犬2型腺病毒E3区缺失性表达载体的构建及外源基因表达

为构建可用于同源重组或体外重组的犬腺病毒 (canim e adenovirus,CAV) E3区缺失性表达载体 ,在克隆的 E3区两末端设计并合成了 2对突变引物 ,在引物中分别引入 1个 Bgl 酶切位点 ,以 p BE3质粒为模板 ,经 2次点突变后 ,得到含有 2个 Bgl 位点的重组质粒 p BE3M。该质粒经 Bgl 酶切后自连得到 E3区缺失的质粒 p BE3Δ。在 p BE3Δ质粒的 Bgl 位点加入接头后 ,产生含多个酶切位点的质粒 p BE3L,经相应的酶切鉴定 ,证明突变、缺失和接头连接正确后 ,利用 p BE3L 分别构建了带有和不带有外源性启动子的绿色荧光蛋白基因的重组表达质粒 ,并分别进行转染以检测其表达。结果显示 ,p BE3L CGFP质粒在转染 DK细胞后 ,于 36 h即可观察到荧光 ,72～ 96 h无明显差别 ,传 3代后仍可见表达荧光的细胞 ;而 p BE3L GFP质粒转染 DK细胞后经检测无表达。结果表明 ,构建的 E3区缺失性载体不能利用 E3区自身的启动子进行目的基因的表达 ,外源性启动子的加入是必要的。

犬2型腺病毒E3区表达载体的构建

利用构建的犬2型腺病毒E3区缺失质粒pBE3L分别构建了含有和不含外源性启动子的绿色荧光蛋白(GFP)基因和狂犬病病毒糖蛋白(Rgp)基因的重组表达质粒pBE3LGFP、pBE3LCGFP、pBE3LRgp和pBE3LCRgp,并分别对DK细胞进行了转染实验,以检测其表达,结果显示,pBE3LCGFP质粒在转染DK细胞后,于36h即可观察到荧光,72～96h无明显差别,传3代后仍可见表达荧光的细胞,pBE3LCRgp质粒转染DK细胞后,于48～96h用间接免疫荧光染色可检测到糖蛋白的表达,而pBE3LGFP和pBE3Rgp质粒转染DK细胞后经检测均无表达,表明构建的E3区缺失性载体不能利用E3区自身的启动子进行目的基因的表达,但利用外源性启动子可使外源基因获得良好表达。

鹅源腺病毒基因组E3区的鉴定和分析

在构建鹅源腺病毒Y81G4株Hind文库的基础上,通过特定的引物采用PCR方法从腺病毒文库的A片段中扩增并序列分析鉴定了腺病毒的E3区。E3区二端分别是保守性较强的pⅧ基因和纤维蛋白基因。和人腺病毒E3区相比,鹅源腺病毒E3区具有以下二个显著特征:(1)长度较短,全长仅为238个核苷酸;(2)E3区不具有明显的编码框。本研究也进一步证实了此鹅源腺病毒应归类于Ⅲ型禽腺病毒。

狂犬病毒糖蛋白基因-腺病毒E3区缺失转移表达载体的构建及表达

目的构建狂犬病毒糖蛋白基因-腺病毒E3缺失转移表达载体,并在MDCK细胞系统中高效表达。方法将含狂犬病毒SRV9株糖蛋白(Rgp)cDNA的pGT载体,经双酶切后回收Rgp基因片段,与经双酶切的真核表达载体pIRES1neo连接,得到pIRES1Rgp,再经双酶切后回收2623bp片段,与E3缺失载体pBE3L连接,得到含狂犬病毒糖蛋白基因-腺病毒E3缺失转移表达载体pBE3LCRgp,再转染MDCK细胞。结果pBE3LCRgp转染的MDCK细胞,经间接ELISA和间接免疫荧光法在其培养上清中均能检出Rgp的高效表达。结论已成功构建狂犬病毒糖蛋白基因-腺病毒E3缺失转移表达载体,并在MDCK细胞中高效表达。

犬2型腺病毒E3区的克隆及其缺失改造

为构建可用于插入外源基因的犬 2型腺病毒 (CAV - 2 )E3区表达载体 ,用KpnI对CAV - 2DNA进行酶切 ,回收含E3区的KpnIB片段并将其克隆到质粒pBluescriptIIKS(+)中 ,获得了正向和反向插入的重组质粒 ,并对E3区进行了序列测定。根据E3区两末端的序列合成了两对突变引物 ,每对引物分别在E3区的 2 4 986bp及 2 6 36 0bp处各引入一个BglⅡ酶切位点。以E3区正向插入的重组质粒pBE3- 2为模板 ,分别用两对突变引物经PCR法连续进行两次点突变 ,通过BglII酶切 ,最终筛选到在E3区的首尾两端各引入一个BglII酶切位点的突变重组质粒pBEM。利用BglII酶切将E3区切除约 1 4kb的片段 ,然后在缺失部位插入了人工接头 ,接头设计了 5个单一酶切位点 ,得到的pBE3L质粒可用于外源基因的插入。

Ⅱ型犬腺病毒C株E1、E3区克隆测序及E3区标记载体瞬时表达

设计4对引物,对犬Ⅱ型腺病毒2C(CAV-2C)株E1、E3区进行了扩增,将片段进行T克隆、测序,并构建了E3区缺失、标记EGFP的转移载体,在MDCK和293-T细胞上成功表达,但在MDCK细胞中的转染效率较低。本研究为犬腺病毒活病毒载体构建的研究提供基础。

腺病毒4型E3区核苷酸序列测定及其基因结构与功能分析

本文将Ａｄ４基因组相当于７３．３—８９．２基因图谱单位（ｍ．Ｕ．）则的ＤＮＡ片段进行了序列测定及基因结构分析，它包括了Ａｄ４Ｅ３区全基因及该区两侧的部分序列。序列分析表明，Ａｄ４Ｅ３区从ＴＡＴＡＡｂｏｘ起至该区基因结束共４７７８ｂｐ，编码１１个大于６ｋＤ的开放读码框架（ＯＲＦ）。对Ａｄ４Ｅ３区ＯＲＦ分析结果表明，Ａｄ４Ｅ３区编码的１９．３ｋ、１５ｋ和１０．４ｋ蛋白，分别与Ａｄ２Ｅ３区的ｇｐ１９ｋ、１４．７ｋ和１０．４ｋ蛋白相对应，具有非常相似的结构。Ａｄ４Ｅ３区全基因组ＤＮＡ与Ａｄ２和Ａｄ３Ｅ３区ＤＮＡ具有较高的核苷酸同源性，分别为５０％—５５％和５５％—６０％，这一数值大大超过了Ａｄ４全基因组ＤＮＡ与其他亚属的同源性（４％—２３％）。从以上分析可以看出，尽管腺病毒Ｅ３区为非必需区，但在不同型别的腺病毒中都保留着这一区域，而且具有相似的基因结构特征和较高的同源性，说明Ｅ３区在腺病毒自然感染中发挥重要作用。

犬腺病毒Ⅰ型疫苗株DNAE3区序列分析

对犬腺病毒Ⅰ型（CAV－Ⅰ）疫苗株CLL（CannughtLaboratoryLimited）DNA的E3区，pVⅢ基因和部分fiber基因进行序列测定，E3区为病毒DNA复制非必需区，因而本实验结果对构建CLLE3缺失表达载体具有重要指导意义。

2型犬腺病毒DNA不同酶酶切片段E_3区定位研究

从2型犬腺病毒的MDCK细胞培养物中提取线状双链病毒基因组DNA,利用限制性内切酶Pst Ⅰ、Bgl Ⅰ和Hind Ⅲ分别进行酶切,在1％琼脂糖凝胶上电泳,随后Southern印迹到尼龙膜上,利用Digoxin标记的2型犬腺病毒E_3区PCR产物与膜上DNA杂交,结果发现,E_3区探针分别与病毒DNA的PstIB片段、BglIAl片段和Hind ⅢA2、B2片段呈现阳性杂交反应。该结果为E_3区的克隆及犬腺病毒载体构建奠定了基础。

表达狂犬病病毒糖蛋白膜外区重组犬2型腺病毒的构建及其免疫原性研究

为研制 1种以犬 2型腺病毒为载体的狂犬病疫苗 ,以狂犬病病毒SRV9株基因组为模板 ,通过RT_PCR技术扩增得到狂犬病病毒糖蛋白膜外区序列 ;以其为目的基因构建以CMV为启动子、SV4 0polyA为终止信号的表达盒。将犬 2型腺病毒的E3区克隆入中间质粒中 ,然后对其进行部分缺失 ,并将表达盒克隆入缺失处 ,再以此重组的E3区置换犬 2型腺病毒的E3区。以重组的犬 2型腺病毒基因组转染MDCK细胞 ,最终获得了表达盒分正向和反向插入E3区的重组犬 2型腺病毒。用两株重组腺病毒免疫幼犬 ,均在犬体内产生了针对狂犬病病毒的抗体。

犬2型腺病毒通用载体的构建及鉴定

为了获得能够携带较大外源基因的犬2型腺病毒E3区缺失性载体,以犬2型腺病毒全基因组质粒pPolyⅡ-CAV-2及E3区重组质粒pVAX-E3为基础,缺失1381bp的E3区片段(92.6%的E3区全序列),插入Linker-NF(内含NotⅠ、ClaⅠ、FseⅠ多克隆位点),获得重组载体质粒pPolyⅡ-CAV-2-ΔE3(NF)(31.9kb)。以AscⅠ和PmeⅠ双酶切,游离重组基因组,在脂质体LipofectamineTM2000介导下,转染MDCK细胞系,获得了E3区缺失的重组病毒CAV-2-ΔE3(NF)。通过病毒的形态学观察,血凝性、生长特性、感染性实验证明,该重组病毒与母源病毒没有差异。重组病毒CAV-2-ΔE3(NF)可以作为载体表达外源基因,其外源基因插入片段不小于3.3kb。

一种改进的简单快速的多位点突变方法

为了在 1个基因序列内同时实现多个位点突变 ,本试验以犬 2型腺病毒 E3区为突变目的基因 ,建立了一种以多个引物多聚酶链式反应为基础的简单快速的多位点突变方法。首先根据需要在 E3区不同位置设计了与同一条链互补的 4条突变引物 ,在 4条引物 (PBGL、PNCO、PBST、PNOT)中分别引入了 Bgl 、Nco 、Bst B 和 Not 位点 ,与模板链核苷酸序列相比 ,每条引物内均包含了 2～ 3个突变的碱基 ;然后以含 CAV- 2 E3区基因的质粒为模板 ,利用高保真 DNA聚合酶、d NTPs和 5′末端磷酸化的 4条引物 ,在同一个 PCR反应管内进行突变 PCR反应 ,最后以 Dpn 消化反应管内模板链 ,取少许电激转化 E.coli DH10 B感受态细胞获得转化子。经上述 4种内切酶对转化子 DNA的酶切鉴定 ,证明获得了存在多种突变组合的突变基因 ,为进一步研究 E3区不同缺失对外源基因表达的影响奠定了基础 。

表达外源绿荧光蛋白的重组犬2型腺病毒的构建及其生物学特性分析

以pUC18载体为骨架质粒,犬2型腺病毒(canine adenovirus 2,CAV-2)Toronto A26/61株为亲本毒株,以复制非必需区E3的侧翼序列为同源重组臂,对外源基因的插入靶点E3区进行了缺失,并在缺失位置插入hCMV IE启动子、多克隆位点,增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)、SV40早期转录poly-A信号,构建了E3区缺失的转移载体pUC-△E3-EGFP。该载体与CAV-2亲本毒株共转染MDCK细胞,二者发生同源重组,经蚀斑筛选获得了表达EGFP的重组病毒rCAV-2△E3-EGFP。经鉴定重组病毒保持了亲本毒株的生物学性状并能够稳定表达外源基因,动物试验证实E3区的缺失对病毒的致病力无明显影响,为进一步开展CAV-2活载体疫苗研制及相关基础研究提供了技术平台。