2021年~2022年我国猪盖塔病毒流行情况调查及其E2基因序列遗传变异分析

为了解2021年~2022年我国猪盖塔病毒(GETV)的流行现状和遗传变异情况,本研究对我国16个省份采集2512份临床样品,采用荧光定量RT-PCR方法进行GETV的检测,按照省份和地区进行GETV流行病学调查分析;采用RT-PCR方法对部分GETV阳性样品经PCR扩增E2基因并连接至p MD18-T载体并测序,利用DNAStar软件分析E2基因及其编码氨基酸序列与GETV参考株相应序列的同源性及其氨基酸变异情况;利用MEGA6.0软件构建E2基因的进化树,分析GETV的基因型及遗传进化关系。结果显示,7个省份猪群样品中均检测出GETV阳性样品,阳性率为3.34%(84/2512)。其中,陕西省和黑龙江省为首次在猪中检测到GETV。不同生长阶段猪中,仔猪GETV的检出率最高,达9.52%。同源性分析显示,获得的32个猪源GETV E2基因序列之间的同源性为98.3%~100%,与马来西亚GETV MM2021株相应基因序列的同源性为94.4%~94.9%。氨基酸序列变异分析显示,与参考株相比,本研究测序的E2蛋白有9个氨基酸位点只出现于猪源GETV。遗传演化分析显示,32个GETV株均属于III亚群,与III亚群内早期中国M1株、韩国QIAG9301株、日本Kochi等病毒株相比,本研究鉴定的GETV形成了新的进化分支。本研究揭示了我国当前猪群中GETV的感染现状及流行株的遗传变异情况,为该病毒的分子生物学研究和相关疫病防控策略的制定提供基础数据和参考依据。

牛病毒性腹泻病毒陕西分离株的鉴定及E2基因的克隆与序列分析

为分析陕西省牛病毒性腹泻病毒(BVDV)分子变异情况,采集陕西省某牛场腹泻患牛粪便样品,经处理后接种至MDBK细胞后,进行病毒分离鉴定并对分离的BVDV进行E2基因的克隆和遗传进化分析。结果显示,样品经过RT-PCR鉴定后接毒,第4天出现明显的细胞病变(CPE),通过设计特异性引物对收获的病毒成功扩增出BVDV E2基因,证明分离的病毒为BVDV。对该病毒的E2基因进行序列分析,所得序列与GenBank上已发表的BVDV毒株的核苷酸序列同源性为84.5%~100%,氨基酸序列同源性为82.1%~100%。结果表明,成功分离到牛病毒性腹泻病毒并进行了E2基因的克隆与序列分析,研究结果可为陕西地区BVDV的流行病学、致病性及生物学特性研究提供依据,为BVDV的区域流行及有效防控提供参考,为新疫苗的研发提供地方种毒。

湖南一株猪非典型瘟病毒的鉴定及其NS5B和E2基因序列分析

随机挑选湖南某规模化猪场出现“抖抖病”的新生仔猪,采集血清样本,用可扩增猪非典型瘟病毒(APPV)的NS5B基因和E2基因引物进行RT-PCR鉴定,对PCR扩增产物测序。随后利用MegAlign软件分析NS5B和E2基因序列的同源性,预测E2蛋白部分结构,并使用MEGA 5.0,采用邻接法构建NS5B和E2基因的遗传进化树。结果表明,发病仔猪为猪非典型瘟病毒(APPV)感染阳性。鉴定毒株HN0626与GenBank中84株参考毒株NS5B和E2基因序列的同源性分别为81.68%~98.95%、81.14%~99.33%,通过预测E2蛋白部分结构,推导其潜在的B细胞抗原表位。系统发育分析显示,HN0626毒株属于基因1型,是全球猪群中的主要流行毒株,其E2、NS5B基因序列在GenBank中的登录号分别为OR936135、OR936136。

辣椒E2基因家族的鉴定及分析

【目的】泛素结合酶E2(UBC)作为泛素蛋白酶体途径中将泛素转移至靶蛋白的重要中转酶,与植物的生长发育和许多胁迫有关。从辣椒全基因组中鉴定E2基因家族成员,分析相关基因表达模式,为后续研究提供理论基础。【方法】基于辣椒全基因组信息,利用生物信息学方法对E2基因家族进行鉴定,系统分析该家族成员的基本理化性质、亚细胞定位、染色体定位、基因结构、系统进化关系、顺式作用元件、蛋白质互作网络、非生物胁迫响应与组织器官表达模式。【结果】辣椒E2家族有48个成员,在11条染色体上呈不均匀地分布,其编码蛋白主要定位于细胞外和细胞核中;通过对辣椒、番茄和拟南芥的比较进化分析将其分为GroupⅠ-GroupⅧ亚族,同一亚族具有相似的蛋白保守基序和基因结构;发现共有26个蛋白之间存在互作;顺式作用元件分析表明,CaUBC基因启动子区含有大量光响应、激素响应元件,上游2000 bp区域中存在多种与生长发育和抗逆性相关的顺式作用元件;CaUBC参与胁迫响应,在不同非生物胁迫和激素处理下,将其分为3类,其中高温环境下第3类基因为高表达;在组织器官中表现出不同的表达,其中CaUBC38在果实中的表达量变化较为明显,进行RT-qPCR分析发现,50 d相对表达量最高,10 d表达量最低。【结论】获得48个辣椒E2(CaUBC)基因,揭示了E2家族不同成员在辣椒生长发育和非生物胁迫过程中的表达特征。

种猪繁育与育肥场猪瘟E2基因工程疫苗免疫效果的调查与研究

为探究猪瘟E2基因工程亚单位疫苗相比于传统猪瘟C株弱毒疫苗(脾淋源)在免疫与生产上的优势,本文以汉中某一地方品种种猪场和代养场为调查对象,选择一批繁育母猪和育肥仔猪分别免疫猪瘟E2基因工程亚单位疫苗和猪瘟活苗,对比结果发现,母猪免疫猪瘟E2亚单位疫苗后哺乳仔猪断奶成活率平均提高了16.3%;且接种的两种猪瘟疫苗对育肥仔猪的免疫效果差异极显著(P<0.01),其中E2亚单位疫苗相比于猪瘟活疫苗能够明显提高育肥仔猪抗体阻断率和降低离散度,有助于育肥仔猪的健康生长,这为规模化猪场在选择猪瘟疫苗时提供重要参考依据。

细胞源猪瘟活疫苗E2基因遗传稳定性和免疫原性分析

测定了中国4个细胞源猪瘟活疫苗(C株)E2基因全序列,将其与GenBank上13个猪瘟病毒的E2基因序列(含C株原始毒株、7个猪瘟病毒C株以及国际上5个主要猪瘟活疫苗毒株的E2基因全序列)进行了核苷酸序列、推导的氨基酸序列进行遗传变异分析,通过生物信息学手段对预测的E2蛋白N-糖基化位点、E2蛋白磷酸化位点和理化特性以及模拟的蛋白空间结构进行了比较,并通过免疫攻毒试验对4个细胞源猪瘟疫苗(C株)的免疫效果进行了验证。结果表明,与猪瘟病毒C株原始种毒相比,尽管中国4个细胞源猪瘟活疫苗的E2基因核苷酸序列、推导的E2蛋白氨基酸序列或模拟的三维结构等发生个别核苷酸变异、个别氨基酸位点突变或缺失,但均不影响猪瘟C株的免疫原性,猪瘟疫苗C株仍然是防控猪瘟的最有效武器。

马源人乳头瘤病毒23型E2基因的遗传变异分析

为调查马源人乳头瘤病毒(HPV)23型(HPV-23)在马群中的流行及遗传变异情况,本研究对413份马流产胎儿组织和20份马场工人鼻拭子样品经PCR检测,结果显示,在纯血马和伊犁马流产胎儿组织样品中均检出HPV-23,阳性率分别为4.3%(2/46)和9.3%(34/367),表明马流产胎儿携带HPV-23,该病毒可能导致马的流产;在马场工人鼻拭子样品中也检出HPV-23,阳性率为60%(12/20)。将其中12份检测为HPV-23阳性的样品进行E2基因的PCR扩增测序后,采用MegAlign7.1.0软件分析本研究获得的HPV-23 E2基因与GenBank中相关病毒参考株E2基因的同源性,并采用MEGA7.0.26软件构建人源与马源HPV-23 E2基因的进化树,分析其遗传进化特征。同源性分析结果显示,本研究测序的8株马源及4株人源HPV-23 E2基因与氨基酸序列的同源性均为100%,与国外2株人源HPV-23 E2基因序列的同源性为98.9%~99.2%,提示马源HPV-23可能来源于人。遗传进化分析显示,本研究鉴定的马源及人源HPV-23与国外人源HPV-23形成独立进化分支,且同处于β进化分支,与马乳头瘤病毒处于不同分支,进一步表明马源HPV-23可能来源于人。本研究首次在马流产胎儿组织中检测到HPV-23,提示该病毒可能导致马的流产,可能是人源HPV-23感染马,该结果为动物源HPV-23的流行病学研究提供了参考依据。

广西猪瘟病毒变异株分离鉴定及其E2基因遗传特性分析

【目的】明确猪瘟病毒(CSFV)广西分离株的分子流行病学特点和病原学特性,为科学使用CSF疫苗及有效防控广西CSFV流行提供参考依据。【方法】2019年12月—2020年10月,从广西南宁、隆安、柳州、百色及北海等地采集疑似CSFV感染的流产胎儿、死胎、木乃伊胎和弱仔猪的组织(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和淋巴结等)进行CSFV检测,通过PK-15细胞进行病毒分离,采用RT-PCR和间接免疫荧光试验(IFA)进行鉴定,克隆CSFV分离株E2基因,经DNASTAR进行核苷酸序列及推导氨基酸序列同源比对分析后以MEGA 6.0构建遗传进化树;同时以Shimen标准株为对照,检测感染PK-15细胞后分离株的生长曲线、病毒mRNA和E2蛋白水平。【结果】从104份疑似CSFV感染样品中分离出1株CSFV,命名为GXNN2019-13,接种至PK-15细胞后并未出现细胞病变。GXNN2019-13株与我国Shimen标准株(强毒)和HCLV株(弱毒)的E2基因核苷酸序列相似性较低,分别为84.6%和83.5%,而与日本CSF0745株及德国CSF0496和Alfort Tuebingen株的相似性分别为93.9%、92.2%和91.5%;GXNN2019-13株与Shimen和HCLV株的E2氨基酸序列相似性分别为89.3%和88.7%,与日本CSF0745株及德国CSF0496和Alfort Tuebingen株的相似性分别为95.5%、94.6%和93.8%;以HCLV株为参照进行多序列比对,发现GXNN2019-13株E2蛋白较Shimen标准株的变异程度更高。感染PK-15细胞后,GXNN2019-13株的病毒复制能力弱于Shimen标准株,生长曲线上各时间点的病毒效价及mRNA水平均低于Shimen标准株。【结论】从疑似CSFV感染病料分离获得的GXNN2019-13株属于2.3亚型中的独立小分支,与之前的广西分离株亲缘关系较远,可能是新的变异毒株,其复制能力弱于Shimen标准强毒株。

12株猪瘟病毒E2基因主要抗原区域的序列差异分析

用RT PCR扩增了 1 2个不同时期分离的HCV毒株E2基因主要抗原区域的cDNA片段并对其进行了序列测定。应用DNAstar序列分析软件对所测的 1 2个HCV毒株与国内外已知的 6个毒株Alfort株、Ald株、Brescia株、Gpe株、C株、CW株及早期已测定的HCLV株、HCVSM株和北京顺义株 (BJSY2 /96) 3个毒株的相应片段进行了同源性比较分析。E2基因主要区域长度均为 2 2 4bp ,包括从HCV 2 4 85到 2 70 8位的E2基因B、C区域。所测的疫苗株HCLV与国外测得的疫苗株C株核苷酸及氨基酸同源性分别为 99 1 %和 1 0 0 % ,表明目前应用的疫苗株是稳定的 ;用目前我国流行的部分野毒株对HCLV株免疫猪的攻击试验表明 ,HCLV对野毒株均具有很好的免疫力 ,这与序列分析结果相吻合。根据系统树分析 ,可将HCV分为两大群 ,5株 90年代的野毒株及 1株 80年代的野毒株 (其中北京 3株、河南 2株、广东 1株 )均与国内外C株、标准株属同一群 (即第一群 ) ,其核苷酸及氨基酸的同源性分别为85 7%～ 1 0 0 %和 83 8%～ 1 0 0 % ;与Alfort株同属第二群的有 6个野毒株 (广西北海、辽宁、河北黄骅、吉林、深圳光明、四川成都 ) ,其中 80年代与 90年代的野毒株各有三株 ,核苷酸及氨基酸的同源性分别为 84 3%～ 1 0 0 %和 85 1 %～ 1 0 0 % ;2 1株HCV的核苷酸?

猪瘟病毒E2基因的定点突变、在大肠杆菌中的高效表达及表达产物的免疫原性

用重组PCR技术对猪瘟病毒石门株E2基因进行了定点突变 ,然后将突变后的基因克隆至表达载体质粒pET 2 8a(+ )中 ,构建成重组质粒pETE2。将pETE2转入受体菌BL2 1(DE3 )plysS中 ,在IPTG的诱导下 ,重组转化菌可高效表达目的基因 ,表达量平均可达菌体蛋白总量的 2 8%。免疫印迹和间接ELISA表明所表达的蛋白是CSFV特异性的。

猪瘟病毒流行毒株E2基因密码子优化及在酵母中的高效表达

密码子的偏嗜性是影响基因异源表达的重要参数之一 ,优化密码子序列能够提高外源基因的表达水平。野生型猪瘟病毒E2基因在毕赤酵母中的表达量较低 ,为了提高E2基因在毕赤酵母中的表达水平 ,利用PCR基础上的定点突变技术将E2基因上的毕赤酵母低利用密码子突变为其高利用率的简并密码子。结果表明 ,替换野生型E2基因上 2 4个酵母低利用密码子后 ,E2基因在酵母中表达水平有较显著提高 。

急、慢性猪瘟病毒分离株和疫苗株E2基因的序列分析

利用反转录 (RT)及套式PCR(N -PCR)扩增并测定了 6株具有不同表症近期甘肃省猪瘟流行野毒及C -株细胞疫苗毒的主要免疫原E2基因的核苷酸序列。序列分析比较结果表明 ,6株流行野毒与C -株疫苗毒的核苷酸同源性为 82 %～ 84 % ,流行野毒之间的核苷酸同源性在 89%～99%之间 ,并且明显可分为二个组群 ,病毒株所属组群与其临床症状有一定的相关性。流行野毒与C -株毒在中和抗原决定簇上有部分氨基酸存在性质差异 ,可能影响C -株毒对流行野毒的中和滴度。

猪瘟病毒E2基因在Pichia pastoris中的表达及其免疫活性的初步研究

将猪瘟病毒的E2基因克隆入酵母分泌型表达载体pPIC9K中 ,酶切线性化后电穿孔导入Pichiapastoris进行整合 ,经G418筛选得到高拷贝转化子 ,甲醇诱导表达。SDS PAGE和Westernblot结果证实了酵母培养上清液中含有E2蛋白。免疫活性研究证明P .

22株猪瘟病毒E2基因部分编码序列的序列分析

利用RT PCR方法获得了 1 3株猪瘟病毒分离株、石门系强毒、中国C株及法国温度敏感株Thiverval株的E2基因部分编码序列的扩增片段 ,并对其进行了测序 ,得到了 2 5 1bp的E2基因部分编码序列。利用DNAStar软件对其中 2 2 4bp的片段进行了序列分析 ,并与已发表的Alfort、Brescia等毒株进行比较 ,结果 1 3株猪瘟分离株所测片段均为猪瘟病毒E2基因的序列 ,与石门系强毒的序列相比所有毒株的碱基替换随机地分布于整个序列 ,无碱基缺失和碱基插入。其中变化较大的区域位于序列的 3′端。 2 2株HCVE2基因部分编码序列的核苷酸及氨基酸同源性范围分别为 :78 1 %～ 1 0 0 %、 78 4%～ 1 0 0 % ,其中 1 3株猪瘟病毒流行毒株的核苷酸及氨基酸同源性范围分别为 :78 1 %～ 1 0 0 %、 78 4%～ 1 0 0 % ,4株 70～ 80年代分离的毒株的核苷酸及氨基酸同源性范围分别为 :79 0 %～ 88 3%、 81 1 %～87 8% ,9株 90年代分离的毒株的核苷酸及氨基酸同源性范围分别为 :80 8%～ 1 0 0 %、83 8%～ 1 0 0 % ;

猪瘟病毒保护性抗原E2基因的克隆及在原核细胞中的表达

应用ＲＴＰＣＲ分两段扩增猪瘟病毒（ＨＣＶ）石门株Ｅ２基因，然后对其进行了克隆。利用两个片段重叠部分的单一ＢｇｌⅡ位点，将它们连接成为完整的Ｅ２基因，并克隆到ｐＵＣ１９质粒中，获得重组质粒ｐＨＣＥ２。另设计一对引物，以ｐＨＣＥ２为模板扩增出不含信号肽的Ｅ２基因，然后将其克隆到表达载体质粒ｐＢＶ２２０和ｐＥＴ２８ａ（＋）中，获得重组质粒ｐＢＶＥ２和ｐＥＴＥ２，用酶切、ＰＣＲ和序列分析鉴定Ｅ２基因插入位置、方向和读码框架的正确性。经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ和直接ＥＬＩＳＡ检测表明重组质粒ｐＢＶＥ２和ｐＥＴＥ２转化、诱导的受体菌均能表达Ｅ２抗原。

异源猪瘟病毒C株E2基因保护性抗原编码区的序列分析与比较

应用ＲＴ－ＰＣＲ扩增了我国南京、成都、吉林３个兽医生物制品厂提供的猪瘟病毒兔化弱毒株（Ｃ株）的Ｅ２基因保护性抗原编码区，然后将其克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体中，用Ｓａｎｇｅｒ′ｓ双脱氧法对重组质粒中的插入片段进行了序列分析。将测得的这３个厂生产的Ｃ株的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列与作者实验室测得的国内石门株和国外测得的Ｃ株相同区域进行同源性比较，发现不同来源的Ｃ株及石门株之间存在不同程度的差异，核苷酸同源性为９３．６％～９９．６％，氨基酸同源性为９０．６％～９８．９％。

猪瘟病毒E2基因抗原结构域A、B、C、D区在大肠杆菌中的表达

采用PCR技术扩增出猪瘟病毒E2基因抗原结构域A、B、C、D区并克隆于PGEM Teasy载体上,测序结果表明插入的为猪瘟病毒E2基因抗原结构域,切出目的基因,将目的基因克隆到表达质粒pProEX HTb中,获得重组质粒经PCR、酶切和序列分析鉴定E2基因抗原结构域插入的位置、大小和读码框均正确,SDS PAGE检测表明受体菌经IPTG诱导后能表达E2基因抗原结构域蛋白,Westernblot检测表明受体菌诱导表达E2基因抗原结构域蛋白可与猪瘟阳性血清发生特异性反应。

牛病毒性腹泻病病毒Changchun184株E2基因的克隆及在大肠杆中的高效表达

根据GenBank已发表的多个BVDV_1序列的比较分析结果设计引物 ,应用RT_PCR及套式PCR克隆得到包含Changchun184 (CC_184 )株E2基因的片段F2 /R2 ,克隆、测序分析结果表明该片段大小为 1391bp ,软件分析结果表明CC_184株E2基因长度为 112 2bp(GenBankaccessionnumber:AF5 2 6 380 )。通过基因操作构建得到表达完整E2蛋白和去除E2蛋白C_端疏水区的重组质粒 pET2 8a_BE2和 pET2 8a_BE2m ,转化大肠杆菌并诱导目的蛋白表达 ,SDS_PAGE检测结果表明重组菌能表达目的蛋白 ,其表达量分别占菌体总蛋白的 6 2 5 %和 35 7%。

猪瘟病毒云南毒株E2基因片段序列测定及分析

用RT_nPCR方法 ,选择猪瘟病毒 2 0 0 0年云南部分地方流行毒株E2基因主要保护性抗原决定簇编码区片段进行扩增和cDNA序列分析 ,并与中国标准强毒石门株进行比较。结果显示 ,云南地方毒株之间核苷酸及氨基酸序列同源性均大于90 % ;但与中国标准强毒石门株差异较大 ,其核苷酸及氨基酸同源性均小于 80 %。

猪瘟病毒贵州流行株E2基因原核表达及其免疫原性的研究

本研究根据GenBank登录的猪瘟病毒Shimen和C株的E2基因序列设计1对特异引物,采集来自贵州的疑似猪瘟病死猪组织,提取总RNA,进行RT-PCR扩增,将扩增产物测序后进行核苷酸序列比较分析。并将RT-PCR产物克隆到pMD18-T载体上,构建重组质粒pMD18-T-E2,经双酶切鉴定、核苷酸序列分析后,将E2基因亚克隆到pET-32a(+)原核表达载体上,成功构建猪瘟病毒E2基因原核表达质粒pET-32a-E2,将构建好的原核表达质粒pET-32a-E2转化至宿主菌BL21中,诱导表达目的蛋白,表达产物经SDS-PAGE电泳、Western blot分析,得到了约58ku的条带,与预期大小相符,进一步提取、纯化目的蛋白,将目的蛋白加入弗氏佐剂免疫小鼠,免疫后采血检测抗体,结果显示目的蛋白能诱导小鼠产生一定抗体水平,该研究为猪瘟亚单位疫苗的研究奠定了基础。