肺癌组织中DNA修复基因ERCC1的表达与多环芳烃 -DNA加合物的关系

目的 :探讨核苷酸切除修复基因ERCC1在肺癌中的表达及其与多环芳烃 (PAH) -DNA加合物的关系。方法 :用RT -PCR技术检测 15 0例肺癌、12 0例癌旁肺组织、4 0例肺良性病变和 4 0例正常肺组织中ERCC1基因mRNA的表达 ;用免疫法检测PAH -DNA加合物 ;分析有关暴露因素对修复基因ERCC1的表达和PAH -DNA加合物的影响 ,并探讨ERCC1与PAH -DNA加合物的关系。结果 :30 7% (4 6 / 15 0 )的肺癌组织和 2 5 % (1/ 4 0 )的正常肺组织存在ERCC1基因的表达低下 ;吸烟可抑制ERCC1基因的表达。肺组织中PAH -DNA加合物的水平与ERCC1基因表达呈显著负相关 ,Spearman相关系数为 - 0 6 4 8,P <0 0 1。结论 :ERCC1是参与修复DNA加合物等损伤的一个重要的核苷酸切除修复基因 。

免疫毛细管电泳-激光诱导荧光分析DNA加合物的方法学研究

DNA加合物是一类重要的生物标志物,可应用于人体致癌物暴露监测、癌症风险评价和人群易感性研究。DNA加合物作为生物标志物的应用需要安全、灵敏、快速的先进分析技术。我们利用免疫毛细管电泳-激光诱导荧光分析,发展了高灵敏的DNA加合物分析方法和技术。本文主要介绍了相关的仪器研制及方法学研究。方法学研究涉及DNA加合物荧光探针的合成和表征、抗体与DNA加合物的相互作用及其结合计量学、抗原-抗体复合物的稳定化和DNA驱动电泳聚焦技术。

灭幼脲光解产物DNA加合物的研究

灭幼脲(邻氯苯甲酰基-对氯苯基-脲)本身是一种低毒、低残留、没有致突、致癌性的农药.但是它的某些分解产物,如:氯苯、对氯苯、对氯苯基脲等有一定的毒性.邻氯苯甲酰胺(灭幼脲的主要光解产物——CBA)和未经分离的灭幼脲光解产物的混合物,在试管反应条件下能与小牛胸腺DNA反应形成多种DNA加合物,用P_1加强灵敏度的^(32)P后标记方法分析,有四种DNA加合物被检出(DNA-CBA),实验证明,邻氯苯甲酸胺和灭幼脲光解产物的混合物在Ames实验中也均呈阳性结果,初步说明两者都可能具有一定的致突性.经单独碱基和邻氯苯甲酰胺试管反应的加合物鉴定,验证出其中较强的一种加合物是邻氯苯甲酸酰与2’-脱氧腺嘌吟-3’-单磷酸碱基(dAMP)反应所形成的加合物(dA-CBA),已占所形成加合物总量的57%.从^(32)P后标记方法所测的DNA加合物的自显影指纹图上可以看出,邻氯苯甲酰胺和灭幼脲光解产物混合物的DNA加合物具有相同的迁移特性.初步说明,尽管灭幼脲原体化合物没有致突性,但它的主要光解产物邻氯苯甲酰胺具有一定基因突变性,所以不仅应对原体化合物进行评价,而且还必须对它的分解物和代谢物同时进行安全评价.

苯处理SD大鼠器官和血中DNA加合物的形成与分布

以Ｐ＿１核酸酶提高灵敏度的后标记法系统研究活体条件下腹腔注射苯处理的ＳＤ大鼠脏器和血细胞中ＤＮＡ加合物的形成与分布．结果表明，苯诱导或Ａｒｏｃｌｏｒ诱导对苯处理的ＳＤ鼠体内ＤＮＡ加合物的形成有明显的促进作用，苯诱导的促进作用大于Ａｒｏｃｌｏｒ诱导．采用共价加合物标记指敌对 后标记法数据进行计算的结果表明，此指数能反映出同一处理不同器官及不同处理相同器官中的ＤＮＡ加合物的形成与分布情况，在一定程度上还能表征化学品的生态毒理效应和基因毒性．

DNA加合物8-羟基脱氧鸟苷特性研究

作为DNA氧化损伤的生物学标志物,8-羟基脱氧鸟苷(8-OH-dG)的特性研究,对稳定、灵敏、准确地定量8-OH-dG,进而研究有毒化学物质对生物体内的氧化损伤很重要。该文研究了氧化损伤后DNA中8-OH-dG的分析、水解、储存、稳定性等方面的问题。采用Fenton型产羟自由基系统如螯合剂Fe2+-H2O2为氧化源,与脱氧鸟苷和小牛胸腺DNA反应,生成的8-OH-dG用高压液相色谱-电化学法检测,并对8-OH-dG的分析条件进行优化。该法最低检出限为32fmol,比光学吸收法高2～3个数量级,线性范围可高达4个数量级,从0.32pmol到3.2nmol,相关系数0.9996。并对酶水解DNA的条件、储存酸度、介质环境及其稳定性等进行了探讨,结果表明8-OH-dG储存在中性偏酸的缓冲溶液中损失较少,其形成与所处介质环境有关,在氧化源存在或有氧环境中一定时间内有累积作用,添加抗氧化剂等干预措施后,能灵敏而稳定地对DNA中的8-OH-dG进行测定。

城市与农村不吸烟女性肺组织中DNA加合物含量

为更客观地评价空气污染与肺癌的关系，用３２Ｐ后标记法检测城市与农村不吸烟女性肺癌患者与非肺癌患者正常肺组织中ＤＮＡ加合物的含量。城乡妇女、城乡肺癌患者、城乡非肺癌妇女、城市肺癌妇女与农村非肺癌妇女、农村肺癌患者与非肺癌妇女之间均未见统计学差异，但发现城市患者比农村患者，肺癌患者比非肺癌患者的肺组织ＤＮＡ加合物含量高的趋势。

苯DNA加合物的组织分布及其与细胞遗传毒性的关系

用Ｐ１增强的３２Ｐ－后标记方法测定了经腹腔注射染苯小鼠不同组织ＤＮＡ加合物的分布及其与苯引起的外周血白细胞（ＷＢＣ）减少、淋巴细胞微核形成及骨髓细胞染色体畸变的关系。结果表明：１．苯在小鼠骨髓、肝脏和外周血ＷＢＣ均可形成ＤＮＡ加合物，其加合物含量以骨髓最高，肝脏次之，ＷＢＣ最低。本结果与苯的代谢及毒性作用特点相一致。２．ＤＮＡ加合物形成与细胞毒性有关系，ＤＮＡ加合物量增加，淋巴细胞微核及骨髓细胞染色体畸变亦增加，而外周血白细胞数明显减少，显示细胞遗传毒性和细胞毒性均增大。本研究为ＤＮＡ加合物作为生物学监测指标，筛选高危人群提供了有力的实验依据。

以DNA加合物为生物标志物研究钱塘江水系致癌物水平

目的:研究钱塘江水系中致癌物大致污染情况。方法:以淳安千岛湖作为对照点,以钱塘江水系中闻家堰、兰江和衢江段为调查区,对各个采样点野生鲫鱼鳃DNA加合物水平进行测定。结果:兰江、闻家堰和衢江段鱼鳃相对DNA加合物水平显著高于对照(P<0.05),分别为对照的4、2.2和1.9倍。结论:鱼鳃DNA加合物水平的显著升高,表明水体中致癌物含量升高,可能导致人体致癌危险度增加,这对人体是一种潜在的危害,应该引起广泛的重视。因此,建议有关部门在制定饮用水标准时,应该将水源水中除氮磷外的其它污染物尤其是致癌物考虑在内。

用^(32)P后标记方法测定典型有毒污染物的DNA加合物

^(32)P后标记方法测定生物样品里的有毒污染物-DNA加合物的过程是用小球菌核酸酶和脾核酸酶将DNA及加合物酶解成为2’-脱氧核苷3’-单磷酸(3’-dNmP+3’-dXmP).以它为底物,在T_4多核苷酸激酶的催化下,与γ^(32)P ATP进行放射磷的转移反应,形成带放射磷的2’-脱氧核苷3’5’-二磷酸酯(3’5’-dNDP+3’5’-dXDP),用ODS-TLC吸附薄层板和PEI-TLC阴离子交换薄层板将标记过的带放射磷的3’5’-二磷酸酯分离分辨,然后用自显影技术制成加合物的指纹图,液闪计数计算出加合物的含量RAL值(相对加合物标记值).方法的灵敏度可达到1加合物/10^(10)正常核酸.本文对典型的有毒物苯乙烯及代谢物环氧苯乙烯(in vitro,in vivo,in human样品),苯及代谢物酚(in vivo样品),醌(in vitro,in vivo样品),单甲脒(in vitro,in vivo样品),2-硝基芴(in vivo)等的DNA加合物进行研究,其结果发现有毒物的DNA加合物和相应的有毒化合物的性质和剂量有相关性.

α-羟基化吡咯烷亚硝胺代谢及形成DNA加合物反应机理的理论研究

采用密度泛函理论,在B3LYP/6-31G**水平上,研究了气相和水溶剂中,α-羟基化吡咯烷亚硝胺(-αhydroxylation-NPYR,A)代谢为终致癌物重氮氢氧化物(B)、重氮烷阳离子(C)和氧离子(D),以及C与鸟嘌呤碱基相互作用的反应机理.化合物A代谢为终致癌物,涉及异构化和质子化过程,是相对容易进行的放热反应.终致癌物C与鸟嘌呤在N7位形成DNA加合物F和G的反应,遵循SN2机理.加合物G由F异构形成,且有相对高的异构化能(气相:244.77 kJ/mol;水溶剂中:234.83 kJ/mol),这与实验上得到加合物G是主要癌变物的结果一致.

DNA加合物的形成、诊断与污染暴露指示研究进展

随着人们对污染生态毒理效应认识水平的不断深入 ,DNA加合物的研究日益受到重视 .本文首先对DNA加合物的毒性机理与DNA加合物形成过程进行了分析 ;介绍了DNA加合物现有的诊断方法 ,包括色谱 质谱法、3 2 P 后标记法、免疫学法和荧光测定法 ;最后对DNA加合物的污染暴露指示进行了论述 ,指出DNA加合物作为有效的分子生物标记物是生态毒理学家用来预测污染物危害效应的警示信号 .

苯并(a)芘染毒致人支气管上皮细胞的周期改变及BPDE-DNA加合物形成

目的：通过观察苯并（a）芘（BaP）染毒致人支气管上皮细胞16HBE细胞周期改变及BPDE—DNA加合物形成的情况，探讨DNA损伤与细胞周期阻滞之间的关系。方法：用不同浓度BaP（0、1、2、4、8、16、32μmol／L）染毒16HBE细胞24h，用16μmol／LBaP染毒16HBE细胞不同时间（0、1、2、4、8、12、24h）以检测BaP染毒16HBE细胞的剂量和时间效应。再根据上述结果选择16μmol／LBaP染毒16HBE细胞4h后，恢复不同时间（0、1、2、4、8、12、24h），处理结束后采用流式细胞术检测细胞周期分布情况，酶联免疫法和荧光免疫组化法检测BPDE—DNA加合物表达。结果：与正常对照组相比，随着BaP染毒浓度和染毒时间的增加，s期细胞所占比例均增加（P〈0．05或P〈0．01）。16μmol／LBaP染毒16HBE细胞4h后，恢复早期（4～12h）S期细胞所占比例与恢复0h相比明显增加（P〈0．05），恢复24h时S期细胞所占比例（24．52％）与恢复0h相比明显降低（P〈0．01），而与正常对照组（26.41％）相比差异无统计学意义（P〉0．05）。随着染毒浓度增加和染毒时间延长，16HBE细胞内BPDE—DNA加合物含量逐渐增加，与正常对照组相比差异均有统计学意义（P〈0．01），染毒后恢复1h时BPDE—DNA加合物含量与恢复0h组相比显著增加（P〈0．01），而后随恢复时间延长逐渐下降。回归分析显示BaP染毒后细胞S期所占比例与BPDE—DNA加合物含量符合Cubic方程（R2=0．386，P=0．01）。结论：BaP染毒所致BPDE—DNA加合物的形成与S期阻滞密切相关。

反式二羟环氧苯并(a)芘-DNA加合物在肺癌发病中的作用

[目的]反式二羟环氧苯并 (a)芘 (BPDE)为苯并 (a)芘在体内的代谢产物 ,是一种直接的致癌物 ,可攻击DNA形成BPDE_DNA加合物 ,本研究目的为探明该加合物在人群肺癌发生中的作用及其分子机制。[方法]使用针对BPDE_DNA加合物的单克隆抗体 ,通过免疫学方法检测150例肺癌、120例癌旁肺组织、40例肺良性病变和40例正常肺组织中BPDE_DNA加合物的含量 ,同时检测相应肺组织中P53、C_MYC、K_ras、BCL_2、hTERT等癌变相关基因的表达 ,分析BPDE_DNA加合物与上述基因的关系。并在BPDE诱导的体外人气管上皮细胞癌变模型上检测癌变过程中BPDE_DNA加合物的变化。[结果]82.0 % (123/150)的肺癌组织 ,37.5 % (45/120)的癌旁肺组织 ,15.0% (6/40)的肺良性病变和2.5% (1/40)的正常肺组织可检出BPDE_DNA加合物 ,肺癌组织中加合物的含量显著高于其他肺组织 ,P<0.01。分层分析发现男性肺癌病例加合物检出率为89.9% (107/119)高于女性的检出率51.6 % (16/31) ,P<0.05。有吸烟史的肺癌患者加合物检出率为99.1% (113/114)高于非吸烟肺癌患者的27.8% (10/36),P<0.01。肺癌组织P53、K_ras、BCL_2基因的阳性表达与BPDE_DNA加合物有关联 ,而C_MYC、hTERT基因的表达与BPDE_DNA加合物无关联。在体外用BPDE作用于人气管上皮细胞系 ,可诱导?

2-硝基芴DNA加合物的研究

2-硝基芴直接与小牛胸腺DNA反应(in vitro),用^(32)P后标记方法能够测定出有多种DNA加合物生成.将定量的2-硝基芴一次注射入大鼠(SD)和经过Aroclor诱导的大鼠腹腔内,24h后取其肝、肾、肺、脾、血等诸器官,用P_1加强灵敏度的^(32)P后标记方法测定各组织中的DNA加合物.其结果是:在诱导和非诱导的大鼠体内各器官中均发现有DNA加合物的存在,Aroclor诱导对DNA加合物的生成有明显的促进作用.在非诱导的大鼠体内肝脏和血中,分别测出与体外反应相对应的多个DNA加合物,证明2-硝基芴有直接损伤生物体内DNA,形成DNA加合物的能力.

黄曲霉素B1-DNA加合物的实验研究

用３２Ｐ后标记的方法测小牛胸腺ＤＮＡ和黄曲霉素Ｂ１体外反应产物里的ＤＮＡＡＦＢ加合物，发现有４种不同的ＤＮＡ加合物，加合物含量的ＲＡＬ＝１０８（加合物）／１０７（正常核酸），对比用ＤＮＡ的４种碱基和ＡＦＢ１反应所形成的加合物，发现有３种ＤＮＡＡＦＢ１的加合物是来自鸟嘌呤碱基被修饰所形成的，占ＤＮＡ加合物总量的９０％．用定量的黄曲霉素Ｂ１腹腔注射入大白鼠中，２４ｈ取其肝、肾、肺、脾等组织，加合物的总含量分别是肝＞肾＞肺＞脾．用ＡＲＯＣＬＯＲ诱导能促进各组织中ＤＮＡ加合物的形成，但是对不同的组织有不同的促进作用．

^(32)P后标记法测DNA加合物

^(32)P后标记方法测DNA-致癌物的加合物(in vitro,in vivo,in human样品)过程是用小球菌核酸酶和脾核酸酶将DNA及加合物酶解成2’-脱氧核苷3’-单磷酸(3’-dNmP+3’-dxmP),以它为底物,用T_4多核苷酸激酶催化,使γ^(32)P ATP的放射^(32)P转移反应到底物上,形成2’-脱氧核苷3’5’-二磷酸(3’5’dNDP+3’5’dxDP),用ODS-TLC和PEI-TLC结合将标记过的二磷酸分离分辨,用自显影制成加合物的指纹图.液闪计数法计算出加合物浓度,灵敏度可达1加合物/10^(10)正常核酸.

肺癌和肺癌前病变组织中多环芳烃-DNA加合物的检测

目的苯并（a）芘等多环芳烃（PAHS）的代谢产物作用于DNA可形成多环芳烃-DNA（PAHS—DNA）加合物，由此导致细胞的恶变和肿瘤的发生。本研究是为了探明多环芳烃-DNA加合物在人类肺癌发生中的作用。方法通过免疫学方法检测108例肺癌患者手术标本、41例支气管黏膜上皮不典型增生组织及41例正常肺组织中该加合物的含量，并检测体外人气管上皮细胞癌变过程中多环芳烃-DNA加合物的动态变化。结果14．6％（6／41）的正常肺组织中可检测到多环芳烃-DNA加合物；70．7％（29／41）的支气管黏膜上皮不典型增生组织和84．3％（91／108）的肺癌组织中可检出多环芳烃-DNA加合物；组间差异有显著性意义，P〈0．001；且随着肺组织癌变过程的变化，多环芳烃-DNA加合物的检出率呈逐渐增高的趋势，P〈0．001。吸烟者该加合物检出率高于非吸烟者。苯并（a）芘的活性代谢产物BPDE可诱导人气管上皮细胞发生转化，多环芳烃-DNA加合物与细胞的转化、癌变过程相一致。结论多环芳烃-DNA加合物与肺的癌变过程密切相关，它是化学致癌过程中的一个早期可检测的生物标记物。

BPDE-DNA加合物体外生成实验研究

目的:探讨体外合成苯并(a)芘与DNA形成加合物的条件。方法:以一定比例混合苯并(a)芘丙酮溶液、DNA溶液、S9混合液、于37℃孵育24 h后,紫外分光光度计扫描DNA图谱,得出DNA结构改变的信息;同时用HPLC检测反应体系中的苯并(a)芘含量、苯并(a)芘代谢物及DNA加合物酸水解后的产物。确定BPDE-DNA加合物生成,质谱验证生成物的结构。结果:反应后DNA紫外最大吸收峰红移;HPLC检测发现孵育后反应体系中苯并(a)芘含量降低,反应管有新的物质生成;质谱分析生成物的分子量同于目标产物。结论:一定条件下体外可合成苯并(a)芘-DNA加合物。