推拿对腰椎间盘突出症大鼠DRG神经元P2X_3受体影响的实验研究

目的:观察推拿对腰椎间盘突出症大鼠DRG神经元P2X_3受体的影响,探讨推拿对腰椎间盘突出症镇痛效应的外周机制。方法:32只SD大鼠随机分为空白组、模型组、假手术组、推拿组。空白组不做任何处理,模型组和推拿组均将"L"形不锈钢柱插入椎间孔对DRG造成恒定压迫,假手术组除不将"L"形不锈钢柱插入椎间孔外,其余造模步骤同模型组。推拿组在造模后第4天开始推拿手法治疗,其余组均不做治疗。疗程结束后,检测大鼠机械反应阈值(PWT)、缩爪反应潜伏期(PWL),采用Western Blot方法观察DRG神经元P2X_3受体含量的变化。结果:空白组、假手术组大鼠在造模后PWT、PWL均没有显著性差异(P>0.05),模型组大鼠造模后PWT、PWL均显著降低(P<0.001),推拿治疗后与模型组相比较具有显著性差异(P<0.05)。与空白组、假手术组相比,模型组大鼠DRG神经元P2X_3受体含量明显升高(P<0.001),推拿治疗后P2X_3受体含量较模型组降低(P<0.05)。结论:推拿对腰椎间盘突出症大鼠有镇痛作用;推拿能够降低腰椎间盘突出症大鼠DRG神经元P2X_3受体的水平进而发挥镇痛效应。

大鼠坐骨神经损伤后DRG神经元P2X_3受体表达的变化

目的应用免疫组织化学技术,探讨大鼠坐骨神经损伤后不同时间段L4-L5节段DRG神经元P2X3受体表达的变化。方法实验动物分为对照组、损伤2d组和损伤7d组,分别建立大鼠坐骨神经离断模型,在2d、7d后按照组化方法常规取材、切片、染色,观察坐骨神经损伤后不同时间段DRG神经元P2X3受体表达的变化。结果对照组、损伤2d组、损伤7d组DRG神经元P2X3受体阳性神经元百分比率分别为31.73%、35.26%、42.93%。坐骨神经损伤2d后DRG神经元P2X3受体表达差异无统计学意义（P〉0.05）;而坐骨神经损伤7d后DRG神经元P2X3受体表达差异有统计学意义（P〈0.05）。结论坐骨神经损伤后不同时间段DRG神经元P2X3受体表达发生了不同的变化。

一种适合膜片钳研究的成年大鼠DRG神经元急性分离方法

目的建立一种适合膜片钳研究的成年大鼠DRG神经元急性分离方法。方法采用结合酶消化及机械分离的方法，急性分离成年大鼠DRG神经元，用于膜片钳研究。结果本方法可分离2-3个月的成年大鼠，不损伤神经元的基本结构和电生理学特性，形态上易于区分。结论本方法步骤单一，操作简单，分离效率高，适合膜片钳研究。

部分背根切断对备用DRG神经元和胶质细胞NGF表达上调的影响

本研究目的在于探讨部分背根切断后备用背根节(DRG)中各类细胞NGF及其mRNA的量变状况。将成年雄猫10只分为正常组、单侧部分背根切断后7天组等2组,每组5只。实验组切除一侧L1～L5,L7～S2 DRG,保留L6 DRG为备用根。取正常组一侧和术后7天组手术侧的L6 DRG制成20μm厚冰冻纵切片,分别用NGF抗体及其cRNA探针进行免疫组织化学及原位杂交反应。观察NGF及其mRNA在DRG各类细胞的分布,测定NGF及其mRNA的光密度值以反映其相对含量。结果表明,在正常组,L6DRG中仅存在少量的NGF及其mRNA阳性神经元,此外,一些胶质细胞也呈阳性反应。在手术组,各类神经元及胶质细胞内NGF及其mRNA的光密度值较正常者显著升高(P<0.05)。结论:部分背根切断导致备用DRG神经元和非神经元表达NGF增多,提示NGF可能有利于促进备用背根生芽。

一种适合膜片钳单通道记录的大鼠DRG神经元急性分离方法

目的:建立一种适合膜片钳单通道记录的脊髓背根神经节神经元急性分离方法。方法:用酶消化和机械分离相结合的方法急性分离大鼠DRG神经元。结果:用本方法分离的DRG细胞容易形成较高的封接电阻(>5GΩ),降低了噪音干扰,可记录到pA级的单通道电流。结论:本方法急性分离的DRG神经元适合单通道膜片钳实验研究。

2,5-HD对大鼠DRG神经元神经丝蛋白表达的影响

目的比较2,5-己二酮(2,5-HD)和3,3′-亚氨基二丙腈(3,3-′IDPN)对大鼠DRG神经元神经丝蛋白(NF-M)的损伤作用。方法用出生后2 d的大鼠背根神经节(DRG)神经元,在培养皿中加不同浓度的2,5-HD和3,3-′IDPN进行培养,用荧光染料测定细胞毒性,计算细胞死亡率。用蛋白免疫荧光方法测定NF-M,计算DRG神经元细胞体的神经丝表达。结果DRG神经元24 h接触2,5-HD和3,3-′IDPN的LD50约为32和102 mmol/L。DRG细胞体内的NF-M蛋白含量在接触2,5-HD(0、4、8和16 mmo/L浓度)24和48 h后结果显示,各个剂量组均有明显降低(P<0.05,P<0.01);而在接触3,3-′IDPN 24 h后,各个剂量组之间没有发生明显改变,但在接触48 h后,仅有64,128 mmol/L组与对照相比,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。在DRG神经元具有相同死亡率时,2,5-HD和3,3-I′DPN 24 h后对NF-M蛋白表达差异有统计学意义(P<0.05)。结论2,5-HD与3,3-′IDPN对NF-M的损伤不同。2,5-HD减少NF-M蛋白表达要早于细胞死亡。NF-M对2,5-HD比对3,3-′IDPN敏感。

Baclofen对大鼠新鲜分离DRG神经元GABA和NMDA激活电流的抑制作用

用全细胞膜片箝技术在大鼠新鲜分离的背根神经节 (DRG)细胞上观察到baclofen对GABA和NMDA激活电流有调制作用。单独给予DRG细胞baclofen (1～ 10 0 μmol/L)未记录到可测的电流改变 ,但预加baclofen对GABA和NMDA激活电流具有明显的抑制作用 ,且呈剂量依赖性。 10 0 μmol/Lbaclofen对GABA和NMDA激活电流分别抑制(5 1.2± 10 .9) % (X±SE ,n=8,P <0 .0 1)和 (6 4 .1± 2 1.1) % (X±SE ,n=6 ,P <0 .0 1) ,此抑制作用是可逆的 ,可被GABAB 受体拮抗剂saclofen(10 0 μmol/L ) 所取消 (n =4 )。

组织胺对大鼠DRG神经元ATP-激活电流的抑制作用

目的:探讨组织胺对大鼠DRG神经元ATP-激活电流的调制作用.方法:采用全细胞膜片钳技术,在新鲜分离的大鼠背根神经节细胞上进行.结果:实验观察到组织胺在DRG神经元可引起内向电流,并有明显的浓度依赖性.在被检测的DRG神经元中,85%(30/35)的细胞对ATP敏感,可引起一浓度依赖性的去敏感的内向电流.预加10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L组织胺后,对ATP-激活电流的抑制分别是:(12.50±3.2%(n=5)、(24.49±3.5%(n=5)、(35.18±4.5%(n=6)、(32.62±5.8%(n=8)、(23.53±4.2%(n=5),呈浓度依赖性.结论:组织胺对大鼠DRG神经元ATP-激活电流有明显的抑制作用.

福尔马林致痛上调大鼠DRG神经元SP与NMDA受体的表达

目的:观察DRG神经元膜SP受体与NMDA受体的表达,探讨二者在疼痛中的作用。方法:16只健康SD大鼠随机分为生理盐水(NS)组及福尔马林致痛(F)组,应用免疫荧光双标技术观察并比较两组大鼠DRG神经元膜SP受体与NMDA受体的表达的差异。结果:免疫荧光显示两组大鼠DRG神经元膜均有SP受体与NMDA受体共存。F组大鼠DRG神经元膜SP(NK1)的表达高于NS组,OD值分别为99.37±19.69(n=8)、60.10±21.65(n=8),P<0.05;F组大鼠DRG神经元膜NMDA(NR1)阳性产物的表达高于NS组,OD值分别为89.17±30.05(n=8)、56.31±13.75(n=8),P<0.05。结论:大鼠DRG神经元膜SP受体与NMDA受体有共存,福尔马林致痛大鼠DRG神经元SP受体与NMDA受体表达上调。

多巴胺增强培养新生大鼠DRG神经元ATP激活电流

目的 :探讨多巴胺对ATP激活电流的调制作用。方法 :实验在培养的新生大鼠脊髓背根神经节细胞上进行 ,应用全细胞膜片钳技术记录出ATP和多巴胺激活的电流。结果 :在被检的DRG细胞中 ,有 6 2 % (39/ 6 3)的神经元对ATP和多巴胺都敏感。在预加 10 -8,10 -7,10 -6和 10 -5mol/L多巴胺后 ,ATP的激活电流分别增加到 139.7% ,141.5 % ,149.9% ,149.1% ;呈剂量依赖性。用D1的拮抗剂SCH - 2 3390能取消此增强作用 ;在电极中灌注H - 7(PKC ,PKA抑制剂 )也能取消此增强作用。结论 :多巴胺对ATP激活电流的增强作用是多巴胺作用于D1受体 ,通过胞内第二信使 ,使P2X受体通道复合体胞内磷酸化所致。

小直径DRG神经元上表达的电压门控离子通道特性

目的建立一种简单易行,满足多种药理学实验需要的大鼠DRG神经元急性分离方法,探讨大鼠DRG神经元的电生理特性。方法对160-220 g SD大鼠DRG神经元进行急性分离,并采用全细胞膜片钳技术记录电压门控离子通道钠电流、钙电流和钾电流。结果急性分离的大鼠DRG神经元呈圆形或椭圆形,胞质均一,折光性好,所表达的钠通道电流、钙电流和钾电流符合其电生理特性。结论运用该方法急性分离细胞操作简单易行,容易获得和辨认,电生理特征明确,适用于疼痛等疾病的电生理研究和相关药物的作用机制考察。

静态性牵拉对DRG神经元生长的影响研究

目的神经损伤后神经生长放缓、无方向性,轴突无法向靶细胞延伸,导致神经难以再生。有研究报道,牵张能定向牵引神经元向下端所支配神经元延伸,并且形成突触连接,但是其作用机制尚不明确。探究牵张诱导神经元轴突导向生长的分子作用机制,为神经再生提供新的治疗思路。方法采用递进式静态性牵拉加载方式,探究不同应变幅度对DRG神经元轴突生长的影响,免疫荧光染色检测细胞突起的偏转角度和延伸情况。

抑制sigma-1受体可减少神经病理性疼痛大鼠DRG细胞凋亡

目的研究抑制sigma-1受体(sig-1R)对坐骨神经慢性缩窄性损伤(CCI)介导的神经病理性疼痛大鼠背根神经节(DRG)细胞凋亡的影响。方法将行鞘内置管术的大鼠随机分为3组:假手术组(sham组)、神经病理性疼痛模型组(model组)(鞘内置管1周后行CCI造模)、sig-1R抑制剂组(BD1047组)CCI术后4、5、6 d,鞘内注射BD1047,每组12只。于术前1 d与术后1、3、5、7 d检测大鼠机械缩足反应阈(MWT)。用Western blot与免疫荧光法检测DRG细胞sig-1R、Bcl-2、Bax的表达;TUNEL染色法观察DRG细胞凋亡;透射电镜观察DRG细胞内质网、线粒体变化。结果与sham组比较,model组术后各时点MWT降低,DRG细胞凋亡率上调,Sig-1R、Bax上调,Bcl-2下调,DRG细胞内质网肿胀,线粒体膜破坏、线粒体嵴减少(P<0.05);与模型组比较,BD1047组术后5、7 d MWT升高,DRG细胞凋亡率下调,Sig-1R、Bax下调,Bcl-2上调,DRG细胞内质网、线粒体损伤轻微(P<0.05)。结论抑制sig-1R可上调CCI大鼠机械缩足反应阈值、减少DRG细胞凋亡。

甲硫-脑啡肽对大鼠DRG分离神经元ATP-激活内向电流的抑制

本研究探讨了甲硫－脑啡肽（ｍｅｔ－Ｅｎｋ）对ＡＴＰ－激活电流（ＩＡＴＰ）的调制作用。实验在大鼠新鲜分离背根神经节（ＤＲＧ）神经元上进行。应用全细胞膜片钳技术所记录的ＩＡＴＰ为内向电流。在被检测的ＤＲＧ神经元中，９０．０％（４５／５０）的细胞对ＡＴＰ有反应。在４５个对ＡＴＰ感的细胞中：对大部分细胞（２９／４５）施加ｍｅｔ－Ｅｎｋ（１０－９～１０－５ ｍｏｌ／Ｌ）也引起一内向电流；少部分细胞（９／４５）为外向电流；其余的细胞（７／４５）未引起可检测的腹反应。预加ｍｅｔ－Ｅｎｋ后ＩＡＴＰ明显地被抑制，此种抑制作用为剂量依赖性的。在预加１０－９、１０－８、１０－７、１０－６、１０－５ ｍｏｌ／Ｌ ｍｅｔ－Ｅｎｋ后，ＩＡＴＰ的抑制分别为：１３．２±５．４％（ｎ＝５）、３９．２±８．６％（ｎ＝８）、５４．１±８．６％（ｎ＝ ８）、４３．３±７．９％（ｎ＝７）；４３．１±７．９％（ｎ＝７）（ｍｅａｎ±ＳＥＭ）。阿片肽拮抗剂纳洛酮能翻转此种抑制效应。ＩＡＴＰ的量－效关系表明，预加ｍｅｔ－Ｅｎｋ后曲线明显压低，在浓度为１０－３ｍｏｌ／Ｌ时ＩＡＴＰ下降约２５％，而Ｋｄ值几乎不变。

大鼠慢性背根节压迫诱致DRG大神经元兴奋性增强和Ih电流显著上调

目的:探讨大鼠CCD模型模拟的腰背痛诱致的DRG大神经元兴奋性改变及其离子通道机制。方法:建立大鼠慢性压迫腰膨大L4/L5 DRG的CCD模型,模拟临床常见的腰背痛的触诱发痛表现。制备整节L4/L5 DRG标本,应用全细胞膜片钳技术记录去极化电流刺激诱致的DRG大型神经元的兴奋性改变及其离子通道机制。结果:对直径>50μm的健康的DRG大神经元进行全细胞膜片钳记录。结果显示:给予去极化方波电流刺激可以诱致CCD模型大鼠DRG大神经元呈现兴奋性增强的表现,具体表现为相同刺激强度的电流注射在CCD模型DRG大神经元上诱致的动作电位的频率显著高于对照组神经元。同样的细胞放电增强也见于给予细胞斜波电流刺激。进一步的机制研究分析显示CCD模型大鼠上DRG大神经元的I_h电流明显高于对照组大鼠。结论:CCD模型可以诱致DRG大神经元呈现超兴奋状态,该兴奋性增强的状态主要由I_h电流增强来介导,为认识神经损伤诱致的病理性痛觉敏化尤其是触诱发痛的神经机制提供了实验证据。

静态性牵张诱导神经突起导向生长的Slit/Robo分子机制的研究

目的神经元在发育过程中,轴突会在通过中线时受到不同的吸引或排斥信号,引起神经轴突延伸或回缩。而牵张可引起神经元与下端所支配神经元发生突触连接,其作用机制不明确。而探明Slit/Robo信号通路在牵张诱导轴突延伸中的调节机制是神经再生的关键。方法采用静态性牵拉,对体外培养的DRG神经元分别进行2.5%、5%、7.5%和10%的张应变,探究不同加载时间4、8、12 h后DRG神经元生长的影响,免疫荧光染色检测细胞突起的偏转角度和延伸情况,并导向分子Slit2及其受体Robo2的基因和蛋白表达进行PCR和WB检测。结果在牵张张应变2.5%、4 h后DRG神经元生长良好,但是突起长度延伸不显著。随着张应变增加至5%时,其存活率和突起长度显著性增加,轴突顺应牵张力的方向生长。随着牵张加载至10%、12 h时,细胞存活率下降,活细胞数显著性减低,突起出现显著性断裂损伤,不利于神经细胞的生长。从FDA和CCK-8以及细胞突起长度和突起偏转方向等检测结果,牵张5%、4 h适合DRG神经元的生长。此外,牵张5%、4 h作用后细胞内Slit2和Robo2的m RNA和蛋白表达显著性下降,显著性促进了神经元的导向生长。提示牵张在5%、4 h后对神经突起的排斥作用减弱,有助于神经突起的延伸性生长。研究结果为今后牵拉用于神经再生提供了新的方法。

微小RNAs在外周神经损伤修复中作用的研究进展

微小RNAs(microRNAs,miRNAs)是一类长度约为22个核苷酸的非编码RNAs,在神经发育、再生和疾病中起着至关重要的作用。周围神经损伤后,许多miRNAs会发生差异表达,这些差异表达的miRNAs通过负向调控下游靶基因的表达,参与受损神经的修复与再生。本文就miRNAs在周围神经再生中的调控作用进行综述,为周围神经损伤后的治疗提供潜在的策略。

腺苷A1和A3受体参与的DRG神经元内Ca^2＋释放的多光子成像

运用激光共聚焦显微成像技术,通过应用腺苷受体的特异性阻断剂和激动剂,研究腺苷受体对腺苷诱导的大鼠背根神经节(DRG)神经元中Ca2+的动态变化的影响,并且进一步研究了腺苷诱导Ca2+动态变化的剂量相关性。结果显示,腺苷A1和A3受体参与腺苷诱导的DRG神经元Ca2+释放,腺苷能引起DRG神经元内Ca2+浓度升高且呈剂量相关性。研究结果表明,共焦显微成像能有效检测单细胞内离子的动态信号,有助于了解腺苷及其受体参与疼痛过程中细胞离子信号传递的机制。

基于雪旺细胞-背根节神经元共培养建立周围神经髓鞘化体外模型

目的:为探讨雪旺细胞与背根节(DRG)神经元髓鞘化共培养的标准化方法,并建立周围神经髓鞘化体外模型。方法:采用新生大鼠DRG神经节组织块培养法和胚胎大鼠DRG神经节分散培养法分别进行雪旺细胞和DRG神经元的培养和纯化,将雪旺细胞接种到培养DRG神经元的盖玻片上,按髓鞘化共培养程序进行雪旺细胞-DRG神经元共培养。结果:(1)雪旺细胞和DRG神经元的纯度、数量及比例;(2)共培养载体的包被基质;(3)髓鞘化共培养步骤和培养基成分是影响髓鞘形成的关键因素。原代雪旺细胞和DRG神经元S-100、神经元特异性烯醇化酶免疫荧光染色结果显示其纯度分别达到95%、90%;在髓鞘化培养基中共培养14d后相差显微镜和扫描电子显微镜下均观察到雪旺细胞包裹DRG神经元轴突形成髓鞘节段,髓鞘碱性蛋白免疫荧光染色结果显示免疫反应性;共培养体系和髓鞘结构可保持两个半月左右。结论:基于雪旺细胞和DRG神经元的条件化共培养能建立一种可靠的周围神经髓鞘化体外模型,为周围神经髓鞘化的主要调节因素及其作用机制研究提供有效的实验模型。