非同源末端连接修复通路DNA-PKcs基因在胶质瘤中表达及其机制研究

目的:研究DNA双链断裂损伤修复通路主要成员Ku70、Ku80、ERCC4、Lig4和DNA-PKcs基因在人脑胶质瘤中的mRNA表达及其与肿瘤发生的关系。方法:采用SYBR Green实时定量PCR技术检测36例人原发脑胶质瘤组织和12例正常脑组织中的Ku70、Ku80、ERCC4、Lig4和DNA-PKcs的mRNA水平。用亚硫酸盐处理基因组DNA后,采用甲基化特异的聚合酶链式反应(MSP)检测正常脑组织和胶质瘤组织中DNA-PKcs基因的甲基化水平变化。结果:与正常脑组织相比,Ku70、Ku80、ERCC4、Lig4基因表达量在脑胶质瘤和正常脑组织中无显著性变化(P>0.05),DNA-PKcs基因在脑胶质瘤中表达显性著上调(P=0.002)。DNA-PKcs基因在脑胶质瘤组织中表达量随胶质瘤恶性程度升高而增加。DNA-PKcs基因启动子甲基化程度在正常组织中高于肿瘤组织,表明甲基化程度的减少是引起胶质瘤中DNA-PKcs基因表达增高的原因。结论:DNA-PKcs基因在人脑胶质瘤中较正常脑组织表达显著上调,并且表达与脑胶质瘤的恶性程度相关。DNA-PKcs基因甲基化程度的降低是引起胶质瘤中DNA-PKcs基因表达增高的原因。

血清Wnt4基因启动子区的DNA甲基化程度对早产患者预测价值分析

目的 分析血清Wnt4基因启动子区的DNA甲基化程度对早产患者的预测价值。方法 随机选择2019年1-12月在该院产科病区产检的孕产妇480例,其中450例随访至分娩,将其中40例自发性早产的孕产妇作为早产组,410例足月产孕产妇作为健康组。比较健康组、早产组、早产组不同孕周者的血清Wnt4基因启动子区的DNA甲基化水平。分析健康组、早产组的临床数据,采用Logistic回归分析早产的风险因素,绘制受试者工作特征(ROC)曲线分析血清Wnt4基因启动子区的DNA甲基化程度对早产的预测价值。结果 与健康组比较,早产组血清Wnt4基因启动子区的DNA甲基化程度明显增高(P<0.05);与早产组34~<37周妊娠期女性相比,孕周28~<34周妊娠期女性血清Wnt4基因启动子区的DNA甲基化程度明显增高(P<0.05);与健康组比较,早产组产次≥2次、妊娠期被动吸烟、阴道胎儿纤维连接蛋白(fFN)阳性、家庭平均月收入<1 000元的比例明显增加(P<0.05),宫颈长度明显缩短(P<0.05);Logistic回归分析结果显示,产次≥2次、妊娠期被动吸烟、宫颈长度短、阴道fFN阳性、家庭平均月收入<1 000元、血清Wnt4基因启动子区的DNA甲基化程度高均是早产的主要风险因素(P<0.05);ROC曲线分析结果表明,血清Wnt4基因启动子区的DNA甲基化程度预测早产的曲线下面积为0.868(95%CI:0.834~0.898),最佳截断值为51.43%,灵敏度、特异度、准确度分别为82.50%、84.63%、84.44%。结论 血清Wnt4基因启动子区的DNA甲基化程度高对于早产具有一定的临床预测价值。

基于eDNA宏基因组的草海湖泊硅藻群落及多样性分析

环境DNA(eDNA)技术作为新兴生物多样性监测方法,具有非侵入性、高效性及灵敏性的特点.为探究基于宏基因组测序的eDNA技术对喀斯特湖泊硅藻监测的适用性,以贵州草海为例,采集草海湖滨带的水样及表层沉积物样品,运用宏基因组学与eDNA相结合的方法,分析浮游及沉积硅藻的群落组成、生物多样性及KEGG代谢功能.结果表明:①草海硅藻群落共注释到4纲23目36科54属78种,在科分类阶元上以舟形藻科和海链藻科为优势类群.硅藻群落的Chao1指数平均值为42.88±15.35,Shannon-Wiener指数平均值为2.09±0.29.②硅藻群落KEGG通路功能最具代表性的是全局和概述图谱(global and overview maps),其次是能量代谢、翻译;优势KO基因主要为atpF基因、secA基因、rplT基因、rpoA基因、argH基因.③主坐标分析(PCoA)和相似性分析(ANOSIM)表明硅藻群落存在显著的环境介质差异;LEfSe分析揭示浮游硅藻群落的差异标志物主要为海链藻属(Thalassiosira)、小环藻属(Cyclotella),沉积硅藻主要是管状藻属(Fistulifera)、褐指藻属(Phaeodactylum)、微壳藻属(Nanofrustulum)等;Wilcoxon秩和检验表明,浮游硅藻的差异基因集中在叶酸生物合成通路、嘧啶代谢,沉积硅藻的差异基因集中在光合作用、氧化磷酸化等代谢功能.研究显示,高灵敏性的eDNA宏基因组技术能有效描述草海湖泊硅藻群落及多样性,在喀斯特湖泊生物多样性监测及水生态环境健康评估具有广阔的应用前景.

沉默DNA-PKcs对细胞信号转导相关基因转录的影响

利用RNA干扰技术构建DNA-PKcs表达抑制细胞模型,探讨DNA-PKcs对HeLa细胞信号转导相关基因表达的调控作用.通过观察细胞对辐射及顺铂的敏感性,鉴定细胞表型变化.用寡核苷酸芯片检测细胞信号转导相关基因的转录谱,并用RT-PCR方法和SEAP检测系统进一步验证基因的表达变化.所筛选出的DNA-PKcs表达抑制细胞对辐射及顺铂的敏感性升高,15个与细胞信号转导相关的基因表达升高,其中7个是与干扰素信号转导反应相关的基因.8个表达下降,包括有细胞增殖分化相关基因,如NFAT.RT-PCR检测结果与芯片结果相一致,利用SEAT报告系统检测,进一步证实NFAT转录活性下调.实验结果表明,DNA-PKcs除了参与DNA修复外,还调控细胞信号转导相关基因的表达,而且大多与细胞增殖分化相关.

β-榄香烯乳联合照射对DNA-PKcs基因表达及凋亡的影响

目的探讨β-榄香烯乳影响肺腺癌A549细胞凋亡及DNA-PKcs基因表达的放射增敏机制。方法实验分为对照组、单纯照射组(4Gy照射)、单纯药物组(10μg/ml、20μg/mlβ-榄香烯乳)、药物+照射组(10μg/ml、20μg/mlβ-榄香烯乳+4Gy照射)。采用四氮唑蓝比色分析法(MTT法)检测β-榄香烯乳对肺腺癌A549细胞的半数抑制浓度(IC50);克隆形成实验计算细胞存活率;采用流式细胞仪检测细胞周期与凋亡率;逆转录实时荧光定量PCR技术(RT-PCR)检测细胞DNA-PKcs基因mRNA表达量。结果MTT法测得β-榄香烯乳对A549细胞的IC50值为120μg/ml;克隆形成实验证明β-榄香烯乳对A549细胞有放射增敏作用;药物+照射组细胞G2/M期比率及凋亡率明显高于单纯照射组及单纯用药组(P<0.05);药物+照射组DNA-PKcs基因mRNA表达量与单纯照射及单纯用药组相比明显下降(P<0.05)。结论β-榄香烯乳可通过促进A549细胞凋亡及抑制DNA-PKcs基因mRNA表达实现对A549细胞放射增敏作用。

猪MKRN 3基因的印记表达和DNA甲基化状态分析

旨在探讨MKRN 3基因在野生型猪和克隆猪中的印记状态及其DNA甲基化水平。本研究利用西方猪种(杜洛克猪)与本地猪种(巴马猪或荣昌猪)中存在的种间单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP),检测MKRN 3基因在3只足月出生0天的野生型杂交猪中的印记状态。利用MethPrimer网站预测MKRN3启动子区附近的CpG岛,并在卵母细胞和精子基因组中验证CpG岛是否为差异甲基化区域(differentially methylated region,DMR)。对3只野生型杂交猪和两只克隆猪基因组DNA进行亚硫酸盐转化后测序,检测MKRN 3-DMR在野生型猪和克隆猪的甲基化状态,并分析其甲基化状态与基因表达的关系。结果表明,在MKRN 3基因的编码区域,西方猪种(杜洛克猪)与本地猪种(巴马猪和荣昌猪)之间存在一个SNP:A/G;RT-PCR测序结果显示,MKRN 3在其中1只野生型个体(杜洛克猪与巴马猪杂交后代:DB2)的心脏组织呈双等位基因表达,在肝脏、脾脏、肺等器官和脑组织中均为单等位基因表达,且均表达父本来源的等位基因。MKRN 3-DMR在精子中表现为低甲基化(0%),在卵母细胞中表现为高甲基化(70.9%)。杂交猪6个组织中的MKRN 3-DMR平均甲基化水平分别为:心脏(43.1%)、肝脏(46.2%)、脾脏(48.4%)、肺(45.6%)、肾脏(48.5%)、脑(44.3%);在新生克隆猪的大部分组织中,MKRN 3表达父本来源等位基因,MKRN 3-DMR甲基化水平与野生型杂交猪相近。而在NT201和NT207脾脏中,其甲基化水平分别为79.0%和80.1%,SNP测序结果也表明在两个克隆猪脾脏中,MKRN 3不再维持印记状态,提示克隆猪脾脏组织中MKRN 3印记异常。综上所述,MKRN 3在野生型猪肝脏、脾脏、肺、肾和脑组织中呈母本印记、父本表达,在心脏为非印记状态;克隆猪部分组织中,MKRN 3印记表达和甲基化状态均为异常;启动子的DMR调控MKRN 3表达。

不同单细胞全基因组扩增体系扩增牛微量血液DNA效果评价

旨在通过二代测序技术评估不同单细胞全基因组扩增(single cell whole genome amplification,scWGA)体系对牛微量血液基因组DNA的扩增效果,建立微量DNA全基因组扩增体系。本研究分别采用MDA(multiple displacement amplification)和MALBAC(multiple annealing and looping-based amplification cycles)两种scWGA体系对华西牛1 ng血液基因组DNA进行全基因组扩增,随后基于两种体系的扩增产物以及原始未稀释血液DNA构建测序文库,利用DNBSEQ-T7RS测序平台进行全基因组测序(whole genome sequencing,WGS),通过比较扩增产物片段大小、浓度、总质量评估扩增效率,通过分析GC含量、测序覆盖度、基因分型一致率、基因型检出率等评估两种体系的扩增效果。结果显示,MDA体系的扩增产物片段大于MALBAC体系(8 kb vs.0.2~2 kb),产物浓度和总质量显著高于MALBAC体系(P<0.05)。基于测序数据,1×和5×测序深度下,MDA体系的基因组覆盖度显著高于MALBAC体系(P<0.05),此外,MDA体系的分型一致率、检出率显著高于MALBAC体系,而等位基因缺失率、假阳性率显著低于MALBAC体系(P<0.05)。综上,本研究揭示了MDA和MALBAC两种扩增体系基于华西牛1 ng血液基因组DNA扩增的体系特点,为改进现有华西牛胚胎基因组选择中的关键扩增技术提供理论依据,促进华西牛遗传育种进展。

4个基因在副猪嗜血杆菌感染仔猪脑组织中DNA甲基化与mRNA表达联合验证

【目的】验证候选基因在副猪嗜血杆菌(Glaesserella parasuis,GPS)感染仔猪脑组织中DNA甲基化与mRNA表达之间的联合调控关系,为揭示副猪嗜血杆菌引起仔猪脑膜炎的表观致病机理提供理论依据。【方法】选取6头28日龄断奶仔猪,随机均分为对照组和GPS组,GPS组仔猪腹腔注射1 mL 2×109 CFU/mL副猪嗜血杆菌SH0165菌液,对照组仔猪腹腔注射等量生理盐水,7 d后采集仔猪脑组织提取DNA和RNA。采用实时荧光定量PCR检测4个候选基因(LYPD1、PITPNM1、SYP、ACVR1B)的mRNA表达量,并利用重亚硫酸盐测序(bisulfite sequencing PCR,BSP)、甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)检测副猪嗜血杆菌感染前后4个基因在仔猪脑组织中的DNA甲基化变化。【结果】本研究成功将MSP方法应用于基因的DNA甲基化测序研究,使其不局限于定点检测甲基化位点。实时荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,GPS组仔猪LYPD 1、PITPNM 1、SYP、ACVR 1 B基因mRNA表达均显著或极显著下调(P<0.05;P<0.01)。DNA甲基化测序结果显示,除ACVR 1 B基因外,各基因DNA甲基化均上调。【结论】除ACVR 1 B基因外,LYPD 1、PITPNM 1、SYP 3个基因DNA甲基化与mRNA表达水平呈反向关联调控,副猪嗜血杆菌感染后仔猪脑组织DNA甲基化变化对4个候选基因的表达具有不同的调控模式。

结直肠癌p53和DNA损伤调节基因1的表达及临床意义

目的 分析p53和DNA损伤调节基因1(p53 and DNA damage regulated gene 1,PDRG1)在结直肠癌中的表达及其临床意义。方法 检索癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库中结直肠癌数据集,比较PDRG1 mRNA在结直肠癌组织和正常结直肠组织中的表达差异,分析其表达与临床病理特征及预后的关系。DNA甲基化交互可视化数据库(DNA methylation interactive visualization database,DNMIVD)分析PDRG1基因甲基化与m RNA表达水平的关系。另选取本院2019年2月至2020年5月存档的102例结直肠癌组织及其癌旁正常结直肠组织石蜡标本进行验证,采用免疫组织化学法检测PDRG1蛋白的表达。结果 TCGA数据库分析发现,PDRG1 mRNA在结直肠癌组织(n=284)中的表达较正常结直肠组织(n=41)增高(P<0.01),且结直肠癌PDRG1 mRNA表达与拷贝数变异呈正相关(n=273;r=0.792,P<0.01)。DNMIVD分析显示,PDRG1启动子甲基化β值与基因表达水平呈负相关(r=-0.34,P<0.01)。TCGA数据库分析显示,结直肠癌患者(n=273)PDRG1 mRNA表达在肿瘤位置、TNM分期及远处转移方面比较,差异均具有统计学意义(均P<0.05);对245例结直肠癌患者进行Kaplan-Meier生存分析发现,PDRG1 mRNA高表达患者(以中位数为分界值,大于中位数为高表达)无瘤生存期较短(P=0.019)。免疫组织化学检测显示,结直肠癌组织中PDRG1蛋白表达阳性率高于正常结直肠癌组织[87.3%(89/102) vs32.4%(33/102),P<0.01]。结论 PDRG1在结直肠癌中高表达,且与肿瘤位置、远处转移和无瘤生存期有关,可能成为结直肠癌潜在的生物标志物。

DNA甲基化调控相关基因在糖尿病足溃疡中的研究进展

糖尿病足溃疡(DFU)是一种常见的慢性难愈性溃疡,也是糖尿病患者截肢甚至死亡的主要原因。DFU因迁延难愈,并且容易愈后复发,给患者带来了巨大的经济和心理负担,现已成为亟待解决的社会公共卫生问题。DNA甲基化是表观遗传学领域的一大热点,是目前研究最为深入的表观遗传机制之一,在疾病的发生发展过程中发挥着关键作用。DNA甲基化发生发展过程中的众多关键基因对DFU的调控机制尚不明确。本文综述了5个DNA甲基化调控基因在DFU愈合过程中的作用,旨在为进一步指导DNA甲基化在DFU中的应用提供参考。

Uhrf1基因重组腺病毒载体构建及其在小鼠心肌细胞DNA损伤修复中的作用研究

目的:构建携带小鼠泛素样同源域和环指结构域1(Uhrf1)基因的重组腺病毒载体,验证Uhrf1基因在原代乳鼠心肌细胞中的表达情况,并探究其在过氧化氢(H_(2)O2)诱导的心肌细胞DNA损伤中的作用。方法:利用PCR扩增小鼠Uhrf1基因的编码序列,将其酶切后插入pADM-CMV-C-FH载体,获得重组腺病毒质粒ADM-Uhrf1。将该质粒转染至HEK293T细胞包装成重组腺病毒颗粒,数代扩增后进行腺病毒的纯化及滴度检测。分离25只1日龄ICR小鼠原代心肌细胞,分为两组,以感染复数(MOI)为50的比例分别感染ADM-Uhrf1及ADM-control(ADMCtrl),通过Western blot及免疫荧光染色验证重组腺病毒介导的UHRF1蛋白的表达,并利用H_(2)O2诱导心肌细胞DNA损伤,进而探究Uhrf1在DNA损伤修复过程中的作用。结果:通过壳蛋白免疫法检测得到的ADM-Uhrf1病毒滴度为1.8×10^(13) pfu/L。Western blot验证显示UHRF1蛋白表达水平显著升高(P<0.05),免疫荧光染色显示UHRF1主要表达在细胞核内,且Uhrf1的过表达能够显著抑制DNA损伤标志物磷酸化组蛋白H_(2)A变异体(γH_(2)AX)蛋白的表达(P<0.01)。结论:成功构建了携带小鼠Uhrf1基因的重组过表达腺病毒载体,并通过腺病毒递送系统在心肌细胞中实现了Uhrf1的过表达,且Uhrf1的过表达有效减轻了H_(2)O2诱导的心肌细胞DNA损伤。

DNA损伤效应主动监测的抗氧化基因缺失微生物传感器的构建及性能评价

目的活性氧基团(ROS)水平升高会引起生物体的DNA氧化损伤,监测DNA的氧化损伤程度,能够实现ROS损伤效应的有效评价。基于微生物传感器监测DNA损伤效应可以定量评价氧化损伤程度,但微生物本身具有的ROS清除机制,会影响监测灵敏度。本研究旨在敲除细菌ROS清除机制的关键基因,构建抗氧化基因缺失微生物传感器,实现对DNA损伤效应的灵敏监测,评价ROS对生物体的损伤效应。方法本研究基于λ-Red同源重组的方法敲除细菌抗氧化损伤相关基因ahpCF、katE与katG,构建抗氧化基因缺失微生物传感器,并评价传感器对萘啶酮酸钠和紫外照射的响应。结果成功构建ΔahpCF、ΔahpCF/ΔkatE与ΔahpCF/ΔkatE/ΔkatG三种抗氧化基因缺失的微生物传感器,工程菌ΔahpCF/ΔkatE/ΔkatG对DNA损伤试剂萘啶酮酸钠的响应灵敏度最高,检测限为0.40μmol/L,另外,1.80 min的紫外照射(254 nm)可诱导工程菌产生显著的荧光表达效应。结论本研究构建了抗氧化基因缺失微生物传感器,实现了对DNA损伤试剂和紫外照射等DNA损伤效应的主动灵敏监测,可为未来空间辐射效应的评价提供一种主动、有效、灵敏的潜在监测方法。

败酱草及其近缘种叶绿体全基因组分析和DNA条形码构建

目的:基于败酱类药材基原植物的叶绿体基因组序列分析开发特定的DNA条形码,准确鉴别败酱草及其近缘种。方法:采用Illumina高通量测序技术对败酱科败酱属植物白花败酱、黄花败酱和异叶败酱的叶绿体基因组进行测序;采用生物信息学软件对基因组进行组装注释、特征分析、序列比较和系统发育分析;基于叶绿体基因组高突变区构建特异性DNA条形码进行验证。结果:3种败酱属植物叶绿体基因组呈四分体结构,全长分别为159585、158919、158919 bp,编码的基因数分别为130、132、132,包含8个rRNA基因和37个tRNA基因,蛋白质编码基因数分别为85、87、87。ccsA、ndhG、rpl23、ndhF序列作为特异性DNA条形码成功扩增16份样品,黄花败酱、白花败酱和少蕊败酱聚类在同一支,异叶败酱和糙叶败酱聚类在另一支。通过ccsA、ndhG、ndhF序列可进一步鉴别糙叶败酱和异叶败酱。结论:ccsA、ndhG、rpl23、ndhF序列可作为补充特异性DNA条形码区分败酱草及其近缘种。

铜绿假单胞菌oprI基因DNA疫苗及其重组亚单位疫苗免疫效果的评估

为评估铜绿假单胞菌opr I基因DNA疫苗和重组亚单位疫苗对小鼠的免疫效果,本实验将铜绿假单胞菌外膜蛋白编码基因opr I克隆至真核表达载体p CAGGS-HA中构建重组质粒p CAGGS-opr I,经酶切鉴定正确后获得DNA疫苗。同时将opr I基因克隆至原核表达载体p ET32a中构建重组质粒p ET32a-oprI,经酶切鉴定正确后转入大肠杆菌,经IPTG诱导重组Opr I蛋白(rOprI)的表达,采用亲和层析法纯化后以SDS-PAGE检测,结果显示正确表达了r Opr I,且获得了其纯化蛋白,利用其制备重组亚单位疫苗。分别以DNA疫苗和重组亚单位疫苗免疫BALB/c小鼠,并以铜绿假单胞菌的灭活疫苗和外膜蛋白疫苗为对照,采用间接ELISA法检测免疫后不同时间小鼠血清中的抗体水平和血清中IFN-γ、IL-2和IL-4的含量;初免42 d后以铜绿假单胞菌(1.25×109 cfu/mL,100μL/只)对各组小鼠进行攻毒试验,通过测定各疫苗对小鼠的保护率,评估疫苗的保护效果。结果显示,各疫苗诱导的免疫小鼠血清抗体水平和细胞因子含量均显著高于阴性对照组(P<0.05),且重组亚单位疫苗诱导小鼠的抗体水平和IL-4含量均显著高于DNA疫苗(P<0.05),而IFN-γ和IL-2含量则与DNA疫苗无显著差异(P>0.05)。小鼠攻毒试验结果显示,DNA疫苗组、重组亚单位疫苗组、外膜蛋白疫苗组和灭活疫苗组小鼠获得的免疫保护率分别为45%、55%、70%和95%。上述结果首次表明以铜绿假单胞菌opr I基因制备的DNA疫苗和r Opr I重组亚单位疫苗均可诱导小鼠产生体液和细胞免疫应答,并可为小鼠提供对铜绿假单胞菌攻毒的免疫保护效果,但二者的免疫效果还需进一步提高。本研究为铜绿假单胞菌疫苗的研究提供了参考依据。

基于mtDNA Cytb基因对甘肃4个马群体遗传多样性和系统发育的研究

为了研究甘肃境内部分马群体的遗传多样性、遗传结构和母系起源,试验采用DNA测序技术对甘肃4个马群体(岔口驿马49匹、河曲马20匹、山丹马30匹和肃南马34匹)共133个个体血样的线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)中的细胞色素b(cytochrome b,Cytb)基因进行PCR扩增,并对4个马群体的Cytb基因序列特征、遗传多样性、遗传距离、遗传分化与变异进行了分析,结合其他马群体的Cytb基因序列构建了系统发育树单位型网络关系图。结果表明:4个马群体Cytb基因序列全长1140 bp,A+T含量(54.6%)大于G+C含量(45.4%),共检测到46个多态位点,33种单倍型;总单倍型多样度为0.9332±0.0100,总核苷酸多样度为0.00385±0.00017,总平均核苷酸差异为4.3714,平均Tajima's D值和Fu's Fs值分别为-1.0352和-13.057;4个马群体间的遗传距离、遗传变异系数和基因流的范围分别为0.0035~0.0042,0.01923~0.09132,4.975~25.504;4个马群体内的遗传变异(94.54%)远大于其群体间的遗传变异(5.46%);4个马群体的33种单倍型分散于6个支系(A~F)中。说明甘肃4个马群体间亲缘关系较近,都具有较高的遗传多样性且均为多母系起源。

3种褐黄血蜱基因组DNA提取方法的比较

目的在保持褐黄血蜱Haemaphysalis flava寄生蜱虫体形态完整的前提下,综合比较95℃水浴法、改良碱裂解法、离心柱法3种提取方法对蜱组织DNA提取质量的差异,筛选适用于蜱鉴定分型的高效稳定基因组DNA提取方法。方法取蜱标本的一只足作为实验样本,通过95℃水浴法、改良碱裂解法和离心柱法分别提取样品中基因组DNA,检测提取物浓度以及A260/A280和A260/A230比值,并通过PCR技术检测蜱分型相关基因16S rDNA(16S ribosoma DNA,16S核糖DNA)、ITS2(internal transcribed spacer 2,内转录间隔区2)的片段扩增效率,综合分析3种提取方法的优劣。多组之间使用单因素方差分析(ANOVA检验),两组之间比较采用t检验分析。P<0.05为差异有统计学意义。结果3种提取方法均可获得足量的蜱基因组DNA,改良碱裂解法提取效率显著高于其他2种方法(P<0.05),A260/A280和A260/A230比值结果表明离心柱提取法获得的DNA纯度更高,进一步的PCR实验表明,在模板量一致的情况下,以离心柱法提取的DNA为模板扩增产生的16S rDNA、ITS2片段扩增效率更高,而以95℃水浴法提取的DNA为模板扩增产生的16S rDNA、ITS2片段效率较低。结论离心柱法是提取蜱基因组DNA高效且实用的方法,能够在保持虫体形态完整的情况下满足对寄生蜱进行后续基因分型实验的要求。

PROSER2基因在牛中的印记表达和DNA甲基化分析

为了研究牛PROSER2基因的印记状态和表观遗传修饰机制,本研究首先应用荧光定量RT-PCR方法分析PROSER2基因在牛组织和胎盘中的表达,进而应用基于单核苷酸多态性(SNP)的RT-PCR产物直接测序法分析等位基因表达状态,最后采用亚硫酸盐直接测序法对位于PROSER2基因启动子及第1个外显子区域和位于外显子4区域的2个CpG岛的甲基化状态进行了分析。结果显示,PROSER2基因在所有检测的6个组织(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大脑)及胎盘中均广泛表达。PROSER2基因在牛的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大脑以及胎盘中均为单等位基因表达。根据杂合胎盘父母的基因型,发现PROSER2基因在牛中是父源印记基因,这与其在人中的印记状态一致。对PROSER2基因启动子和第一个外显子处CpG岛区域的甲基化状态进行分析,在牛的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大脑和胎盘中均发现1个差异甲基化区,说明DNA的甲基化修饰可能参与PROSER2基因在荷斯坦奶牛中的印记表达。本研究结果可为进一步研究PROSER2基因的功能和印记调控机制提供参考依据。

基因组和DNA甲基化组联合分析筛选猪肉质性状关键基因

【背景】猪的肉质性状是重要的经济性状。研究影响各类肉质性状的分子机制,发掘关键基因,从而指导猪的遗传改良,对改善猪肉品质具有重要意义。当前肉质相关的机制研究主要是基于DNA的基因组研究,而对肉质性状的DNA甲基化研究以及结合基因组和甲基化组的综合分析却鲜有报道。【目的】通过基因组和DNA甲基化组联合分析,筛选、鉴定了影响猪肉质的潜在关键基因。为猪肉品质的遗传改良研究提供借鉴。【方法】检测了140头大白猪背最长肌的28个肉质性状,通过表观基因组关联分析(EWAS)与全基因组关联分析(GWAS)筛选了各性状显著关联的CpG和SNP位点。随后以SNP为协变量对GWAS和EWAS重叠的显著关联位点进行条件关联分析,进一步筛选具有独立效应的CpG位点。然后以CpG位点的甲基化水平为因变量,以SNP为自变量进行关联分析从而鉴定甲基化数量性状位点(meQTL)。最后使用顺式甲基化数量性状位点(cis-meQTL)作为工具变量进行孟德尔随机化分析,从而推断cis-meQTL与表型之间的因果关系,同时对位点进行注释,鉴定潜在的关键基因。【结果】(1)在屠宰45 min黄度值(b_(45min))、滴水损失(DL)、二十二碳六烯酸(C22:6n-3)3个肉质性状上,EWAS和GWAS在相同基因组区域鉴定到显著关联位点。(2)b_(45min)的7个CpG位点在条件关联分析后仍保持显著,DL有1个CpG位点在条件关联分析后仍保持显著,而C22:6n-3的3个位点在使用SNP作为协变量分析后不再显著,表明EWAS鉴定的b_(45min)的7个CpG位点和DL的1个CpG位点的显著关联不受附近的显著SNP影响。(3)b_(45min)的7个CpG位点和DL的1个CpG位点共鉴定了10个meQTL,但绝大多数是trans-meQTL,只有一个CpG位点(SSC12:44254675 bp)鉴定到一个cis-meQTL,表明该位点可能受到近距离SNP调控。(4)孟德尔随机化分析显示该CpG位点(SSC12:44254675 bp)与b_(45min)表型存在一定的因果关联。(5)对该位点注释发现,距离CpG位点(SSC12:44254675 bp)和其cis-meQTL最近的基因是NOS2,且CpG位点位于NOS2基因内。【结论】综合DNA甲基化组合基因组数据联合分析结果,可以推测NOS2基因是肉色性状关键候选基因,其DNA甲基化、SNP共同作用调控基因表达,进而影响肉色性状相关基因表达。

药用植物虎耳草的DNA条形码鉴定及基因组大小评估

目的:通过对虎耳草(Saxifraga stolonifera)进行物种鉴定和基因组大小测定,以更全面地开发其植物资源的遗传信息。方法:通过对虎耳草DNA条形码引物的筛选,发现ITS2+matK条形码可确认待测的植物样本为虎耳草。进一步利用虎耳草及其近似物种的ITS2和matK条形码序列构建系统发育树。进化分析结果表明虎耳草与其同属物种的亲缘关系较远。结果:流式细胞术估测虎耳草基因组大小约为949.4 Mb。结论:本研究基于条形码序列对十堰武当山本地的虎耳草物种进行了鉴定,为虎耳草的基因组提供了特征信息,为后续虎耳草全基因组测序研究的物种选择和测序策略规划提供了参考。

RNA干扰抑制胰腺癌细胞DNA-PKcs基因表达对放射敏感性的影响

目的探讨稳定表达的siRNA抑制DNA-PKcs基因表达对胰腺癌细胞BxPC-3放射敏感性的影响。方法以人胰腺癌细胞BxPC-3为研究对象,将预先设计的siRNA与质粒连接。构建质粒与阴性对照质粒分别转化大肠杆菌,经克隆、扩增、纯化后转染BxPC-3细胞,潮霉素筛选,以半定量Westernblot检测靶蛋白表达变化,用细胞克隆计数实验检测放射敏感性变化。结果成功构建以DNA-PKcs基因mRNA为靶序列的pSilencer2.1质粒,经潮霉素筛选出稳定的整合目的质粒的BxPC-3细胞,DNA-PKcs蛋白被抑制最大达到83%,实验组D0、Dq及SF2(1.284±0.017、4.006±0.023和0.567±0.045)均明显低于阴性对照组(1.458±0.026、4.840±0.019和0.833±0.076)(P<0.001)。SER为1.47。结论针对DNA-PKcs基因的siRNA表达载体稳定转染人胰腺癌细胞BxPC-3,能够引发DNA-PKcs表达抑制,进而产生放射增敏作用。