National Key Laboratory of Medical Molecular Biology&Department of Immunology,Chinese Academy of Medical Sciences,and the National Key Laboratory of Medical Immunology,Second Military Medical University,recently reported that RNA helicase DDX46is

DDX46基因对结肠癌细胞电离辐射敏感性的影响及机制研究

目的 探讨DDX46基因对结肠癌细胞的电离辐射敏感性的影响及其作用机制。方法 DDX46基因RNA干扰慢病毒转染的SW480细胞为实验组，空载质粒慢病毒转染的SW480细胞为对照组。两组细胞转染72 h后，分别进行0和4 Gy X射线照射，采用CCK-8方法检测两组的细胞活力；实验组联合4 Gy X射线照射24 h后，采用免疫荧光技术和Western blot法检测细胞γ-H2AX foci数量以及DNA损伤修复通路关键蛋白的表达水平，确定DDX46与辐射诱导的DNA损伤修复的关系。结果 4 Gy X射线照射24 h后，实验组的细胞活力比照射前降低（15.02±3.92）%（t=-4.696，P〈0.05），比对照组降低（17.43±1.83）%（t=4.844，P〈0.01）；而对照组照射前后比较差异无统计学意义（P〉0.05）。同时，实验组γ-H2AX foci数量相比于对照组增加了（43.03±17.6）%（t=-3.108，P〈0.05），ATM的蛋白水平显著升高（t=7.530，P〈0.01），而ATM的活性形式p-ATM以及ATM的下游靶蛋白Rad50的蛋白水平则明显降低（t=4.260、4.260、P〈0.05），同时γ-H2AX的蛋白表达水平也有一定程度的升高（t=-3.090，P〈0.05），DNA-PK在两组细胞内的蛋白水平变化不大。结论 沉默DDX46可以提高结肠癌细胞系SW480的辐射敏感性，其机制可能是DDX46表达沉默抑制结肠癌细胞系SW480中ATM的活化，从而抑制辐射诱导的DNA损伤的修复，提高SW480的辐射敏感性。

DEAD⁃box解螺旋酶46基因沉默对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的分析短发夹RNA(shRNA)介导DEAD⁃box解螺旋酶46(DDX46)基因沉默对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法采用实时荧光定量逆转录PCR(RT⁃qPCR)和蛋白质印迹法(Western Blot)测定人正常乳腺上皮细胞系和乳腺癌细胞系中DDX46表达差异。以慢病毒介导的shRNA敲低乳腺癌SK⁃BR⁃3细胞中DDX46的表达,实验分为空白对照组、阴性对照组和sh⁃DDX46组。RT⁃qPCR检测各组细胞DDX46 mRNA的表达水平,蛋白质印迹法检测DDX46蛋白和凋亡相关蛋白的表达水平,克隆形成和四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)检测细胞生长增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果DDX46 mRNA在各乳腺癌细胞系中的表达量均高于正常乳腺上皮细胞(P<0.05)。sh⁃DDX46组细胞DDX46 mRAN和蛋白表达水平均明显低于空白对照组和阴性对照组(P<0.05)。sh⁃DDX46组的细胞生长增殖能力明显低于两对照组(P<0.05)。空白对照组、阴性对照组和sh⁃DDX46组SK⁃BR⁃3细胞凋亡率分别为(4.21±1.65)%、(5.36±1.23)%和(10.21±2.39)%,与空白对照组和阴性对照组相比,sh⁃DDX46组SK⁃BR⁃3细胞凋亡率明显增加(P=0.007;P=0.016)。沉默DDX46后凋亡通路蛋白B细胞淋巴瘤/白血病⁃2(Bcl⁃2)的表达量明显降低(P<0.05),Bcl⁃2相关X蛋白(Bax)和半胱氨酸蛋白酶⁃3剪切体(cleaved Caspase⁃3)表达明显增高(P<0.05)。结论DDX46在乳腺癌细胞中高表达,沉默DDX46基因能够抑制乳腺癌细胞增殖并促进凋亡,凋亡信号通路可能是其作用机制之一。