人线粒体单链DNA结合蛋白1在恶性肿瘤发生、发展中的作用及研究进展

人线粒体单链DNA结合蛋白1(mitochondrial single-strand DNA-binding protein 1, mtSSBP1)是定位于线粒体中的单链DNA结合蛋白,参与线粒体DNA(mtDNA)的复制、转录和修复,在维持线粒体基因组的稳定性和功能等发挥重要作用。mtSSBP1与肿瘤细胞增殖、转移和侵袭等恶性生物学行为相关,在多种人类恶性肿瘤中表达上调,其与肿瘤组织浸润加深、分化能力减弱、肿瘤增大和临床分期增加均相关。该文现对mtSSBP1的结构、功能及其在不同类型恶性肿瘤中的作用机制进行阐述,旨在为mtSSBP1与肿瘤的基础研究和临床应用提供参考。

改良EMSA法分析人α1(Ⅰ)胶原基因序列特异性DNA结合蛋白

目的 :分析人α1( )胶原基因 5′侧翼区具有较高启动调控活性序列的 DNA结合蛋白。方法 :以原代培养人瘢痕皮肤成纤维细胞为胶原产生细胞 ,采用限制性内切酶消化、DNA混合片段末端标记和增强化学发光的改良电泳迁移率改变实验(EMSA)分析人 α1( )胶原基因 5′侧翼区 - 2 6 8～ + 42 bp序列 DNA结合蛋白。结果 :在胶原产生细胞——人瘢痕成纤维细胞中存在 α1( )胶原基因 - 2 6 8～ + 42 bp序列的 DNA结合蛋白 ,其结合活性具有特异性 ,并能被 Sp- 1,NF- 1,NF- κB识别序列所竞争。结论 :改良 EMSA法可用于分析较长序列的 DNA结合蛋白 ,人 α1( )胶原基因 - 2 6 8～ + 42 bp序列中存在转录因子Sp- 1,NF- 1,NF- κB结合序列 ,这些转录因子结合位点可能与人 α1( )胶原基因 - 2 6 8～ + 42 bp序列的高启动活性有关。

小鼠α2(Ⅰ)胶原基因DNA结合蛋白研究

目的 :初步分析小鼠α2 ( )胶原基因上游 5′- U TR近端 80 0 bp(- 780～ + 5 4bp)序列的 DNA结合蛋白。 方法 :PCR扩增小鼠α2 ( )胶原基因 - 2 5 8～ + 5 4bp,- 5 19～ - 2 48bp,- 741～ - 5 0 1bp片段 ,Dig- d U TP末端标记 PCR产物 ,与经 SDS- PAGE并转印至膜上的胶原产生细胞的核抽提物进行 DNA -蛋白质结合反应 ,以抗 Dig抗体检测结合反应信号。 结果 : 型胶原基因上游 5′- U TR近端 80 0 bp序列中存在至少 3个不同的核转录因子结合位点 ,相识别 (consensus)的核蛋白因子相对分子质量分别为 12万 ,5万 ,2万。TGF- β1可增强细胞中相对分子质量为 12万的核蛋白因子的表达。结论 :小鼠 α2( )胶原基因上游 - 780～ + 5 4bp这 80 0 bp片段中存在与不同的核蛋白因子结合的序列 ,可能与 Sp- 1有关。TGF- β1通过增强相对分子质量为 12万核蛋白的表达而促进该蛋白与靶调控序列的结合。

乙型和丙型肝炎病毒与肝细胞相互作用的分子生物学基础：启动子DNA结合蛋白研究策略

乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染肝细胞之后，首先要借助肝细胞中的一些成分完成其复制和表达的生活周期，主要是肝细胞中的一些调节蛋白与这2种肝炎病毒调节基因序列之间的结合，并对于肝炎病毒的复制和表达过程进行调节。

应用噬菌体展示技术筛选HBsAg启动子I的DNA结合蛋白

目的:通过筛选HBsAg基因启动子Ⅰ(SP Ⅰ,surface promoter Ⅰ)结合蛋白,为HBV复制机制的研究探索新的途径. 方法:应用噬菌体展示技术,以HBsAg基因启动子Ⅰ的聚合酶链反应(PCR)产物DNA作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“黏附-洗脱-扩增”筛选过程,经噬斑的PCR扩增后,构建克隆载体,最后对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性搜索. 结果:噬菌体经富集后,从随机筛选的14个克隆中得到8 个阳性克隆,成功构建了克隆载体.序列测定后经过同源性搜索,确定了和HBV表面抗原基因启动子Ⅰ特异结合的肝细胞蛋白,共编码7种蛋白.其中3个克隆编码未知功能蛋白;其余的克隆分别编码4-氨基丁酸氨基转移酶、触珠蛋白、复制蛋白等蛋白. 结论:用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到HBsAg基因启动子Ⅰ的结合蛋白,分析了该蛋白的编码基因.

鸡减蛋综合征病毒DNA结合蛋白的基因结构及同源分析

从中国发病鸡群中分离的鸡减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ）ＡＡ－２株，经常规方法提取其病毒核酸后，构建了限制性内切酶ＰｓｔⅠ及ＨｉｎｄⅢ水解片段的基因文库。对其中ＨｉｎｄⅢ－Ｆ片段（５２．９～５８．９ｍｕ）的正反２条链的序列测定发现，其反链存在１个编码容量为３８７个氨基酸（ａａ）的开放读码框架（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ，ＯＲＦ），经Ｇｅｎｅｂａｎｋ／ＥＭＢＬ同源搜寻后证实其编码产物为ＥＤＳＶ的ＤＮＡ结合蛋白（ＤＢＰ）。与其他腺病毒ＤＢＰ的氨基酸序列进行同源比较，其Ｎ端同源性在１９．０％～４６．２％之间，Ｃ端同源性在２７．７％～６０．４％之间。腺病毒ＤＢＰ的３个保守序列ＣＲ１，ＣＲ２，ＣＲ３在ＥＤＳＶＤＢＰ中有较大变化，但ＥＤＳＶＤＢＰ的锌指框架（Ｚｎ２＋ｆｉｎｇｅｒｍｏｔｉｆ）却保留了对其功能必需的残基。

大鼠骨骼肌肌质网序列非依赖性的DNA结合蛋白

目的：观察大鼠骨骼肌肌质网上是否存在非核ＤＮＡ结合蛋白。方法：应用差速离心及蔗糖密度梯度离心法分离大鼠骨骼肌肌质网膜蛋白，用３２Ｐ标记的ＤＮＡ进行Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ印记杂交。结果：在大鼠骨骼肌肌质网膜中存在两种ＤＮＡ结合蛋白，相对分子质量分别是８３０００、５８０００，这２种蛋白质可与不同的线状双链ＤＮＡ，环状ＤＮＡ及单链ＤＮＡ结合。

原位DNA结合蛋白显示技术的改进

目的 :探讨DNA结合蛋白定位技术的改进。方法 :以左旋咪唑 /酒精先消除细胞的内源性碱性磷酸酶(AP) ,再分别以DNase和RNase消除细胞内源性核酸 ,应用低盐浓度的杂交液预杂交后再加特异DNA的标记探针 ,以链霉亲和素SA AP中介 ,最终以四氮唑盐 /5溴 4 氯 3 吲哚磷酸 (NBT/BCIP)作为底物 ,37℃下显色。结果 :DBP阳性信号呈紫色细颗粒 ,主要定位于胞核。结论

8-Br-cAMP和槲皮素诱导Eca-109细胞p16基因启动子DNA结合蛋白的定位研究

目的 :探讨 8 Br cAMP和槲皮素 (quercetin)诱导的Eca 10 9细胞p16基因启动子特异性结合的序列特异性DNA结合蛋白 (DBP)的定位。方法 :应用DBP定位改进方法 ,以制备的特异性DNA探针检测目的DBP在细胞内的定位 ;以免疫细胞化学技术 ,检测细胞PCNA免疫反应性 ,作为肿瘤细胞恶性程度生物标志。结果 :DBP定位信号以胞核为主 ,胞质有阳性信号的细胞 ,胞膜也呈阳性信号 ;2实验组信号比对照组强 ;各组信号均以大细胞更强 ;PCNA免疫细胞化学阳性呈棕黄色颗粒 ,主要位于胞核 ,对照组强于实验组。各组均以大细胞阳性信号更强。结论 :2实验组与p16基因启动子结合的DBP主要位于胞核 ,但核外存在结合潜力的蛋白质。 2实验组PCNA免疫反应性均下降。提示这些与p16基因启动子区结合的DBP在一定程度上可诱导细胞恶性逆转化。

番茄丛矮病毒组(Tombusviruses)成员外壳蛋白是一种单双链DNA结合蛋白

应用South-western技术以番茄丛矮病毒组(tombusvirus)6种病毒为材料研究了它们的外壳蛋白对单双链DNA的结合作用。结果表明tombus-组6种病毒(PLCV,AMCV,CNV,CyRSV,PAMV,TBSV)的外壳蛋白及PLCV重组外壳蛋白是一种单双链DNA结合蛋白,对单链DNA的结合能力远远超过双链DNA。这种结合作用可能与在tombus一组病毒外壳蛋白立体空间结构有关,因为当蛋白变性时结合作用大大降低。另外,一旦外壳蛋白与单链DNA发生相互作用,用4moL/L尿素或0.1％SDS在90°C水浴中难以洗掉。Tombus一组病毒外壳蛋白这种对单双链DNA的结合作用可能表明它们是一种参与病毒体内运输或调节复制的蛋白。

非同位素法分析序列特异性DNA结合蛋白的三种方法

目的为在转录调控水平研究蛋白质异常表达机制,利用核转录因子与相应DNA调控序列特异结合的原理,非同位素法分析细胞内序列特异性DNA结合蛋白。方法凝胶滞留实验(EMSA)采用Dig-ddUTP末端标记DNA,核蛋白粗提或纯化产物与之液相结合后,PAGE分离核蛋白并转印至尼龙膜,化学发光法检测结果,Southwestern分析方法首先采用SDS-PAGE分离核蛋白粗提或纯化产物,蛋白转印至膜上后与Dig-dUTP末端标记的DNA杂交,酶免疫学检测结果,磁性DNA结合蛋白纯化法则将靶DNA与商品化磁性DNA粒子相连,用不同的连接、洗脱条件得到序列特异性靶DNA结合蛋白,银染显示核蛋白纯化结果。结果 EMSA中由于游离DNA与DNA-蛋白复合物有不同电泳迁移率,出现滞后DNA条带提示有识别该特定DNA序列的核蛋白存在,Southwestern分析除能提示核抽提物中有无可与DNA结合的核蛋白外,还提示其中核蛋白分子质量,核蛋白粗提物经磁性DNA亲和层析后DNA结合蛋白在银染时出现较纯的特异识别该DNA序列的核蛋白条带。结论 EMSA,Southwestern分析及磁性DNA层析是3种实用的研究DNA结合蛋白的方法,配伍应用具有简便、重复性好、敏感性和特异性高、无同位素污染等优点,是转录调控水平研究疾病相关基因异常表达的有效方法。

HBsAg基因启动子Ⅰ DNA结合蛋白1下调IL-18基因启动子

目的:研究HBsAg基因启动子I DNA结合蛋白1(SBP1)与白介素-18(IL-18)基因表达的关系,研究SBP1在HBV致病的分子生物学机制中的作用. 方法:构建质粒pcDNA3.1(-)-SBP1,pCAT3-IL-18,转染HepG2细胞进行表达,应用酶联免疫黏附法(ELISA)检测细胞中氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性. 结果:构建的表达载体pcDNA3.1(-)-SBP1经过序列分析和酶切鉴定正确.真核表达载体pcDNA3.1(-)-SBP1和pCAT3-IL-18P共转染的HepG2细胞的pCAT表达活性是pCAT3空载体的0.37倍,是转染pCAT3-IL-18P的0.17 倍,抑制率达到86.32%. 结论:SBP1可以下调IL-18启动子的活性,抑制IL-18基因的表达.

DNA结合蛋白在喉癌中的异常表达及其临床相关性

本文应用环状免疫单扩散法检测50例喉癌病人,25例正常人,17例声带息肉病人血清中DBP的异常表达。结果表示:大多数正常人血清中DBP呈均质性表达,声带息肉DBP异常表达率为35.3％,与正常人异常表达率28.0％相比无显著差异,喉癌病人DBP呈异质性表达,其异常表达率为74.0％,并通过与喉癌生物学行为之间关系的分析,说明DBP异常表达与喉癌的发生发展有密切关系,DBP的检测对喉癌的早期诊断及预后监测的参考价值。

染色质解旋酶DNA结合蛋白7表达与肝癌临床病理特征及预后的关系

目的通过研究肝癌组织内染色质解旋酶DNA结合蛋白7(CHD7)的表达及其与肝癌患者临床病理特征及预后的关系,探讨CHD7作为肝癌预后预测指标的可行性。方法将286例肝切除术后病理确诊为肝细胞肝癌的标本制作成组织芯片。采用免疫组化法检测肝癌及癌旁肝组织中CHD7的表达水平,分析其与肝癌患者临床病理特征及预后之间的关系。结果免疫组化结果显示CHD7在肝癌组织中表达明显高于对应的癌旁肝组织。CHD7高表达与肿瘤数目、肿瘤包膜完整性、肿瘤血管侵犯、TNM分期及BCLC分期密切相关,与肝癌患者术后总体生存率呈负相关,而与肝癌患者术后复发率呈正相关。结论 CHD7在肝癌中明显高表达,可作为肝癌患者预后的独立预测指标之一。

噬菌体展示技术筛选诱导型NOS基因启动子DNA结合蛋白的研究

目的筛选诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因启动子DNA结合蛋白,探索iNOS基因的表达调控机制。方法应用生物信息学方法确定iNOS基因启动子序列,以PCR扩增iNOS基因启动子DNA片段,构建真核报告载体pCAT3iNOSp,并转染HepG2细胞系,用ELISA法检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性以明确所得到的DNA片段具有启动子活性;以iNOS基因启动子片段作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“吸附洗脱扩增”富集过程,噬斑裂解液PCR扩增后,进行DNA序列分析和蛋白质同源性生物信息学搜索。结果pCAT3iNOSp瞬时转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCAT3Basic空载体的4.2倍,说明所得到的DNA片段具有启动子活性;噬菌体经富集后,筛选出12个阳性克隆,成功获得了iNOS基因启动子的DNA结合蛋白编码序列。结论所构建的iNOS基因启动子具有顺式激活下游基因表达的作用;筛选得到的iNOS启动子DNA结合蛋白对于研究iNOS基因的转录调节机制具有重要意义。

生物信息学方法在判断DNA结合蛋白质和预测结合位点中的应用

综述生物信息学方法在判断DNA结合蛋白质和预测结合位点中的应用研究进展。蛋白质与DNA间的相互作用是基因表达调控的分子生物学基础,因此DNA结合蛋白的判断以及DNA与蛋白质间作用位点的预测一直以来都是分子生物学和生物信息学的前沿领域。采用生物信息学方法进行这类判断和预测,具有省时、省力的特点,近年来吸引了众多科学家的关注。

TAR DNA结合蛋白43在肌萎缩侧索硬化症中致病机制的研究进展

肌萎缩侧索硬化症(ALS)是一种主要累及上、下运动神经元的神经系统退行性疾病。TAR DNA结合蛋白43(TDP-43)蛋白是大部分ALS患者中特征性的病理性聚集蛋白。TDP-43蛋白致ALS的机制尚不明确,可归纳为以下两种假说:"功能缺失"和"功能获得"。相关机制有:①TDP-43蛋白稳态与自噬密切相关;②TDP-43蛋白与RNA结合,干扰RNA代谢,并与应激颗粒的形成密切相关;③TDP-43蛋白聚集与线粒体功能障碍相互影响;④TDP-43蛋白异常聚集影响细胞骨架结构,致轴突运输异常,并引起神经肌肉肉接头功能障碍;⑤外泌体能降解胞浆TDP-43蛋白聚集并促进其在细胞之间的扩散等。本文就TDP-43蛋白致ALS的机制的最新进展做一综述。

抗辐射菌Deinococcus radiodurans的DNA结合蛋白的检测及分析(英文)

抗辐射菌Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ是微小球菌属的一种，它对电离辐射、紫外线及其他的化学诱变剂所诱导的ＤＮＡ损伤都具有极强的修复能力，故倍受放射生物学界的关注。本研究旨在检测抗辐射菌的 ＤＮＡ结合蛋白（ＤＮＡ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ； ＤＢＰ），并有选择地对其氨基酸序列加以分析，以进一步研究ＤＢＰ在抗辐射菌的辐射抗性中的作用和意义。主要研究方法：分离提取抗辐射苗染色体ＤＮＡ并用地高辛（ＤＩＧ）加以标记，作为探针；超声波破碎菌体，高速离心制备蛋白提取物， ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用于蛋白质电泳， Ｓｏｕｔｈ－ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ（碱性磷酸酶标记的酶联免疫技术） 检测 ＤＢＰ。结果表明，在野生型的抗辐射菌中，检测到了８种ＤＢＰ，分子量分别为１２２、９３、３３、２９、１６、１５、１４和１２ｋＤａ，其中９３ｋＤａ和 ３３ｋＤａ的两种 ＤＢＰ的表达水平随培养基和培养时间的变化而变化。 Ｎ－末端氨基酸序列测定表明，经 ＦＡＳＴＡ和 ＢＬＡＳＴ文库检索，这两种 ＤＢＰ和已知的其他蛋白质均没有同源性，即该两种 ＤＢＰ为新的蛋白质。由此得出结论，抗辐射菌的ＤＢＰ在数量上和氨基酸序列的结构上都与其他细菌不同。

蛋白印迹法人血清DNA结合蛋白的测定

利用蛋白印迹法(Western blot)原理建立了检测人血清DNA结合蛋白的一种较特异性方法,发现在成人血清中有7 种Lambda DNA结合蛋白,分子量为:90kDa、67kDa、43kDa、30kDa、24kDa、22kDa和17kDa。在婴儿血清中没有30kDa、24kDa和22kDa这3种LambdaDNA结合蛋白。在人的血清中有二种小牛胸腺DNA结合蛋白,分子量为:43kDa和17kDa。血清中有四种与正常成人血浆DNA结合的蛋白质,分子量分别为:67kDa、43kDa、30kDa和24kDa,其中30kDa的这种蛋白质与正常成人血浆DNA的结合力较弱,并在一些正常个体中未见到此带。

植物血凝素对大鼠周血淋巴细胞DNA结合蛋白的影响

应用原位杂交技术，对大鼠周血分离淋巴细胞以及植物血凝素（ＰＨＡ）刺激的转化淋巴细胞中的ＤＮＡ结合蛋白（ＤＢＰ）的变化，进行了研究。结果显示：①受ＰＨＡ刺激的淋巴细胞显示ＤＢＰ信号百分率显著升高；②受ＰＨＡ刺激的淋巴细胞核内显示ＤＢＰ信号的百分率显著升高，且多为淋巴母细胞；③细胞核外显示ＤＢＰ信号的淋巴细胞百分率在ＰＨＡ刺激后显著升高。提示：ＰＨＡ刺激对淋巴细胞核内、外ＤＢＰ的信号均有增高作用；ＤＢＰ可能参与淋巴细胞的母细胞转化以及细胞间遗传信息的传递。