一例DMD基因Alu元件插入突变导致杜氏肌营养不良及其白发症状分析

杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy,DMD)是由DMD基因突变引起的抗肌萎缩蛋白缺乏的一种严重X连锁隐性遗传病,突变形式主要包括外显子缺失和重复、点突变、插入突变等,这些突变通过不同方式影响了抗肌萎缩蛋白的正常表达,最终导致疾病的发生。本研究报告了1例DMD基因第59号外显子(exon 59,E59)插入突变引起的DMD,该患儿相关生化指标明显异常,表现较为明显的DMD早期症状,并出现了多处白发。其母亲和姐姐为携带者,生化指标轻微异常,母亲有轻微临床症状,姐姐无临床症状。其他成员基因和身体状况正常。经测序和序列比对发现,该插入片段为AluYa5亚家族的Alu元件,该片段插入可产生两个终止密码子,末端含一段多聚腺苷酸尾(polyA)。为了解该插入突变对于DMD基因的影响以及与临床症状的关联,通过外显子剪接增强子(exonic splicing enhancer,ESE)预测发现,该插入并不影响E59的剪接,由此推测该插入序列会最终出现在DMD基因的mRNA序列中,插入序列中的2个终止子和polyA很可能会在翻译过程中发挥终止作用,不能产生有功能的抗肌萎缩蛋白,这可能是导致DMD发生的机制。另外该患儿除了典型的DMD症状外,还出现了过早白发症状。本研究首次报道了1例DMD基因编码区插入Alu元件导致的DMD,为研究Alu序列逆转座引发基因突变提供线索,同时扩展了对DMD基因突变的认识。

Dmd基因突变小鼠构建及在肌肉及免疫系统的表型验证

目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建抗肌萎缩蛋白(dystrophin,Dmd)基因第23号外显子点突变的Dmd基因突变小鼠,分析并验证该小鼠在肌肉及免疫系统中的表型变化,为杜氏肌营养不良症等疾病提供评价模型。方法针对Dmd基因23号外显子序列特征,设计合成小向导RNA(small guide RNA,sgRNA),将Cas9 mRNA、sgRNA片段和oligo donor DNA显微注射到C57BL/6J小鼠受精卵中,并将该受精卵移植至代孕鼠后出生获得F0代小鼠,F0代小鼠通过交配获得子代小鼠后,基因型鉴定筛选得到Dmd基因阳性突变小鼠(命名为Dmd^(Mu/+)小鼠)。选择3月龄和9月龄的雄性半合子Dmd^(Mu/+)小鼠(命名为Dmd^(Mu/Y)小鼠)和野生型C57BL/6J小鼠(作为对照)用于表型验证:称量记录活体小鼠体重,并通过悬挂实验检测小鼠肌张力,采集心脏和半腱肌,采用HE染色法观察组织病理学变化,进一步通过蛋白质印迹法检测9月龄小鼠肌肉组织内Dmd蛋白的表达情况。利用脂多糖诱导建立Dmd^(Mu/Y)小鼠急性炎症模型,采集小鼠颌下静脉血,采用流式细胞术检测外周血中性粒细胞和单核细胞比例变化。结果基因组测序和蛋白质印迹结果表明Dmd基因点突变小鼠(即Dmd^(Mu/+)小鼠)构建成功,Dmd^(Mu/+)小鼠骨骼肌和心肌中未见Dmd蛋白表达,与野生型C57BL/6J小鼠相比明显下降(P<0.05)。与背景相同的野生型小鼠相比较,3月龄和9月龄的雄性半合子突变小鼠(Dmd^(Mu/Y)小鼠)体重明显减轻(P<0.01),肌张力显著下降(P<0.05),9月龄Dmd^(Mu/Y)小鼠的骨骼肌和心肌发生肌间隙变宽等明显病变。未注射脂多糖时,与野生型小鼠相比,3月龄Dmd^(Mu/Y)小鼠的外周血中性粒细胞和单核细胞比例显著降低(P<0.01),经脂多糖诱导后,3月龄Dmd^(Mu/Y)小鼠的外周血中性粒细胞比例仍然较野生型小鼠显著降低(P<0.01),而9月龄Dmd^(Mu/Y)小鼠的外周血中性粒细胞比例在脂多糖诱导后显著升高(P<0.05),但较野生型小鼠仍显著降低(P<0.01),同月龄Dmd^(Mu/Y)小鼠经脂多糖诱导后外周血单核细胞比例与野生型小鼠相比仅有偏低趋势(P>0.05)。结论成功构建了Dmd基因突变小鼠模型,证实该基因具有维系肌肉组织正常形态和肌张力等重要功能,并初步发现该基因缺失会减少外周血液中性粒细胞比例,为后续研究杜氏肌营养不良症患者的免疫系统异变机制提供新的思路。

DMD基因突变的孤独症谱系障碍儿童1例报告并文献复习

目的对DMD基因突变的1例6岁孤独症谱系障碍(autism spectrum disorder,ASD)男性患儿进行报告,并通过文献回顾探讨DMD基因缺陷患者的ASD共患率,分析该类患者的遗传学特点,以提高对该亚型ASD的认识。方法利用染色体微阵列分析技术对ASD先证者进行检测,多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)对候选突变进行家系验证。对患儿临床表型与基因型进行分析,并系统复习DMD基因突变与ASD的相关文献。结果患儿存在DMD基因arr[hg19]Xp21.1(31,518,750-31,878,971)×0微缺失,涉及DMD基因48—55号外显子,MLPA验证提示该缺失遗传自无疾病表型的母亲。文献回顾表明:贝克尔肌营养不良症(Becker muscular dystrophy,BMD)患者ASD的共患率在0.00%(0/17)~11.43%(8/70),而杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD)在0.0%(0/50)~54.5%(30/55)。BMD与DMD相比,前者所有队列ASD共患率的中位数(3.6%)低于后者的中位数(6.4%),但差异无统计学意义。DMD基因突变的位置与ASD发病是否相关存在争议。结论DMD基因48—55号外显子缺失可能是患儿存在BMD和ASD的共同病因。DMD基因的基因型与ASD临床表型的关系需要进一步的研究。

多重连接依赖式探针扩增和变性高效液相色谱法检测Duchenne型肌营养不良症患者DMD基因的缺失/重复突变

目的比较多重连接依赖式探针扩增法（MLPA）和变性高效液相色谱法（DHPLC）检测Duchenne型肌营养不良症（DMD）患者DMD基因缺失／重复突变的效果。方法选择2004年10月-2005年10月在我院确诊的22位无关DMD男性患者，采用MLPA法对经DHPLC技术检测过的患者的DMD基因的缺失／重复突变进行突变筛查，同时对先证者的23位女性亲属进行基因的缺失／重复突变检测。结果DHPLC技术和MLPA法均检测出11位先证者具有DMD基因缺失突变，3位先证者具有DMD重复突变；MLPA法除能更精确地检测出上述突变外，还检测出DHPLC法未检测出的两位患者的DMD基因存在缺失突变。16个家系中18位可能的女性携带者中，12位经检测为缺失／重复突变携带者。两种方法均未检测到6位先证者及其女性亲属DMD基因具有缺失／重复突变。结论与DHPLC法和传统的多重PCR方法相比，MLPA法检测DMD基因的缺失／重复突变位置更为准确。MLPA法可用于检测先证者及家系中女性携带者DMD基因的缺失／重复突变。

MLPA技术在DMD基因外显子拷贝数变异家庭基因诊断及产前诊断中的应用

目的分析多重连接依赖探针扩增(MLPA)技术在DXD基因外显子拷贝数变异家庭基因诊断及产前诊断中的应用价值。方法选取2018年1月至2019年1月就诊于该院产前诊断门诊,基因检测结果明确为DMD基因缺失或重复突变的14例杜氏肌营养不良症患儿(先证者)作为研究对象,通过使用MLPA技术针对DMD基因全部79个外显子进行缺失和重复突变检测,对先证者、先证者母亲及其再次妊娠所怀胎儿进行基因诊断及产前诊断。结果DMD基因MLPA检测结果显示,先证者拷贝数缺失突变13例,重复突变1例;家系1~8先证者拷贝数缺失或重复片段遗传自其母亲;胎儿拷贝数杂合缺失突变3例,杂合重复突变1例,其余10例胎儿未检测到外显子缺失或重复。结论MLPA技术是一种灵敏、准确、高效的分子诊断方法,该方法能对DMD基因外显子拷贝数进行相对定量,从而明确致病因素,更好地为杜氏肌营养不良症家庭优生优育提供指导意义。

假肥大型肌营养不良一个核心家系DMD基因分析

目的对临床诊断的假肥大型肌营养不良1例患儿进行基因诊断,同时进行携带者筛查。方法采用目标区序列捕获及第2代高通量测序技术对假肥大型肌营养不良患儿进行检测,同时采用Sanger测序技术对患者及其父母的基因型进行验证。结果发现患儿DMD基因第45外显子存在1个纯合无义突变c.6589A>T(P.Lys2197X),患儿母亲为杂合突变携带者。结论本研究发现了一个尚未报道的致病性基因突变位点,同时发现第2代测序技术可以快速准确检测出DMD基因的点突变,具有一定的临床应用价值,为遗传咨询提供准确信息。

DMD基因及其产物检测的临床价值

目的针对ＤＭＤ基因的突变特点以及由此而产生的编码产物的异常，探讨ＤＭＤ基因及其编码产物──抗肌营养个良蛋白的检测对于诊断疾病的意义。方法用多重ＰＣＲ技术和免疫印迹技术对ＤＭＤ或ＢＭＤ患者的ＤＭＤ基因和抗肌营养不良蛋白进行了检测。结果３３．３％的ＤＭＤ患者虽然未被检测出基因的片段性缺失，但他们的抗肌营养不良蛋白却完全丧失。结论多重ＰＣＲ技术是检测ＤＭＤ基因片段性缺失的有效方法，但却无法检测出点突变等微小突变。兔疫印迹技术能反映由于各种类型的基因突变所造成的编码产物的缺陷，更有利于ＤＭＤ和ＢＭＤ的确实诊断，应将其作为主要的实验室检测指标之一。

定量PCR结合STR多态连锁分析诊断缺失型DMD基因携带者

目的 直接定量PCR结合STR单体型连锁分析 ,以便更准确检出缺失型家系中DMD基因携带者。方法 在内标引物参照下 ,PCR扩增 2 2个循环 ,产物在琼脂糖凝胶分离 ,EB显色 ,照相后 ,扫描定量 ,同时应用 5个STR多态位点的单体型连琐分析 ,检测缺失型的DMD基因女性携带者。结果 直接定量PCR分析了 6个家系中的 8个外显子 48缺失的DMD母亲或女性同胞 ,检出 7个DMD为携带者 ;STR多态单体型连锁同样分析这 6个家系中的 8个女性亲属 ,亦检出 7个DMD基因携带者 ,二种方法所得结果完全一致。结论 STR多态连锁分析与直接定量PCR法结合 ,可更准确 ,全面检出DMD基因携带者。

DMD基因转录与逆转录PCR研究的历史与现状

由79个外显子与78个内含子构成的DMD基因在基因组DNA上跨越2400kb,其中98％的内含子DNA序列大部分尚属未知,导致在基因组水平上全面系统地研究DMD基因的结构及其突变存在重重无法克服的困难。而79个外显子构成的mRNA只有14kb,对其加以详细的研究则成为可能。正是由于对DMD基因转录子及其逆转录子(mRNA与cDNA)的研究,我们才知:(1)正常DMD基因跨越2400kb,拥有3个启动子,转录子的拼剪类型存在组织特异性及发育阶段特异性以及大量的外显子与内含子界限的确定;(2)突变DMD基因编码大量异常的剪接子,这些剪接子往往涉及一个或邻近的几个外显子的缺失或重复。同时出现了单一碱基置换或缺失的转录子,导致同义突变、错义突变、终止密码突变及移码突变的发生。本文就DMD基因转录及逆转录PCR研究的历史与现状加以综述。

基于CRISPR/Cas9系统的HEK293T细胞DMD基因第51号外显子的靶向敲除

目的应用CRISPR/Cas9基因编辑技术,完成HEK293T细胞中DMD基因第51号外显子(exon51)高效的靶向敲除。方法设计靶向人DMD基因exon51 5'端及3'端的sgRNA并克隆至CRISPR/Cas9载体质粒PX459中,转染至HEK293T细胞后,提取基因组DNA并使用Surveyor法检测切割活性;使用目标外显子两端切割活性最高的sgRNA构建PX459-2sgRNA质粒,转染至HEK293T细胞后用PCR及T载体测序检测靶向外显子切除情况。结果50%的HEK293T细胞中DMD基因exon51被定向切除,编辑效率较高。结论建立使用CRISPR/Cas9单质粒敲除人DMD基因exon51的平台,为DMD及其他遗传病的基因治疗研究奠定实验基础。

人X染色体YAC图谱分析及DMD基因研究──在第二届联合国教科文组织南北人类基因组学术会议上的报告

人Ｘ染色体ＹＡＣ图谱分析及ＤＭＤ基因研究──在第二届联合国教科文组织南北人类基因组学术会议上的报告柴建华（复旦大学遗传学研究所人类基因组实验室上海２００４３３）我们实验室从１９８７年在国家高技术发展计划（８６３）的资助下开始人类基因组研究。现在还同时...

MLPA技术用于产前DMD基因诊断的应用探讨

假肥大性肌营养不良症是一种严重的神经肌肉疾病，分为杜氏肌营养不良症（DMD）和贝氏进行性肌营养不良症（BMD），均是由于DMD基因（Xp21．2）突变所致。由于本病目前无有效的治疗方法，产前诊断成为控制致病基因传递、防止患儿出生及降低发病率的主要措施。本研究对DMD产前诊断家系中具有高患病风险的2个胎儿，提取其羊水基因组DNA，采用多重连接探针扩增技术（MLPA）进行产前基因诊断的探索。

DMD基因内含子突变致Becker型肌营养不良1例报告并文献复习

目的:探讨DMD基因内含子突变所致Becker型肌营养不良(BMD)的临床表现及基因变异特征。方法:回顾分析1例确诊BMD患儿的临床资料、肌肉病理及基因检测结果并复习相关文献。结果:患儿,男,12岁,2年前活动后出现乏力伴双下肢不适感,小便如茶色,急性期肌酸激酶、肌红蛋白水平可升高至正常值100倍以上;尿液分析示隐血3+,红细胞计数正常;代谢缺陷筛查(血、尿有机酸分析)无异常。后患儿乏力及尿液异常反复发生,全外显子检测无DMD基因相关突变;肌肉病理示骨骼肌呈肌病样改变,Dystrophin表达下降;DMD基因mRNA测序示存在异常剪接。患儿最终确诊为BMD。结论:反复横纹肌溶解的患者亦应考虑BMD的可能;对DMD基因外显子检测无异常,但Dystrophin表达异常的患者,需警惕内含子突变所致基因异常剪接。

假肥大型进行性肌营养不良2个核心家系DMD基因分析

目的对临床疑诊Duchenne/Becker肌营养不良患儿进行基因诊断,同时进行携带者筛查。方法收集先证者及其家系成员的临床资料,采用多重连接依赖的探针扩增(MLPA)方法对患儿及其母亲的DMD基因进行突变检测。结果确诊2例患儿均为DMD基因的缺失突变,母亲为携带者。先证者1为DMD基因45-47号外显子缺失,其母亲为45-47号外显子的杂合缺失突变;先证者2为DMD基因20-34号外显子缺失,其母亲为20-34号外显子的杂合缺失突变。结论MLPA进行DMD基因检测是确诊Duchenne/Becker肌营养不良的快速方法,同时可进行携带者筛查,为遗传咨询提供准确信息。

DMD基因和SRY基因单细胞三重及四重套式PCR技术的建立及其可靠性研究

种植前遗传学诊断（ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ＰＧＤ） 又称胚胎种植前遗传学诊断，是基于体外受精（ｉｎ ｖｉｔｒｏｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，ＩＶＦ）和早期胚胎活检（ｅａｒｌｙｅｍｂｒｙｏ ｂｉｏｐｓｙ）技术基础之上的一种新的遗传病产前诊断的方法。假肥大型肌营养不良症（ＤＭＤ／ＢＭＤ）作为一种常见的Ｘ－ 连琐隐性致死性遗传病，是国际上ＰＧＤ界最早选择进入ＰＧＤ 临床应用的几种遗传病之一。本文报道我们所建立的ＤＭＤ基因和ＳＲＹ 基因（（ｓｅｘ － ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｒｅｇｉｏｎ Ｙ，ＳＲＹ） 单淋巴细胞三重（ＤＭＤ） 基因外显子１９，４８ 及ＳＲＹ基因）及四重（ＤＭＤ基因外显子１７ 、４４ 、４５ 及ＳＲＹ 基因） 套式ＰＣＲ技术及其可靠性分析。采取外周血标本制备单淋巴细胞悬液，应用上述三重或四重套式ＰＣＲ 分析５０ 个正常男性单淋巴细胞，结果显示ＤＭＤ 基因外显子１７ 、１９、４４ 、４５、４８ 及ＳＲＹ 基因单淋巴细胞ＰＣＲ 扩增成功率分别为９２ ％ 、９６ ％ 、９４％ 、９６％ 、９４ ％ 以及９４－ ９６％ 。进一步分析５０ 个正常女性以及５０ 个ＤＭＤ 男性患者（缺失ＤＭＤ 基因外显子４４ ?

DMD基因杂合子携带者基因诊断技术研究进展

正常等位基因的存在和干扰，为ＤＭＤ基因杂合子携带者的基因诊断设置了重重的障碍．但是近年来一系列以ＰＣＲ为核心的基因诊断技术开始出现，从而基本上解决了长期以来甚为棘手的ＤＭＤ杂合子携带者基因诊断的难题，本文将系统地综述ＤＭＤ基因杂合子携带者基因诊断技术研究的历史和现状。

CNVPLUS■微阵列芯片在DMD基因诊断中的应用

探讨CNVPLUS■微阵列芯片(CNVPLUS■-array)在 DMD基因诊断中的应用价值。选取2014年1月至2023年3月在上海交通大学医学院附属新华医院儿内分泌遗传科就诊、临床诊断Duchenne/Becker肌营养不良(DMD/BMD)的96例儿童纳入回顾性分析,分别采用CNVPLUS■-array技术和多重连接探针扩增(MLPA)-二代测序(NGS)-Sanger测序序贯法检测患儿外周血 DMD基因。序贯法中,MLPA检出的单外显子缺失运用聚合酶链式反应(PCR)验证,PCR结果正常的样本再行Sanger测序;MLPA阴性的样本行NGS检测并用Sanger测序验证。结果显示,96例样本中,CNVPLUS■-array检出 DMD基因致病性变异91例,其中大片段缺失/重复即拷贝数变异(CNV)76例、微小变异即单核苷酸变异/小插入缺失(SNV/Indel)15例,5 d完成所有样本的实验和诊断;序贯法则检出致病性CNV 76例、SNV/Indel 20例,48 d完成全部实验和诊断。5例CNVPLUS■-array漏诊的SNV/Indel样本优化运算模式后致病位点可以正确聚类。综上,CNVPLUS■-array由于集CNV和SNV探针为一体,能同步检测 DMD基因的CNV和SNV/Indel,但对CNV的诊断性能优于SNV/Indel,有待优化运算模式必要时需补充其他检测以减少漏诊风险。

如何看待DMD基因相关治疗

2023年对于杜氏肌营养不良症(Duchenne musculardystrophy,DMD)家庭来说,真是“喜忧参半”。喜的是,2023年6月22日,美国新的基因替代治疗药物SRP-9001获得美国食品药品监督管理局加速批准上市,成为首个用于治疗DMD患者的一次性基因治疗药物。

DMD基因及其突变与诊断检测技术研究进展

1 DMD基因及其突变 DMD/BMD是由于DMD基因突变影响dystrophin蛋白在横纹肌组织的表达,导致肢体近端骨骼肌进行性萎缩、无力和腓肠肌假性肥大,为X连锁隐性遗传病。DMD基因是人类最大的基因之一,位于Xp21,在基因组序列上跨越了2.5Mb,占全部基因组序列长度的0.1%,占X染色体全长的1.5%。该基因99%的序列由内含子组成,编码区包括79个外显子及7个组织特异性的启动子[1]。