野生稻CBF/DREB1转录因子的鉴定与生物信息学分析

低温冷害是限制栽培稻地域分布和产量的重要因素之一,严重影响我国的粮食安全。以CBF/DREB1为核心的C-重复结合因子-冷调节基因(CBF-COR)途径是水稻适应低温的重要信号传导途径。基于稻属9种植物的全基因测序结果和隐马尔可夫模型(HMM)搜索,共鉴定出71个CBF/DREB1基因序列。所有基因均无内含子,由单个外显子组成。大部分DREB1s呈弱酸性,所有DREB1s亲水性平均值<0。进化树分析进一步将其分为3个组:DREB1A/1B/1H、DREB1C/1E/1F/1G和DREB1D/1I/1J,各组成员除AP2保守结构域和侧翼序列外,其他保守基序组成差别较大。适应性进化分析粳亚种和其他水稻的直系同源基因对,发现OsDREB1A/ObDREB1A、OsDREB1D/OnDREB1D、OsDREB1I/OsIDREB1I和OsDREB1J/OsIDREB1J四对基因非同义替换/同义替换(Ka/Ks)值均>1,受到正选择压力。旁系同源基因之间启动子顺式元件种类和数量差异较大,直系同源基因的启动子顺式元件种类和数量很相似。对日本晴、93-11和东乡野生稻7 d幼苗4℃冷处理2 h的实时荧光定量PCR分析发现早期冷响应基因可分为激活型(DREB1A/1B/1C/1E/1F/1G/1H)和抑制型(DREB1D/1I/1J)。在日本晴、93-11和东乡野生稻冷激活型基因中,DREB1B/1G/1H均是冷处理后响应最快的一级冷响应因子,且启动子均含有至少一个拷贝的CAMTA转录因子结合元件CM2(CCGCGT)。OrDREB1B/1C/1E/1F/1G/1H在东乡野生稻4℃冷处理4 h后的表达量均高于栽培稻同源基因的表达量。9种稻属植物的CBF/DREB1基因亚家族的分子进化分析结果为低温抗性基因的挖掘和利用提供了前期基础。

南林895杨抗旱耐盐基因DREB1C的转化

以美洲黑杨杂种优良无性系南林895杨为转基因受体材料,利用农杆菌介导法转化与逆境胁迫相关的DREB1C基因。经潮霉素筛选,共获得80株抗性植株,经PCR及RT-PCR检测有30株抗性植株呈阳性,初步证明DREB1C基因已整合到南林895杨基因组中。抗性试验结果初步表明,转基因植株的抗旱、耐盐性均有所提高。

沙冬青CBF/DREB1转录因子cDNA的克隆及序列分析

CBF/DREB1(C-repeat binding factor/dehydration resistance element binding protein 1)是一类抗逆相关的转录因子,它们的表达可以激活下游一系列抗逆应答基因的表达,从而提高植株的抗逆性。沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)主要生长在中国西北荒漠和半荒漠地带,是典型的旱生资源植物,具有突出的抗寒、抗旱、耐盐碱特性。本文以沙冬青为实验材料,利用RT-PCR和RACE技术克隆了沙冬青CBF/DREB1基因cDNA序列,并对其进行了序列分析。结果表明:沙冬青CBF/DREB1转录因子基因序列全长为991bp,包括624bp的开放阅读框(ORF),起始密码子ATG,终止密码子TAA,114bp的5'UTR和253bp的3'UTR,以及加尾信号AATAAA及poly(A)11。生物信息学预测其演绎的氨基酸序列具有AP2结构域,且AP2结构域的两端拥有CBF家族特有的PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR两段短多肽序列,属于CBF家族。沙冬青CBF/DREB1转录因子的克隆为进一步研究植物抗逆和获得抗性基因提供了新的候选基因,也为进一步从分子水平上验证其功能,深入理解植物适应干旱、低温和高盐机制奠定基础。

抗逆调节转录因子DREB1B基因转化多年生黑麦草的研究

以逆境诱导型启动子rd29B为驱动，分别构建了含有抗逆调节转录因子DREB1B基因的表达载体pBAC123、pBAC128，选择标记为bar基因。用高压氦气基因枪PDS1000／He分别将表达载体和p35SIH3导人多年生黑麦草（Loliumperenne）品种Topgun成熟胚的愈伤组织。经除草剂Bialaphos抗性筛选和植株再生，获得了62株转基因植株。经PCR、Dot—blotting分子检测，DREB1B基因已整合到多年生黑麦草部分转基因株系的基因组中。用5种不同浓度的除草剂涂抹黑麦草叶片，非转基因植株表现为不抗，而转基因植株最高可以抗135～200mg／L。脯氨酸含量测定表明，使用15％PEG8000处理后，转基因植株的叶片脯氨酸含量比非转基因植株提高1倍左右。经25d人工温室干旱处理，有5棵转基因植株存活；复水后，有3棵植株恢复正常生长。结果表明，利用逆境诱导型启动子（rd29B）来增强外源DREB1B基因的表达，能显著改良黑麦草的抗旱能力。

农杆菌介导法向小麦茎尖导入DREB1A基因的研究初报

为了研究以小麦茎尖为受体进行农杆菌转化的可行性,选用小麦品种H6756,以茎尖为受体进行了农杆菌转化。构建了含有拟南芥逆境诱导转录因子DREB1A及除草剂bar基因的表达载体pC3300IS-DREB1A,酶切鉴定此载体,结果证明其连接完全正确,具有转录和表达的功能。农杆菌介导法向小麦茎尖导入DREB1A基因,共获得247株转化苗。转化苗经除草剂筛选,获得66株抗性苗,对抗性苗进一步进行PCR检测,有30株抗性苗扩增出特异性片段,转化率达到12.1%,初步说明本试验中以小麦茎尖为受体的转化系统用于基因转化是可行、高效的。

转录因子DREB1A基因和Bar基因双价植物表达载体的构建及对马铃薯遗传转化的研究

马铃薯在生长发育过程中受各种生物和非生物胁迫的影响,干旱是其中最常见和危害最严重的非生物胁迫因素之一,常常导致单产不高,总产不稳,严重影响着马铃薯产业的发展。本研究以改善马铃薯抗旱性为目的,采用PCR方法从拟南芥中克隆了转录因子DREB1A基因和诱导型启动子rd29A。利用DNA重组技术成功构建了诱导型启动子rd29A驱动转录因子DREB1A基因和CaMV35S启动子驱动Bar基因的双价植物表达载体pBI121-rd29-BDR,并通过农杆菌介导法对马铃薯进行遗传转化,PPT筛选得到22株抗性苗,PCR和RT-PCR检测证明DREB1A基因已整合到陇薯10号马铃薯基因组中并在转基因植株中转录表达,有望提高转基因马铃薯的抗旱性。目前,作者正在进行转基因马铃薯的抗旱性分析研究。

不同启动子调控的DREB1A基因对黄瓜的遗传转化

以黄瓜(CucumissativusL.)主栽品种长春密刺的子叶节为受体材料,采用农杆菌介导法,将分别由诱导型启动子rd29A和组成型启动子35S调控的转录因子DREB1A基因导入黄瓜,获得大量PCR阳性植株。统计结果表明:诱导型启动子rd29A调控的DREB1A基因抗性芽率和再生植株PCR阳性率明显高于组成型启动子35S。

转DREB1A/Bar双价基因马铃薯的耐旱性及除草剂抗性分析

在前期获得DREB1A/Bar双价转基因马铃薯的基础上,对转基因植株进行了耐旱性和除草剂抗性分析。耐旱性分析显示,在正常浇水条件下,对照和各转基因马铃薯株系生长状态良好且大致相同,各株系的丙二醛含量、相对电导率和SOD酶活性无显著差异(P>0.05)。经过控水10d后,非转基因对照植株叶片明显萎蔫卷曲,而转基因植株仍然保持良好的生长状态;转基因株系的丙二醛含量和相对电导率显著低于非转基因株系(P<0.05),而SOD酶活性显著高于非转基因对照(P<0.05)。控水18d时,大部分对照植株死亡,死亡率为74.33%;转基因植株只有极少数植株死亡,DR2和DR5的死亡率分别为20.43%和5.65%。用0.3%的市售草铵膦喷施各株系,10d后,对照植株全部枯死,转基因株系的个别叶片干枯,绝大多数叶片及所有茎秆生长状态良好。以上分析表明,DREB1A和Bar基因的导入,明显增强了转基因马铃薯对干旱和除草剂的抗性。

转DREB1A基因提高烟草抗逆性的研究

将拟南芥(Arabidopsis thaliana)DREB1A基因分别在组成型启动子花椰菜病毒35S启动子和逆境诱导型启动子rd29A的驱动下转入烟草中,获得的两种转基因植株对干旱和低温胁迫的抗性均显著提高,但对盐胁迫的抗性无明显变化。研究分析了组成型启动子和逆境诱导型启动子控制的DREB1A转基因植株在形态发育和抗逆性上的差异,对利用DREB1A基因改良作物抗逆性和抗逆基因工程研究中启动子的选择奠定了技术基础。

DREB1B基因在转基因小麦后代的稳定表达

本研究对基因枪导入了pBAC128F/R质粒(含有玉米Adh1内含子1的CaMV35S启动子驱动的bar基因作为选择标记,以来自拟南芥菜逆境诱导表达类型———亲水蛋白rd29b基因的启动子驱动脱水应答转录因子DREB1B基因的逆境诱导表达类型质粒)的T4代转基因小麦进行了稳定表达研究。PCR、PCR-Southern和Southern杂交分析表明,外源转录因子DREB1B基因已稳定整合到转基因株系的基因组中。半定量RT-PCR结果表明,部分转基因株系的DREB1B基因的相对表达量有所增强。叶片除草剂抗性检测结果显示有8个转基因株系可抗到150mg/L。叶片脯氨酸含量测定结果表明,有4个株系(编号为1,18,30和76)的脯氨酸含量提高幅度较大,同一株系,干旱与未干旱处理相比,脯氨酸含量提高了3～5倍。干旱处理后的转基因植株与非转基因植株相比,脯氨酸含量高2～3倍。在干旱条件下,T4代田间小区产量统计数据分析结果表明,有4个转基因株系(编号为30,51,70和76)的产量与非转基因植株相比有显著增加。研究表明,利用逆境诱导型rd29b基因的启动子来增强外源DREB1B基因的表达,能显著改良小麦的抗旱性。

转录因子DREB1A基因的克隆与植物表达载体的构建

根据GenBank中已发表的转录因子DREB1A基因的cDNA序列设计并合成了一对引物 ,通过RT PCR的方法从低温处理的拟南芥总RNA中扩增出DREB1A基因的全长cDNA片段。将其克隆到 pMD1 8T vector中。经测序证明该片段与GenBank上报道的序列具有 99.8%的同源性。 2个碱基的置换导致了一处氨基酸的差异 ,但这一氨基酸并不在基因的功能结构域上 ,推测其不会影响基因功能。以植物表达载体pBch为基础 ,构建了由组成型启动子 35S调控的DREB1A基因的植物表达载体pBDR35S 。

干旱响应转录因子DREB1A基因导入水稻光温敏核不育系的研究

以成熟胚诱导的愈伤组织作为农杆菌转化的受体材料,将诱导型启动子rd29A驱动的拟南芥DREB1A基因导入粳型光温敏核不育系水稻4008S,共获得67株再生苗.再生苗经0.75mg/L除草剂草铵膦涂布筛选,有62株再生苗表现出对草铵膦抗性.PCR检测抗性苗中DREB1A基因,结果全为阳性.挑选部分进行Southern检测,结果表明目的基因已经整合到水稻基因组中.在干旱胁迫下,转基因水稻当代(T1代)植株的电导率显著低于非转基因对照植株(P<0.05),脯氨酸含量显著高于对照植株(P<0.05),证明DREB1A基因能提高水稻对干旱胁迫的耐受性.

转DREB1A基因地被菊耐旱节水性

选用已经获得的具有多重抗逆性的转DREB1A基因地被菊6个株系为试验材料,以未转基因的野生型植株‘WT’为对照,将各株系盆栽幼苗分别进行室温条件下和高温条件下的水分胁迫处理,通过研究水分胁迫前后各株系植株生理指标的变化规律,分析了各株系的耐失水特性,并利用方差分析及隶属函数综合评价的方法对不同株系的耐旱节水能力进行了评价。结果表明,在6个转基因地被菊株系中有5个株系的耐旱节水性优于‘WT’,且其中3个株系与‘WT’差异显著(p<0.05);有1个株系耐旱节水性不如‘WT’,但与‘WT’差异不显著。

盐地碱蓬2个DREB1/CBF基因的克隆与表达调控分析

【目的】从盐地碱蓬(Suaeda salsa L.)中克隆2个DREB1/CBF,分析其序列特征、编码蛋白的亚细胞定位和转录激活活性,以及在非生物胁迫下的表达模式,为进一步研究盐地碱蓬的抗逆机制提供依据。【方法】利用同源克隆法获得盐地碱蓬2个DREB1/CBF片段,采用RACE技术克隆获得c DNA全长序列,分别命名为Ss CBF1和Ss CBF2。运用生物信息学软件对2个Ss CBF及其编码蛋白进行分析,并将它们分别与GFP融合构建植物表达载体,通过基因枪转化法导入洋葱表皮细胞进行瞬时表达,观察它们编码蛋白的亚细胞定位。利用酵母单杂交系统研究2个Ss CBF与DRE/CRT顺式作用元件的结合特异性和转录激活活性。采用Real time-PCR研究2个Ss CBF在低温、Na Cl、PEG以及ABA处理下的表达模式。【结果】Ss CBF1编码一个225个氨基酸的蛋白,预测分子量为25.4 k D,理论等电点为4.84。Ss CBF2编码一个由260个氨基酸组成的蛋白,预测分子量为28.6 k D,理论等电点为5.05。Ss CBF1和Ss CBF2均含有1个典型的AP2/ERF保守结构域,在核苷酸和氨基酸水平上分别具有53.5%和45.4%的同源性,而2个基因的AP2/ERF结构域在核苷酸和氨基酸水平上分别具有76.2%和87.3%的相似性。Ss CBF1、Ss CBF2归属于DREB亚组的A-1组,定位于细胞核内,均能与DRE/CRT顺式作用元件特异性结合,并激活下游报告基因的表达。低温、干旱、高盐和ABA能够诱导Ss CBF1表达,而Ss CBF2在低温处理下表达量上调,但对干旱、高盐和ABA处理不响应。【结论】Ss CBF1和Ss CBF2是盐地碱蓬的2个胁迫应答转录因子。在盐地碱蓬中,Ss CBF1通过依赖ABA途径参与对高盐、干旱和低温等非生物胁迫的应激调控,而Ss CBF2则通过不依赖于ABA途径对低温胁迫产生响应。

铅胁迫下转DREB1A高羊茅对铅的吸收与耐受性研究

通过水培试验,研究转DREB1A高羊茅对铅的吸收与耐受性。分别用浓度为100 mg/L、200 mg/L、500 mg/L、1000 mg/L、1500 mg/L、2000 mg/L的铅溶液对生长1个月的高羊茅进行胁迫处理,3周后测算了高羊茅植株的铅含量、枯黄率、根系耐性指数、迁移率、富集系数、转运系数等指标。结果显示,相同的铅胁迫条件下,转基因高羊茅的生长状况较好,对铅的富集与转运能力也较强。但无论是在生长状况方面还是在铅含量及分布方面,两种高羊茅对铅胁迫的反应趋势基本相同。表明DREB1A基因未改变高羊茅对铅的转移运输机制,但提高了高羊茅对铅的富集能力及耐性,转DREB1A高羊茅可成为修复铅污染土壤的备选植物。

农杆菌介导的DREB1A基因转化多花黑麦草及其转化体系的优化

采用携带卡那霉素抗性基因nptII和GUS基因的ubiquitin启动子驱动的表达载体pBI121/DREB1A的根癌农杆菌AGL1,对多花黑麦草幼胚来源的胚性愈伤组织进行了遗传转化,并优化了各种影响因素。胚性愈伤组织经根癌农杆菌感染和共培养后,用50 mg/L巴龙霉素筛选抗性愈伤组织,待抗性愈伤组织在IB分化培养基上分化成苗后用25 mg/L卡那霉素进一步筛选再生植株,获得了部分抗性植株。抗性植株的总DNA用DREB1A基因的特异引物进行PCR检测,转化频率为2.14%,PCR-Southern blot进一步验证了转化植株基因组中含有该外源基因。各种影响转化效率因素的优化实验表明,当转化时菌液浓度的OD600为2.0、侵染时间为1 h、共培养时间为2 d、共培养温度为21℃及在共培养期间使用乙酰丁香酮等,均可明显提高转化频率。

转DREB1A基因多年生黑麦草T_1代萌发期耐盐性研究

对转DREB1A基因多年生黑麦草(Lolium perenne)的T1代种子和多年生黑麦草非转化植株的子一代种子进行了不同质量分数的NaCl(0、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%)处理,研究了转基因植株对盐胁迫的生理响应。结果表明,随着盐质量分数递增,相对发芽势、相对发芽率、胚芽长、叶绿素含量、叶片含水量及相对含水量呈现下降的趋势,转基因组与对照组之间的差异达到显著水平,高盐胁迫下,前者各指标均高于后者;胚根长变化无明显规律;细胞膜透性的变化与盐质量分数的增加成正相关,转基因组的细胞膜透性低于对照组,二者存在显著差异。说明转基因植株的耐盐性明显强于对照组,转DREB1A基因多年生黑麦草T1代种子可以作为盐害土壤改良和利用的植物资源。

转DREB1A基因地被菊花Fall Color后代综合性状及耐寒性检测

以转35S和rd29A启动子驱动的AtDREB1A基因地被菊花植株为试材,以组织培养微扦插的方式进行繁殖,对获得的转基因各株系无性后代进行性状观察及自然低温条件下的抗性检测。结果表明,转基因株系以茎段为外植体进行组织培养扩繁,植株在大田中移栽成活率高且能够正常生长,与野生型相比,转基因植株株高、冠幅、分枝角度性状存在表型差异,而花期、花色不存在表型差异;转基因各株系在低温胁迫下相对电导率和膜伤害率均明显降低,表明转基因株系增强了对低温的胁迫耐性;2007年冬季转基因株系存活率高,露地越冬能力也明显增强。

转DREB1A基因草地早熟禾对水分亏缺及旱后复水的生理响应

为探讨转DREB1A基因草地早熟禾(Poa pratensis)对水分亏缺及旱后复水的生理响应,本研究选择了草地早熟禾‘巴润’品种5个转DREB1A基因株系,在光照生长室内培养12周后,进行水分亏缺及旱后复水处理,测定了草坪质量、叶片相对含水量(RWC)、叶绿素、电解质渗漏(EL)、丙二醛(MDA)、过氧化氢(H2O2)、抗氧化相关酶活性和总非结构性碳水化合物(TNC)。结果表明,转基因植株适应干旱及旱后复水的能力与抗氧化相关酶活性的增加和TNC的积累有关。

NaCl、PEG双重胁迫下转DREB1A基因多年生黑麦草T1代萌发期抗性研究

对转DREB1A基因多年生黑麦草(Lolium perenne)T1代种子和多年生黑麦草非转化植株F1代种子分别用1.5%NaCl溶液、15%PEG溶液、1.5%NaCl+15%PEG进行处理。测定了相对发芽势、相对发芽率、胚芽长、胚根长、细胞膜透性、相对含水量、叶绿素含量、萎蔫幼苗数、存活率等指标,研究了供试材料对单独胁迫和双重胁迫的抗性,并进行对比。相对发芽势、相对发芽率、胚芽长、细胞膜透性、叶绿素含量等指标的测定结果显示,DREB1A对三种胁迫的抗性强度依次为NaCl>PEG>NaCl+PEG。叶片相对含水量、存活率等指标的测定结果表明DREB1A对三种胁迫的抗性强度依次为PEG>NaCl>NaCl+PEG。萎蔫幼苗株数的测定结果显示,DREB1A对三种胁迫的抗性强度依次为NaCl>NaCl+PEG>PEG。胚根长在三种胁迫下的响应差异不显著。DREB1A对NaCl、PEG单独胁迫和NaCl+PEG双重胁迫均具有一定程度抗性,比非转化植株的抗性明显增强。转DREB1A基因多年生黑麦草T1代种子可以作为干旱、盐碱地区改良和利用的植物资源。