野生型DNA聚合酶β转染Eca-109细胞后增变基因表型变化

目的:探讨野生型DNA聚合酶β(polbeta)转染人食管癌Eca-109细胞后对其增变基因表型的效应。方法:将经过鉴定的重组pcDNA3.1质粒(插入野生型,wt)-polbeta转染培养的人食管癌Eca-109细胞。将Eca-109细胞分为3组:转染实验组(E)、空质粒转染对照组(C1)和未转染对照组(C2)。应用原位杂交技术显示wt-polbeta和wt-p53的杂交信号,免疫细胞化学染色显示POLB-免疫反应性(IR)和多药耐受(MDR1)-IR,免疫印迹显示wt-polbeta和突变(mt)-polbeta的带型,细胞化学技术检测各组细胞的增殖与分化细胞的比率。结果:polbeta免疫印迹结果显示E组呈现增强的wt-polbeta主带,C1、C2组呈现很弱wt-polbeta主带和显著突变的(mt)-polbeta主带(P<0.01);polbeta免疫细胞化学结果显示E组的强信号定位于细胞核内,C1、C2组信号皆很弱(P<0.01)。E组的wt-polbeta及wt-p53原位杂交的信号强于C1、C2组(P<0.01)。E组MDR1的免疫反应性和增殖与分化细胞的比率低于C1、C2组(P<0.01)。结论:wt-polbeta转染的Eca-109细胞呈现wt-polbeta及wt-p53表达上调而mt-polbeta及MDR1表达下调的增变基因表型减弱。

食管癌高发区人食管癌组织中DNA聚合酶β基因突变检测

目的 :研究林州市食管癌高发区病例的食管癌组织中DNA聚合酶 β基因 (polβ)的突变情况。 方法 :利用PT PCR、SSCP和序列分析对食管癌高发区 5 0例食管癌及癌旁组织标本中polβ基因进行检测。 结果 :5 0例食管癌标本中有 2 2例 polβ发生变异 ,突变率为 4 4 % (2 2 /5 0 ) ;而癌旁组织仅 2例异常 ,突变率为 4 % (2 /5 0 )。突变形式有 :5 8bp(177位到 2 34位 )的基因片段缺失 ;375位A→G(Ile→Val) ,4 5 4位T→C(Phe→Ser) ,4 6 2位G→T(Glu→终止码 ) ,4 6 6位G→A(Gly→Glu) ,6 13位A→T(Lys→Ile) ,6 4 8位G→C(Gly→Arg) ,6 6 0位A→G(Arg→Gly)。结论 :食管癌高发区食管癌组织存在 polβ基因突变 ,且突变率较高 ;该酶基因突变可能与食管癌的发生。

全反式维甲酸对人食管癌细胞增殖及DNA聚合酶β表达的影响

目的 研究全反式维甲酸对人食管癌细胞诱导分化作用。方法 在体外细胞培养的基础上 ,观察细胞形态学的变化 ,细胞增殖动力学的变化。采用MTT比色法测定细胞增殖抑制率 ,免疫组化和westernblot方法检测DNA聚合酶 β(polβ)蛋白表达。结果 经全反式维甲酸处理后 ,人食管癌Eca10 9细胞的细胞形态趋向良性分化 ,细胞增殖指数明显降低。polβ表达降低。结论 全反式维甲酸对人食管癌Eca10 9细胞有诱导分化作用 ,其机理可能是抑制 polβ的表达 ,改变细胞的形态结构和生物学特性 。

脑胶质瘤组织中DNA聚合酶β基因突变检测

目的:研究人脑胶质瘤组织中DNA聚合酶β基因(polβ)的突变情况。方法:应用RT-PCR及SSCP检测22例脑胶质瘤、4例脑膜瘤、3例垂体瘤及1例肺部转移性鳞癌标本中polβ的表达,利用DNASIS、OMIGA软件及Chou&Fasman算法对扩增产物进行序列分析及蛋白质二、三级结构分析。结果:脑胶质瘤组织中DNApolβ突变率为6/22,共8个突变位点,2例发生504位A→G(131位Lys→Glu)、748位A→G(212位His→Arg)突变,2者蛋白质二级结构亦明显改变;598位T→C(162位Val→Ala)突变2例,但2者蛋白质二级结构无明显改变;2例Ⅲ级星形细胞瘤分别有2个和3个突变位点,但其各有1个相应的氨基酸未发生变异。Ⅱ级以下脑胶质瘤及脑膜瘤、垂体瘤等良性脑肿瘤组织均未发现DNApolβ基因突变。1例肺癌脑部转移性鳞状细胞癌DNApolβ基因出现5个突变位点,737位A→C(208位Pro未变异)、744位T→G(211位Lue→Val)、830位C→G(239位Cys→Trp)、866位A→C(251位Pro未变异)、870位A→C(253位Arg未变异),但蛋白质二级结构未改变。蛋白质三维结构图显示脑胶质瘤组织中6个氨基酸变异位点中,5个位于掌部,1个位于拇指部。结论:脑胶质瘤细胞中存在DNApolβ基因突变,且这些突变位点均为DNApolβ基因(尤其是掌部)活化结构域。提示脑胶质瘤的发生和发展可能与DNApolβ基因突变有关。

食管正常、癌前及癌变组织中DNA聚合酶βmRNA检测

目的:观察不同演进过程食管组织中DNA聚合酶β(polβ)mRNA的表达。方法:采用含有内对照的半定量RT-PCR方法,检测31例食管浸润癌(鳞癌27例,腺癌4例)、4例原位癌、6例不典型增生以及31例正常食管黏膜组织中polβmRNA的表达。结果:食管浸润癌、原位癌和不典型增生组织中polβmRNA的表达水平差异无统计学意义(P>0.05),但均高于正常食管黏膜组织中的表达水平(P均<0.05)。食管鳞癌和腺癌组织中polβmR-NA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结果:在食管癌组织中存在着polβ的高表达,且发生于癌变早期。

前列腺癌及良性增生组织中DNA聚合酶β基因突变检测

目的:研究前列腺癌(Pca)及良性前列腺增生(BPH)组织中DNA聚合酶β基因(polβ)的突变情况.方法:采用RT-PCR、DNA序列分析技术对12例Pca及20例BPH组织中的polβ进行检测,并利用DNASIS、OMIGA等软件分析测序数据.结果:Pca组织中polβ突变率为4/12,BPH组织中polβ突变率为1/20.突变形式如下:①点突变:325位A→G转换(71位Glu→Gly),721位A→G转换(203位Glu→Gly),768位C-→T转换(219位Gln→终止码),801位A→G转换(230位Lys→Glu),853位A→G转换(247位Glu→Gly),1071位A→G转换(320位Phe→Leu),177.188位CT→AA(22位Leu→Asn).②58 bp片段缺失(181～238位),导致移码及提前终止.结论:Pca组织中polβ的突变以点突变A→G转换为主要突变形式.181～238位的58 bp的大片段缺失系国内外首次发现的突变形式.DNA polβ突变可能与Pca的发生、发展密切相关.

人食管癌组织中DNA聚合酶β基因突变特点分析

目的 :探讨人食管癌DNA聚合酶beta (polβ)基因突变的特点。 方法 :对 75例人食管癌组织及 4例正常对照组织中提取总RNA ,进行RT PCR ,对PCR产物克隆后以Sanger’s法测序。结果 :人食管癌标本的polβ基因突变率 36 % (2 7/ 75 )。突变形式包括 :①A :G转换 ,突变频率为 6 6 .7% (18/ 2 7) ,375位的A→G (Ile→Val)、4 6 6位G→A(Gly→Glu)、6 6 0位A→G (Arg→Gly)、6 70位A→G(Glu→Gly)、74 0位A→G (Lys未改变 ) ;②T :C转换 ,突变频率 18.5 % (5 / 2 7) ,4 5 4位T→C(Phe→Ser)、6 6 5位T→C (Gly未改变 ) ;③G :T颠换 ,突变频率 18.5 % (5 / 2 7) ,4 6 2位G→T (Glu→提前终止于 116aa) ;④A :T颠换 ,突变频率 18.5 % (5 / 2 7) ,6 13位A→T(Lys→Ile)、737位A→T(Pro未改变 ) ;⑤G :C颠换 ,突变频率 7.4 % (2 / 2 7) ,6 4 8位G→C(Gly→Arg) ;⑥ 177～ 2 34位的 5 8bp缺失 ,移码及提前终止 ,突变频率为 37% (10 / 2 7)。结论 :人食管癌组织 polβ基因突变具有以下特点 :①标本突变率达 36 %(2 7/ 75 ) ;②有以A :G转换和G :T颠换为热点等多种突变形式 ;③ 2种提前终止可产生 2种截短的polβ蛋白 ,1种具有 116氨基酸长度 ;另一种 5 8bp的缺失者仅有 2

人食管癌组织DNA聚合酶β基因表达水平及定位

目的 :探讨人食管癌组织中DNA聚合酶 β基因 (polβ)表达水平及定位。 方法 :取 17例食管癌患者的癌组织、癌旁组织及其距癌灶 4～ 5cm处的正常组织。每块组织分 2等份 ,其中 1份常规石蜡包埋切片进行原位杂交 ,另 1份提取总RNA进行RNA斑点印迹 ,并以TLC扫描数值。结果 :蓝紫色杂交信号颗粒定位于胞质。弱信号见于正常组织的上皮基底细胞 ;癌旁组织的增殖细胞信号增强 ;癌组织分化较高的癌巢信号较弱 ;浸润的癌细胞信号强。原位杂交信号积分值与TLC扫描数值在癌、癌旁及正常组织中依次降低 (P <0 .0 5或P <0 .0 0 1)分别为 :癌组织 (32 .1± 7.8)和 (35 .8± 8.7) ,癌旁组织 (2 2 .1± 5 .3)和 (2 8.1± 6 .8) ,正常组织 (11.2± 2 .4 )和 (11.2± 2 .7)。结论 :人食管癌组织polβ基因呈高表达 ,DNA聚合酶 β较高表达可能是癌变早期事件。

DNA聚合酶β基因启动子在食管癌组织中的突变分析

目的:研究人食管癌组织、癌旁组织及其远端正常黏膜组织中DNA聚合酶β(DNA polymerase beta,polβ)基因启动子的突变情况.方法:采用聚合酶链反应(PCR)、DNA序列分析技术对25例食管癌患者手术切除的病变标本进行DNApolβ基因启动子序列检测,并利用DNASIS、OMIGA等软件分析测序数据.结果:25例中,食管癌组织、癌旁组织和正常黏膜组织中DNApolβ基因启动子发生突变者分别为8、6、5例,三组间突变率差异无统计学意义.在三组标本中共有35个突变点(癌组织包括18个突变点,癌旁组织包括9个突变点,正常黏膜组织8个突变点),25个点在polβ核心启动子区域,其中,-37位C→A突变出现8次;-65位G→T突变出现7次;29位T→C突变出现2次;-19位出现C的缺失和插入C突变各1次.结论:DNApolβ基因启动子突变可能与食管癌的发生和发展有关.

人食管癌顺铂耐药细胞系DNA聚合酶β的表达

目的:建立人食管癌顺铂(cDDP)耐药细胞系,测定耐药细胞系DNA聚合酶β(polβ)的表达。方法:以临床食管磷癌化疗用药的最低剂量换算终浓度,采用cDDP(10mg/L)反复间歇 24h暴露法作用于食管癌细胞系ECa -109,建立cDDP耐药细胞系ECa 109 /cDDP;MTT法测定药物敏感性,倒置显微镜下观察细胞形态变化,流式细胞仪检测细胞的周期分布,Westernblot测定细胞内DNApolβ表达水平。结果:与ECa- 109细胞比较,ECa -109 /cD DP细胞形态发生了改变,对cDDP的耐药指数为 1. 56;细胞周期发生了变化,S期细胞增多,G0 /G1 期细胞减少,细胞内DNApolβ表达水平增高(P<0. 05或 0. 01)。结论:ECa-109 /cDDP具有耐药表型,其耐药性产生可能与细胞内DNApolβ表达增高有关。

重组突变型DNA聚合酶β表达载体pcDNA3.1-polβ的构建

目的 :构建含突变型 polβ基因重组表达载体。 方法 :从食管癌标本中提取总RNA ,反转录合成cDNA ,克隆入 pCDNA3.1质粒。以通用鉴定引物PCR扩增、小量提取质粒酶切鉴定重组质粒 ,并进行测序。 结果 :测序结果证实重组载体中的外源片段序列与所选取的标本完全相符。结论 :成功构建了含突变型polβ基因重组表达载体 ,可应用于下游研究。

siRNA沉默DNA聚合酶β基因对胃癌BGC-823细胞增殖的影响

目的:观察siRNA沉默DNA聚合酶β(DNA polymerase β,polβ)基因后对胃癌BGC-823细胞增殖的影响。方法:用实时荧光定量PCR(real-time fluorogentic quantitative PCR,RFQ-PCR)和Western印迹法检测先前构建好的转染不同siRNA载体的各组细胞中polβ mRNA和蛋白质表达水平,用FCM法和裸鼠体内成瘤实验检测各组细胞的增殖情况。结果:转染polβ靶向siRNA的BGC-823细胞中polβ mRNA和蛋白质表达水平均明显降低,且siRNA载体pRNAT-U6.1-sipolβ2(抑制程度83%)的沉默抑制作用强于siRNA载体pRNAT-U6.1-sipolβ1(抑制程度56%);与无关siRNA对照组、空载体对照组和空白对照组相比,转染pRNAT-U6.1-sipolβ1组细胞的S期比例及细胞增殖速度明显下降,而转染pRNAT-U6.1-sipolβ2组细胞的S期比例以及细胞增殖则明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:DNA polβ高表达和近乎完全抑制的超低水平表达都不利于维持细胞的生理状态;BGC-823细胞中polβ表达通过siRNA沉默到合适的低水平,对肿瘤的生长可以起到抑制作用。

载体介导的人支气管上皮细胞DNA聚合酶β基因的靶向RNA干扰

目的运用载体介导的RNA干扰技术靶向抑制人DNA聚合酶β基因在支气管上皮细胞中的表达,为研究DNA聚合酶β在环境化学污染物所致DNA损伤修复中的功能和机制作准备。方法利用分子克隆技术构建含pU6启动子的人DNA聚合酶β基因RNA干扰特异性绿色荧光蛋白C1载体重组子“pEGFP-C1-U6-dsRNA”;以脂质体法将载体重组子转染人支气管上皮细胞,同时以空白细胞和空载体转染细胞作对照;在经G418筛选后,以荧光显微成像技术观察细胞的转染效果,以蛋白印迹法分析转染后细胞中的DNA聚合酶β表达情况。结果在转染重组子的细胞中,DNA聚合酶β的表达明显下调,仅相当于正常细胞的17·3%。结论人支气管上皮细胞DNA聚合酶β基因的靶向抑制成功。

互隔交链孢酚通过PKA-CREB信号通路激活NIH3T3细胞中DNA聚合酶β表达

目的:探讨互隔交链孢酚(AOH)诱导小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3中DNA聚合酶β(DNA polβ)表达增高的分子信号通路。方法:①15μmol/L AOH作用NIH3T3细胞16 h,利用Western blotting方法检测细胞中DNA polβ的表达,并利用磷酸化CREB抗体检测AOH作用后NIH3T3细胞中CREB信号分子是否被激活。②利用PKA-CREB信号通路特异性抑制剂H89预处理NIH3T3细胞1 h,再加入AOH作用,分别检测磷酸化CREB和DNA polβ表达的变化。结果:①与溶剂对照组相比,AOH诱导NIH3T3细胞中DNA polβ表达明显增高,而且磷酸化CREB蛋白含量也明显增加,差异均显著。②用PKA特异性抑制剂H89预处理,可部分抑制NIH3T3细胞中CREB蛋白的磷酸化,并且降低了AOH引起的NIH3T3细胞中DNA polβ的表达增加。结论:PKA-CREB信号通路在AOH诱导的NIH3T3细胞中DNA polβ表达起重要作用。

卵巢癌组织中DNA聚合酶β检测

目的观察不同演进过程卵巢组织中DNA聚合酶β(po1β)mRNA的表达。方法采用含有内对照的半定量RT-PCR方法,检测41例卵巢癌患者(其中浆液性囊腺癌21例,黏液性囊腺癌13例,子宫内膜样癌7例)及正常卵巢组织31例pol βmRNA的表达。结果浆液性囊腺癌、黏液性囊腺癌、子宫内膜样癌pol βmRNA含量差异无显著性,但均高于正常卵巢组织中的表达水平(均P<0.05)。组织学分级中2级、3级DNApol βmRNA的相对表达量明显高于1级(均P<0.05),临床分期FIGOⅢ期、Ⅳ期DNA pol βmRNA的相对表达量明显高于Ⅰ期、Ⅱ期(均P<0.05)。结论在卵巢癌组织中存在着po1β的高表达,肿瘤分化程度越低以及临床分期越高其表达量越高。

人食管癌组织中DNA聚合酶β与XRCC1表达的相关性

目的 :观察XRCC1及DNA聚合酶 β(POLB)在人食管癌、癌旁及相邻的正常组织内的表达。方法 :应用免疫组化方法对 17例食管癌患者的癌组织、癌旁组织及相邻的正常组织中POLB和XRCC1的免疫反应性 (IR)进行定位及表达水平的比较。结果 :POLB IR和XRCC1 IR在癌组织、癌旁组织及正常组织中依次减弱 (P <0 .0 1或P <0 .0 0 1) ,2者在上述组织中定位相似 ,且表达呈显著正相关 (P <0 .0 1)。结论 :POLB和XRCC1在癌旁组织表达的相对提高可能为癌变的早期事件 ;2者表达的定位近似 ,提示 2者在形态和功能上密切相关。

DNA聚合酶β对细胞生物学特性及DNA损伤的影响

目的探讨DNA聚合酶β(polβ)的表达水平对细胞的生物学特性及重铬酸钾诱导的DNA损伤效应的影响。方法以polβ野生型(polβ+/+)、polβ缺陷型(polβ-/-)及polβ高表达型(polβoe)小鼠胚胎成纤维细胞为研究对象,采用四氮唑盐比色法绘制3种细胞的生长曲线;群体倍增实验观察3种细胞的倍增时间;HGPRT基因突变实验检测细胞的自发突变频率;同时用单细胞凝胶电泳实验分析3种细胞的自发DNA损伤和重铬酸钾诱导的DNA损伤效应的差异。结果 3种细胞生长曲线和群体倍增时间基本一致,细胞自发突变频率和自发DNA损伤差异也无统计学意义(P>0.05);随着重铬酸钾浓度的增加,3种细胞的拖尾率和尾长均增加,在相同重铬酸钾染毒浓度下polβ缺陷型细胞的DNA损伤明显大于polβ野生型和高表达型细胞,且以polβ高表达型细胞的DNA损伤效应最弱。结论 polβ表达水平对细胞的生长特征无明显影响,也不会造成细胞自发突变的增加;polβ基因缺陷使细胞对重铬酸钾诱导的DNA损伤更敏感,而高表达则对DNA损伤具有一定保护作用。

人DNA聚合酶β基因靶向RNA干扰重组子克隆及序列分析

目的克隆用于人DNA聚合酶β(DNApolymerasebeta,Polβ)基因靶向RNA干扰的双链RNA(doublestrandRNA,dsRNA)寡核苷酸绿色荧光蛋白C1载体重组子“pEGFPC1pU6dsRNA”,为进一步研究人Polβ基因在环境化学污染物所致的DNA损伤修复中的作用机制作准备。方法依据Genbank中人polβ基因的cDNA序列,运用dsRNAoligonucleotidedesigner设计出用于RNA干扰用的dsRNA寡核苷酸序列,并以化学方法合成之。通过重组DNA技术将合成好的dsRNA克隆到含人pU6启动子的pSIRENRetroQ逆转录病毒载体上,以此重组子转化感受态E.coliDH5α,经氨卞青霉素筛选后进行扩增,并抽提质粒。运用EcoRⅠ和BglⅡ消化并回收“pU6dsRNA”目的片段,再将“pU6dsRNA”亚克隆到pEGFPC1上,获“pEGFPC1pU6dsRNA”重组子,并进行酶切鉴定和序列分析。结果经酶切鉴定发现,“pEGFPC1pU6dsRNA”载体重组子处于预期条带位置,序列分析显示与所设计的目的片段序列完全相符。结论作者克隆了用于人Polβ基因靶向RNA干扰的dsRNA绿色荧光蛋白C1载体重组子“pEGFPC1pU6dsRNA”,为进一步研究Polβ基因功能作好了准备。

鼻咽癌组织中DNA聚合酶β基因的突变

目的研究鼻咽癌中是否存在DNA聚合酶β(DNA poly meraseβ,polβ)的突变及变异情况。方法采用RT-PCR法(逆转录-DNA聚合酶链反应)、PCR-SSCP(聚合酶链-单链构象多态性分析)、DNA序列分析法对26例鼻咽癌组织进行polβ基因突变研究。结果鼻咽癌组织中存在polβ基因突变,且基因突变率与癌组织的病理分级有关,高分化(G1)、中度分化(G2)、低分化及未分化(G3)鼻咽癌组织中polβ基因突变率分别为12.5%(2/16)、21.4%(3/14)、80%(8/10)。G1与G2比较,差异无统计学意义(P>0.01),G1与G3、G2与G3比较,差异均有统计学意义(P<0.005)。测序结果表明,polβ基因的第454位核苷酸由T变为C,其氨基酸变异为第114位氨基酸由Phe变为Ser;第466位核苷酸由G变为A,其氨基酸变异为第118位氨基酸由Gly变为Glu;第148位核苷酸由A变为G,其氨基酸变异为第28位氨基酸由Asn变为Ser。结论发现在鼻咽癌组织中存在多种形式的polβ突变,导致氨基酸序列、空间结构的改变,可能与鼻咽癌的发生、发展相关。

互隔交链孢酚对NIH/3T3细胞中DNA聚合酶β的致突变作用

背景:近年来研究发现食管癌细胞中存在DNA聚合酶β的突变。目的:观察互隔交链孢酚对NIH/3T3细胞中DNA聚合酶β基因序列的影响,研究互隔交链孢酚致细胞变异的机制。方法:用不同浓度(2,4,6,8μmol/L)的互隔交链孢酚作用于NIH/3T3细胞,并设置对照组。用RT-PCR法从细胞总RNA中扩增出DNA聚合酶β基因cDNA序列,应用T-A克隆技术,克隆至pGEM-T载体后进行测序,分析其序列变化。结果与结论:2μmol/L互隔交链孢酚处理后的细胞内DNA聚合酶β基因序列无任何变化。而4μmol/L组中DNA聚合酶β基因有1个位点发生突变,8μmol/L组和16μmol/L组中各有2个位点发生突变,此3组的突变存在相同的位点。结果证实,互隔交链孢酚可导致NIH/3T3细胞中的DNA聚合酶β发生点突变,互隔交链孢酚浓度越高,点突变的数量越多,且存在突变活跃位点。