枳DREB基因家族的鉴定及其对非生物胁迫的响应

为了解枳(Poncirus trifoliata)DREB基因家族参与非生物胁迫的调控机制,基于枳基因组数据,利用生物信息学方法对枳DREB基因家族成员(PtrDREB)进行全基因组鉴定,讨论PtrDREB各基因的物种进化关系及各基因在不同组织中的表达模式,并用qRT-PCR技术检测9个PtrDREB家族成员在非生物胁迫处理下的相对表达量。结果表明,从枳基因组中共鉴定出48个DREB成员,不均匀地分布在9条染色体上,这些DREB成员编码的蛋白质氨基酸序列长度范围为144~639 aa,相对分子量范围为15 638.35~76 776.34 u,等电点的范围为4.72~9.62,均为亲水性蛋白;34个PtrDREB亚细胞定位于细胞核中;48个PtrDREB基因分为5个亚族;DREB基因的启动子顺式作用元件含有大量光响应、植物激素、非生物胁迫及植物生长发育响应元件;DREB基因家族在不同组织中的表达具有明显差异,在根、果实、叶片、胚珠、种子和幼芽中高表达的基因数目分别为17、13、4、4、6、8个;qRT-PCR数据表明,在经过低温、高温和干旱处理后,9个PtrDREB基因中分别有8、6、1个基因上调表达,上调幅度分别为1.27~5.85、1.44~2.05、2.06倍,因此推测PtrDREB家族成员在非生物胁迫中可能发挥重要的调控作用。

外源脱水应答转录因子DREB基因在转基因小麦中的诱导型表达与抗干旱生理效果研究(英文)

以冬小麦品种 8901、5-98、99-92和 104等品种的幼穗和幼胚为材料,用基因枪转化含逆境诱导转录因子 DREB 和bar 基因的质粒 pBAC128F(7 024 bp)。经筛选与植株再生,共获得 70 多个转基因小麦植株及其后代株系。转基因株系经PCR 分析和 RNA 点杂交检测,结果表明外源转录因子 DREB 基因已稳定整合到转基因植株及其后代株系中,并且在部分后代株系中获得了表达。叶片脯氨酸含量测定表明,有 16 个转基因株系的脯氨酸含量与非转基因对照相比,增加相当显著,其中10个株系的脯氨酸含量在1 100 μg/g以上,比对照提高了2倍多。室内抗旱模拟实验表明,转基因株系停止浇水15 d 后,叶片仍然表现绿色,而对照叶片则失绿、枯干;复水 10 d 后,转基因株系恢复活力,对照则死亡。研究表明,利用逆境诱导型启动子(rd29B)来增强外源DREB基因的表达,能显著改良小麦的抗旱性。

DREB基因双T-DNA植物表达载体的构建及验证

W 34基因经 pGEM T EASY载体 ,克隆到 pBDREB载体EcoRI位点 ,得到在Amp平板上生长的转化子 pBW 34-DREB质粒 ;质粒pBW 34-DREB、pSPROK、pBlueks分别经PstI/KpnI、KpnI/EcoRI、PstI/EcoRI双酶切 ,三片段连接构建成中间表达载体 pBWD Tnos;再用SmaI/EcoRV双酶切 pBWD Tnos,将回收的DREB基因的完整的表达结构元插入到经SmaI酶切的质粒载体 pCDMAR Hyg中 ,构建成双T DNA植物表达载体 pCDMAR pWDT Hyg ,大小为 13 5 9kb ,经酶切鉴定 ,证明构建的载体与预期设计的一致。将此双T载体用农杆菌介导法转化玉米胚性愈伤组织 ,期望得到无选择标记的安全的转基因植物。

可去除选择标记的DREB基因双T-DNA载体共转化玉米

通过体外重组构建双T-DNA双元载体pCDMARpWDT-Hyg,选择标记基因hpt(hygromycin phospho-transferase)和抗逆转录因子基因DREB分别位于两个独立的T-DNA。用农杆菌介导法转化玉米胚性愈伤组织,通过在抗性培养基上严格筛选,在获得的再生转化植株中,同时整合hpt基因和DREB基因的共转化率达到26·3%。该转化系统的建立为下一步得到无选择标记的转基因植株奠定基础。此外,本实验还通过gus基因的瞬时表达分析了农杆菌转化玉米的影响因素。

转DREB基因烟草悬浮细胞系(BY-2)的建立及其几个与抗盐和抗渗透胁迫相关指标的检测

用基因枪法将DREB基因和诱导型启动子rd29B构建的载体pBAC128F转入烟草悬浮细胞。通过除草剂抗性筛选、PCR和PCR-Southern检测,获得转DREB基因的细胞系。以300mmol·L-1NaCl和15%PEG6000处理14d后,转基因细胞系存活并生长,而野生型则接近死亡。转基因细胞系的脯氨酸含量和超氧物歧化酶活性普遍高于野生型的,而丙二醛含量则相反。

荧光实时定量PCR检测紫花苜蓿DREB基因的方法

建立一种简便、快速、有效的检测紫花苜蓿DREB基因表达水平的荧光实时定量PCR方法.优化检测DREB基因的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测体系.运用建立的优化体系检测了低温处理后紫花苜蓿DREB基因表达情况.

小麦DREB基因的克隆及植物表达载体构建

脱水应答元件结合蛋白在高等植物应答干旱、高盐和低温胁迫中发挥重要的作用。根据GenBank中小麦(Triticum aestivum L.)DREB基因的cDNA序列设计引物,采用RT-PCR技术从小麦中克隆了DREB基因837 bp的编码区。为进一步研究小麦DREB基因的功能,以pMD18-T-DREB质粒为模板,PCR扩增DREB基因片段,构建了该基因的植物表达载体。经菌液PCR和测序鉴定后,转化到农杆菌LBA4404中,为通过转基因技术深入研究小麦DREB基因的功能奠定了基础。

小麦DREB基因的电子克隆及生物信息学分析

为获得小麦中的DREB转录因子基因,运用电子克隆的方法,以拟南芥NP_195489序列为探针,获得小麦DREB的cDNA全长序列。采用生物信息学方法,对该基因编码蛋白的基本特征、高级结构及功能域等进行预测和分析。结果表明:该基因全长2 008bp,包含1个639bp的完整开放性阅读框,编码212个氨基酸,该基因编码蛋白定位于细胞核,为可溶性蛋白,含有多个AP2保守功能域。在小麦幼穗、幼苗、花药、种子、根、叶片和花冠中为组成型表达,其中在根和叶片中的表达量比其他组织类型中表达量高。

干旱胁迫条件下转LbDREB基因大青杨瞬时基因表达及生长、生理指标变异分析

利用转基因技术培育杨树抗逆品种是林木分子育种的重要手段之一。本研究以3个转Lb DREB基因株系大青杨及野生型WT为材料,利用PEG6000模拟干旱胁迫处理,调查胁迫条件下不同株系生长、瞬时Lb DREB基因表达量和生化指标的变化。结果表明:随着PEG胁迫时间的增加,转基因大青杨较WT的生物量向根部分配更多;Lb DREB基因表达量与SOD,POD变化趋势相近,呈现先上升后下降再上升的趋势;转基因株系较WT保护酶活性更强,脯氨酸含量积累增多,MDA积累降低,WT相对电导率比各转基因株系高;结果表明各转Lb DREB基因株系的抗旱能力均优于WT,且Lb DREB基因上调表达可能是调控植物抗旱能力的重要因素。转基因株系Dr2在干旱胁迫下各抗旱指标均表现优秀,可以初步筛选为大青杨抗旱优良无性系。

海岛棉DREB基因的克隆及植物表达载体的构建

根据GenBank上公布的棉花GhDREB1基因序列设计特异性引物,从海岛棉中克隆了一个与DREB类基因同源的cDNA序列,命名为XHDREB。序列分析表明,该cDNA序列长度为651 bp,推测含有216个氨基酸,分子量为24.6 kDa,等电点为9.46。同源性分析表明,它与GhDREB1的氨基酸序列同源性为85.19%。所编码蛋白具备DREB1转录因子的特征:含有58个氨基酸组成的AP2 DNA结合域以及两个DREB1/CBF特征氨基酸序列PKKRAGRKKFRETR和DSAWR。然后将XHDREB基因连接到pCAMBIA2300-35SOCS质粒上,构建了植物表达载体。

沙鞭PvDREB基因克隆与表达特异性分析

基于沙鞭的三代转录组数据,该研究利用PCR技术克隆DREB基因,并对其进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR分析该基因的表达模式以及在20%PEG-6000模拟干旱胁迫处理下的表达特征,以探讨干旱胁迫下沙鞭DREB转录因子的功能和作用,为揭示PvDREB基因响应沙鞭的耐旱分子机制奠定基础。结果表明:(1)成功克隆获得一个沙鞭DREB基因,命名为PvDREB;PvDREB基因编码区长度831 bp、编码276个氨基酸,含有典型的AP2转录因子保守结构域;PvDREB蛋白是亲水性蛋白,不具有信号肽结构,存在跨膜结构和可能的糖基化及磷酸化位点。(2)系统进化分析显示,PvDREB基因与毛竹的DREB亲缘关系较近。(3)亚细胞定位预测表明,PvDREB蛋白定位于线粒体和细胞核中。(4)qRT-PCR显示,沙鞭根、茎和叶中PvDREB均可诱导表达但差异较大,且在茎中表达量最高,叶中次之,根中最低,具有明显的组织特异性;20%PEG-6000模拟干旱下,PvDREB基因在叶中的表达量随干旱胁迫时间增加而增加,12 h时达到最高,之后逐渐下降。研究推测,沙鞭PvDREB基因受干旱胁迫诱导表达,且该基因可能在沙鞭响应干旱胁迫的过程中起重要作用。

小麦苗期盐胁迫下DREB基因的表达

为了从全基因组和转录组水平鉴定响应盐胁迫的小麦DREB(dehydration responsive element binding,DREB)基因,该研究对小麦耐盐材料CH7034苗期施加盐胁迫后的根部样本进行Illumina转录组测序,从中分离TaDREB家族成员的表达数据和可变剪接信息,并对其下游靶基因进行预测;利用qRT-PCR对盐胁迫响应TaDREB成员和预测靶基因进行验证。结果显示:(1)从小麦中共鉴定出48个DREB成员(204个拷贝序列),命名为TaDREB1~TaDREB48,分布于21条染色体。(2)TaDREB家族分为14组(G1~G14),位于G2、G5、G10和G14的TaDREB成员受NaCl胁迫后转录水平均无显著变化,其余组中共有25个(52%)TaDREB成员表现出对盐胁迫不同程度的响应;其中有9个成员在盐胁迫后持续上调(含5个新报道基因),有2个成员表现为持续下调;蛋白互作预测结果显示,下调成员TaDREB35的编码蛋白可能会受到1个小麦RING型E3泛素连接酶作用而降解。(3)盐胁迫后有9个成员TaDREB3、TaDREB6、TaDREB16、TaDREB19、TaDREB21、TaDREB24、TaDREB25.12、TaDREB43和TaDREB47发生了可变剪切变化。(4)从转录组差异表达基因中进一步鉴定出3个起始密码子上游2000 bp序列,包含DRE/CRT元件且在A/B/D组间表达趋势一致的候选靶基因TaRD29、TaGLOS和TaCKX。(5)qRT-PCR验证结果显示,上调成员中,除TaDREB19外,其余成员以及TaDREB16均表现出持续上升的趋势;下调成员中只有TaDREB25和TaDREB35的表达量呈持续下降的趋势;3个预测靶基因的表达量均持续上升,验证结果与转录组测序结果一致。该研究鉴定出的11个盐胁迫响应TaDREB成员以及预测的3个下游靶基因为小麦耐盐机制解析和分子育种奠定了基础。

白腊DREB基因克隆中简并引物的设计

根据拟南芥DREB2A基因序列进行GenBank内Blastx序列同源性查询;对其中同源性较高的25个氨基酸序列进行了分析,设计简并引物,应用RT-PCR技术克隆白腊DREB2A基因,得到长2473bp、与拟南芥DREB2A同源性为96.94%的基因片段,并在GenBank登记,注册号为AY536056。

小麦DREB基因的表达特征分析

[目的]对新春6号小麦的抗旱DREB基因进行表达特征分析。[方法]在干旱逆境胁迫下,考察不同胁迫处理时间下新春6号小麦中DREB基因的表达情况,分析该基因对小麦抗逆性的影响。[结果]小麦的抗旱DREB基因受干旱胁迫诱导,与对照相比,在小麦干旱胁迫12 h后表达量上升。[结论]小麦的抗旱DREB基因可能参与小麦对干旱胁迫的应答,为研究小麦的抗旱分子机理提供了依据。

黑龙江省青年科学技术专项资金项目《拟南芥DREB基因对百合的遗传转化及抗渗透胁迫转基因植株的筛选》通过验收

由樊金萍主持的黑龙江省青年科学技术专项资金项目《拟南芥DREB基因对百合的遗传转化及抗渗透胁迫转基因植株的筛选》按照预期计划圆满完成。取得的主要研究成果摘要如下：1．构建分别由E12启动子和rd29A启动子调控的DREB1A和DREB2A的高效植物表达载体4个；2．建立东方百合的高频植株再生体系和农杆菌介导的遗传转化体系；

转大豆GmDREB基因增强小麦的耐旱及耐盐性

DREB(dehydrationresponsiveelementbinding)转录因子通过调控下游多个抗逆相关基因表达,有效提高植物的抗逆性.利用酵母单杂交技术从大豆(Glycinemax)品种吉农27的cDNA表达文库中克隆了一个新的GmDREB基因.该基因编码174个氨基酸,具有一个由58个氨基酸组成的AP2/EREBP保守域,其中第14与第19位保守氨基酸分别是缬氨酸(V)与谷氨酸(E),在N末端和C末端分别有一个核定位信号区和转录激活区.利用玉米组成型启动子Ubiquitin和拟南芥诱导型启动子rd29A构建了植物表达载体,通过基因枪转化小麦品种鲁麦22号,获得103株T0代再生植株,通过PCR检测,分别获得含Ubi::GmDREB和rd29A::GmDREB的转基因植株13株和11株.T1代经过PCR,Southernblot,RT-PCR检测,证明GmDREB基因已经整合到小麦基因组中,并在转录水平上表达.携带Ubi::GmDREB或rd29A::GmDREB转基因株系的T1代植株苗期耐旱或耐盐性鉴定表明,转基因小麦植株的耐旱或耐盐能力明显提高,说明GmDREB基因在2种不同启动子驱动下均能有效提高转基因小麦的耐盐、耐旱性.

梨DREB基因家族全基因组鉴定及分析

本研究为鉴定梨DREB基因,分析其生理特性和结构,并研究DREB蛋白的相互作用以及在不同逆境中的表达差异,通过生物信息学方法,对梨DREB转录因子进行了鉴定与分析。如利用本地BLAST、Pfam等搜索、鉴定DREB蛋白;采用Protparam、Signal P、SPOMA、MEME数据库、DNAMAN、MEGA6.0等对蛋白进行结构特性和进化关系分析;基于String数据库对DREB蛋白进行功能互作分析;并运用拟南芥Illumia RNA-Seq数据进行同源表达分析。从梨全基因组中鉴定了60个DREB基因,通过与拟南芥DREB基因聚类分析,共分为6个亚组（A1-A6）。编码的氨基酸残基数在99-496个之间,平均含有250个氨基酸残基,整体呈弱酸性。系统分析了Pbr DREBs蛋白的保守基序和基因结构,发现这些Pbr DREBs蛋白都含有一个典型的AP2/ERF结构域,这个结构域含有55个左右的氨基酸残基,大部分以YRG保守元件开始,到RAYD保守元件终止。对Pbr DREBs蛋白之间的功能联系网络进行了系统的研究,发现DREB转录因子在梨的生长发育过程及其多种逆境反应的信号转导中发挥着重要作用,且在逆境调控中各亚组成员之间也可能存在交叉作用,其中,A1亚组即CBF转录因子在蛋白质相互调控中起重要作用。并利用同源拟南芥RNASeq数据对Pbr DREBs蛋白进行了低温、干旱等非生物胁迫下的同源分析,表明DREB蛋白在多种胁迫中都起到了重要作用。初步鉴定出的梨60个DREB基因在功能、结构、特性等方面与拟南芥及其它已报道的物种DREB基因相似,并在低温、干旱等逆境中起到重要作用。

二色补血草LbDREB基因在酵母中的抗逆性分析

利用酵母表达系统研究了二色补血草的DREB基因(LbDREB)对不同胁迫的抗性。将LbDREB构建到酵母表达载体pYES2中,转化到酿酒酵母INVSc1菌株中,并以转空pYES2质粒的酵母INVSc1(pYES2)作为对照,通过比较两种酵母在不同胁迫下的存活率来研究LbDREB基因对NaCl、KH_2PO_4、Na_2CO_3、NaHCO_3、低温、干旱、CuSO_4和CdCl_2胁迫的抗性。结果表明,LbDREB转化的酵母在各种胁迫下的存活率均明显高于转空pYES2的对照酵母,说明LbDREB基因除了具有传统认为的抗旱、耐盐、抗寒的作用外,还具有抗KH_2PO_4、Na_2CO_3、NaHCO_3、CuSO_4和CdCl_2等胁迫的能力。

南林895杨抗旱耐盐基因DREB1C的转化

以美洲黑杨杂种优良无性系南林895杨为转基因受体材料,利用农杆菌介导法转化与逆境胁迫相关的DREB1C基因。经潮霉素筛选,共获得80株抗性植株,经PCR及RT-PCR检测有30株抗性植株呈阳性,初步证明DREB1C基因已整合到南林895杨基因组中。抗性试验结果初步表明,转基因植株的抗旱、耐盐性均有所提高。

DREB2A基因对苜蓿遗传转化的研究

以黑龙江紫花苜蓿Medicago sativa主栽品种:肇东苜蓿、敖汉苜蓿、公农1号和公农2号为受体材料,系统地探讨了除菌剂种类和浓度以及卡那霉素筛选浓度等,建立了高效的苜蓿再生体系和遗传转化体系;分别构建了由诱导型启动子rd29A和组成型启动子E12调控的DREB2A基因的2个植物表达载体pB2A29A和pB2AE12;采用农杆菌介导法进行遗传转化,获得大量转基因抗性植株并进行了分子生物学(PCR和Southern blot)检测。结果表明,DREB2A基因已整合到苜蓿基因组中。