小麦E3泛素连接酶TaRING1互作靶标筛选与验证

【目的】为探究TaRING1在小麦与条锈菌互作过程中的作用,解析其作用机理,为小麦条锈病的绿色防控提供理论依据。【方法】利用酵母双杂交技术筛选TaRING1的互作靶标蛋白,并通过荧火素酶互补实验(LCA)及双分子荧光互补(BiFC)验证互作,通过泛素化实验对TaRING1的泛素功能进行验证,通过烟草瞬时表达及小麦原生质体转化分析靶标TaRIP92的亚细胞定位。【结果】以TaRING1作为诱饵,利用酵母双杂交技术筛选到互作靶标TaRIP92,并通过LCA及BiFC验证TaRING1与TaRIP92互作,通过体外泛素化实验证明TaRING1可以泛素化底物TaRIP92,烟草瞬时表达及小麦原生质体转化发现TaRIP92蛋白定位于线粒体。【结论】TaRING1通过与线粒体蛋白TaRIP92互作并对其进行泛素化。

甜菜应答盐胁迫的E3泛素连接酶UPL家族基因的鉴定与分析

甜菜为二年生草本植物,是我国重要的糖料作物,广泛种植于我国东北、西北和华北等地区。本文以甜菜T710-Mu品系为试验材料,利用盐胁迫下的甜菜转录组数据库,通过建立隐马尔科夫模型筛选数据库得出3个响应盐胁迫的含有HECT结构域的UPL(Ubiquitin-protein ligase)家族基因。对3个UPL家族基因编码的蛋白质BvUPL3、BvUPL4和BvUPL5进行蛋白质理化性质预测、进化关系分析、蛋白质保守结构域分析和蛋白质互作网络等生物信息学分析。预测BvUPL3、BvUPL4和BvUPL5分别分布在Chr09、Chr07和Chr08,并且具有典型的HECT型结构域,鉴定得到的编码E3泛素连接酶UPL基因属于UPL家族基因。蛋白质互作预测结果表明,这些UPL蛋白质之间存在相互作用,并可能与泛素蛋白酶体系统中其他组分,如泛素藕合因子、E2共价结合酶以及26S蛋白酶体等相互影响。结合荧光定量PCR和转录组数据结果可知,BvUPL3基因在叶片和根部的相对表达量与对照组相比显著上升,BvUPL4和BvUPL5基因的相对表达量与对照组相比在叶片中显著下调,在根部显著上升,这些结果可为后续深入研究甜菜泛素连接酶提供理论基础。

E3泛素连接酶在结直肠癌中的作用机制研究进展

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)作为全球发病率和致死率最高的恶性肿瘤之一,其致病机制十分复杂,至今尚未完全阐明。泛素化在CRC的发生发展过程中扮演重要角色,其调控作用主要依赖于E3泛素连接酶泛素化修饰底物蛋白使之活性改变或发生泛素—蛋白酶体降解。该文就RING(really interesting new gene)型和HECT(homologous to E6AP C-terminus)型E3泛素连接酶在CRC细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及化疗敏感性中的作用机制及这两类E3泛素连接酶的靶向抑制剂相关研究进展作一综述,为CRC致病机制研究及其靶向治疗提供新的思路。

大豆E3泛素连接酶基因GmHOS1a和GmHOS1b生物信息学分析和敲除载体构建

HIGH EXPRESSION OF OSMOTICALLLY RESPONSIVE GENES 1(HOS1)是植物中多种信号途径的整合因子,在植物发育、胁迫反应、光形态建成和开花调控中发挥至关重要的作用,是很有潜力的作物工程育种目标基因,但其在大豆中的功能尚未被揭示。为了揭示其在大豆中的功能,本研究利用反向遗传学,成功克隆了两个大豆HOS1基因,GmHOS1a和GmHOS1b,并通过生物信息学技术,对其蛋白结构、表达模式和功能进行了分析。进化树和结构域分析表明,GmHOS1a和GmHOS1b具有N端的环指结构域和与ELYS高度相似的保守基序,与拟南芥和水稻HOS1蛋白高度同源。亚细胞定位结果显示,GmHOS1a和GmHOS1b定位在细胞核中。Quantitative Real-time PCR(qRT-PCR)结果表明,GmHOS1a和GmHOS1b的基因表达模式相似,均在三出复叶中高度表达。48 h光周期RNA-sequencing(RNA-seq)和qRT-PCR分析表明,GmHOS1a和GmHOS1b基因的表达具有生物钟昼夜节律性,其中GmHOS1a的表达量显著高于GmHOS1b,GmHOS1a见光后表达量升高,黑暗前表达量达到峰值。为进一步探索GmHOS1a和GmHOS1b蛋白的功能,利用CRISPR/Cas9系统构建了9个GmHOS1a和GmHOS1b基因敲除载体,通过发根检测实验,筛选出6个高效工作载体,可供后续遗传转化实验使用。本研究为阐明该基因的功能和作用机理奠定了理论基础,并提供了可供遗传转化的载体材料。

青花菜E3泛素连接酶基因的克隆及表达分析

为探讨泛素蛋白酶体在高温胁迫下参与蛋白质降解途径相关的生理过程和功能,以青花菜‘KUQ19⁃27’为试验材料进行高温胁迫(38℃)处理,设计特异性引物从青花菜中克隆得到青花菜E3泛素连接酶基因并进行生物学信息分析,并运用实时荧光定量PCR技术分析其表达特征.结果显示:E3泛素连接酶基因的ORF长度为1332 bp,编码443个氨基酸,相对分子量为48.3 kD.亲疏水性分析结果表明:在多肽链中第207位氨基酸时,亲水性最高,为3.38;在肽链中第280位氨基酸时,疏水性最高,为-4.23,是疏水性蛋白.在青花菜E3泛素连接酶基因氨基酸序列中,其C、Y、S值均小于0.5,由此预测其不具有信号肽,不属于分泌蛋白.系统进化分析表明青花菜E3泛素连接酶基因与其他物种,比如拟南芥、草莓、月季、葡萄等苷核酸序列相似性都在60%以上,同甘蓝、油菜、白菜和拟南芥的进化关系较近,同草莓、月季、菜豆、葡萄、刺菜蓟、芝麻和水桔梗的进化关系较远,与其他物种,如拟南芥、草莓、月季、葡萄等核苷酸序列相似性都在60%以上.荧光定量PCR技术结果表明高温处理3 h时,青花菜E3泛素连接酶基因表达量下调30%,胁迫12 h时表达量持续下降仅为对照的20%.研究结果可为进一步深入探讨青花菜E3泛素连接酶的高温胁迫响应机制提供一定的理论依据.

‘无子瓯柑’E3泛素连接酶基因CsRNF217对转基因烟草育性的影响

【目的】为了验证‘无子瓯柑’Citrus suavissima‘Seedless’E3泛素连接酶基因CsRNF217对雄蕊育性的影响,采用异源转化获得过表达CsRNF217的转基因烟草Nicotiana tabacum,分析其对烟草育性的影响。【方法】采用亚历山大染色法、花粉离体培养法、杂交授粉后的结实率分析野生型烟草及转基因烟草自交1代(T1)阳性株系的花粉活力及胚囊育性,利用半定量RT-PCR分析基因CsRNF217在转基因烟草T1阳性株系花药中的表达强弱。【结果】‘无子瓯柑’CsRNF217在转基因烟草自交T1株系中高效表达,转基因株系的花粉染色活力和离体萌发率、自交结实率、以及与野生型的正反交结实率均显著低于野生型(P<0.05)。【结论】过表达CsRNF217的烟草植株花粉育性显著下降,同时伴随胚囊育性下降的现象,推测CsRNF217基因对‘无子瓯柑’雌雄育性存在负向调控的作用。

E3泛素连接酶的结构功能及其在肿瘤中的最新研究进展

E3泛素连接酶是泛素-蛋白酶体系统中不可缺少的一大类酶,根据催化核心结构域可分为HECT E3s、 U-box E3s、RING E3s三大家族,其中RING E3s又可分为TRIM、PA-TM-RING、RBR、MARCH和UIM五个家族。真核生命的一切生物行为都离不开泛素的修饰,而E3泛素连接酶则通过介导泛素-E2泛素连接酶将泛素传递给靶蛋白,能严格控制泛素化反应。因此,E3泛素连接酶可能参与调节细胞增殖等生物过程和细胞对与癌症发展相关的应激信号的反应,可以成为多种癌症治疗的有希望的靶点。因此,本文对E3泛素连接酶的分类、功能及在肿瘤中的作用进行综述。

E3泛素连接酶ARIH1功能的研究进展

ARIH1是一种新发现的E3泛素连接酶,属于RBR家族,具有多种生物学功能,并与许多疾病的发生发展密切相关,如参与调控癌组织的进展,抑制细菌病毒等的增殖,调节代谢等,但仍有很多功能及机制有待研究人员去挖掘和探索。文章旨在对近年ARIH1蛋白的功能研究进展进行综述,为研究人员提供可能的研究方向和目标。

E3泛素连接酶RFWD家族成员在肿瘤中的作用研究进展

环指和WD重复结构域(RING Finger and WD Repeat Domain,RFWD)蛋白属于E3泛素连接酶,在细胞增殖、凋亡和DNA损伤修复的调控中发挥重要作用。越来越多的证据表明,RFWD蛋白通过靶向其底物泛素化降解参与肿瘤的发生发展。RFWD蛋白在不同类型的人类恶性肿瘤中具有抑癌和促癌的不同作用,可能与其底物蛋白的功能有关。本文分析了RFWD蛋白家族成员(RFWD1,RFWD2,RFWD3)的结构和功能,总结了RFWD蛋白家族成员的已知底物,并阐明其在不同肿瘤中的不同功能。此外,本文还讨论了RFWD家族成员作为癌症治疗潜在靶点的可能及策略。

拟南芥中RING型E3泛素连接酶基因AtGW2的克隆和功能分析

水稻R ING型E3泛素连接酶基因O sGW2在调控水稻产量性状方面起着十分重要的作用。根据O sGW2的cDNA序列,通过RT-PCR方法从拟南芥中克隆了一个与O sGW2同源的基因,命名为AtGW2。序列分析表明,该基因编码一个R ING-C2型E3泛素连接酶蛋白,含有401个氨基酸。通过构建AtGW2RNA干扰植物表达载体并转化拟南芥,结果表明,获得的转基因后代植株的子粒较野生型大,并且转基因拟南芥子粒千粒重高于野生型,这表明AtGW2负调控拟南芥子粒大小及粒重。

向日葵E3泛素连接酶基因克隆及表达分析

该研究从向日葵中克隆了E3泛素连接酶基因HERC2,并进行了生物信息学分析和不同胁迫条件的表达分析。序列分析表明,HERC2(登录号为KT832066)序列的CDS为1 608bp,编码535个氨基酸,预测其分子量131kD,等电点为5.03。HERC2编码的蛋白质为疏水性蛋白质,且为细胞质蛋白;亚细胞定位预测分析表明,向日葵HERC2可能定位在高尔基体中;该蛋白质有5个RCC1保守结构域。向日葵HERC2与已报道的其他植物同源蛋白有相似的保守区域,与醉蝶花亲缘关系最近,而与大豆和野生大豆的亲缘关系最远。与HERC2cDNA对应的gDNA(登录号为KT832067)的ORF长度为3 409bp,与cDNA编码序列比对结果表明,该gDNA由5个外显子和4个内含子组成。实时荧光定量PCR分析表明,向日葵HERC2基因表达受非生物胁迫调节,在不同器官及不同非生物胁迫下存在特异性表达差异。研究认为,HERC2基因应答逆境胁迫具有其特定的表达模式,研究结果为加强对HERC2的利用奠定了基础。

向日葵E3泛素连接酶基因的分析定位和表达鉴定

该研究利用前期获得的向日葵耐盐相关基因E3泛素连接酶基因序列(HERC2),构建瞬时表达载体Cam-35S-HERC2-GFP,采用基因枪法转化洋葱表皮细胞进行亚细胞定位;采用RT-PCR技术,分析盐胁迫下HERC2在耐盐品种P50和盐敏感品种P29根、下胚轴和叶中的表达差异;构建HERC2植物表达载体pPZP221-HERC2,采用农杆菌介导法将HERC2导入烟草,进行耐盐功能验证。结果表明:(1)HERC2蛋白定位在细胞膜、细胞质和细胞核中。(2)受到NaCl胁迫后,HERC2基因在耐盐品种P50和盐敏感品种P29中均上调表达,但耐盐品种中的表达量较高。(3)HERC2基因的表达,能够提高转基因烟草的耐盐性。该研究结果为进一步解析向日葵对盐胁迫的响应机制,以及耐盐新品种的选育奠定了基础。

E3泛素连接酶Siah-1与糖尿病血管内皮损伤的关系研究

目的探讨E3泛素连接酶Siah-1与糖尿病血管内皮损伤的关系。方法器官浴槽和血管张力系统测定雄性C57BL/6小鼠,以及雄性db/db糖尿病小鼠的离体胸主动脉血管张力;蛋白质印迹法(Western blot)和酶联免疫吸附法(ELISA)测定小鼠Siah-1和连环蛋白(β-catenin)水平。结果糖尿病小鼠离体胸主动脉血管对乙酰胆碱(Ach)引发的舒张反应低于正常小鼠(t=24.270,P=0.000),Siah-1抑制剂孵育30 min的糖尿病小鼠对Ach引发的舒张反应与正常小鼠无明显差异(t=1.991,P=0.327)。各组小鼠对硝普钠(SNP)引发的血管舒张呈现良好的反应,差异无统计学意义(F=0.145,P=0.541)。经Siah-1抑制剂处理的糖尿病小鼠Siah-1浓度明显降低(t=5.483,P=0.017),而β-catenin浓度明显升高(t=6.670,P=0.023)。在有β-catenin抑制剂的情况下,使用Siah-1抑制剂的糖尿病小鼠血管内皮舒张反应明显低于正常小鼠(t=1.441,P=0.378)。结论 E3泛素连接酶Siah-1参与了糖尿病血管内皮损伤的过程,其机制可能与对β-catenin信号通路的影响有关。

蒺藜苜蓿E3泛素连接酶U-box基因克隆及表达分析

泛素化在植物生长和发育过程中起重要作用,E3泛素连接酶负责对靶蛋白特异性识别,其中U-box结构的E3泛素连接酶具有调控植物生长发育和免疫反应等功能,并在抗逆性方面发挥作用。目前,关于蒺藜苜蓿U-box家族基因的研究尚未见报道。本研究从蒺藜苜蓿中克隆得到U-box(MtPUB4)基因,该基因cDNA全长2448bp,编码815个氨基酸,包括1个U-box结构(C-X2-H-X7-C-X7-C-X2-C-H-X2-H)和5个ARM结构域,属于U-box/ARM类型E3泛素连接酶。构建原核表达载体pET-MtPUB4,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)表明在大肠杆菌中表达了MtPUB4蛋白。荧光定量PCR分析表明MtPUB4基因在蒺藜苜蓿花中的表达量最高,在根中表达量最低。MtPUB4基因受到NaCl、聚乙二醇、脱落酸诱导,随着诱导时间增加,表达量呈现出增长趋势。这些结果表明,MtPUB4基因在蒺藜苜蓿生长发育和抗逆性中可能起到重要调节作用,但在低温胁迫中表达量稍微下降,变化不明显。本研究成功构建了pBI121-MtPUB4植物表达载体,为进一步转化拟南芥突变体Atpub4奠定了基础。

E3泛素连接酶在卵巢癌中作用的研究进展

卵巢癌是全球第一致死的妇科肿瘤。E3泛素连接酶家族是泛素-蛋白酶体系统的重要成分,此家族包括很多蛋白质,可催化多种蛋白底物的泛素化,促进其被蛋白酶体系统降解。迄今为止,E3泛素连接酶在多种肿瘤细胞生物学过程中均发挥着重要作用,包括细胞增殖、凋亡及周期调控等。本文现就不同E3泛素连接酶在卵巢癌中的作用及相关的靶向治疗做一综述。

铁观音茶树RING型E3泛素连接酶基因克隆及其干旱胁迫下的表达分析

以铁观音茶树为试材,对其中E3泛素连接酶基因进行克隆和生物信息学分析,并采用qPCR进行不同干旱条件下的定量表达分析。研究结果表明,该序列全长为1 138bp,开放阅读框(ORF)为810bp,编码269个氨基酸(GenBank登录号KR819177)。生物信息学分析发现该铁观音茶树E3泛素连接酶基因不含跨膜结构以及信号肽,具有多个磷酸化位点,亚细胞定位于叶绿体中。经BLAST比对,该基因编码的氨基酸序列与烟草、亚麻荠、葡萄、醉蝶花、芜菁中的E3泛素连接酶基因编码的氨基酸序列分别有51%、50%、50%、50%和49%的同源性,且相关保守功能结构域翻译的蛋白质序列具有RING-finger结构,初步确定该基因为铁观音茶树的E3泛素连接酶基因。qPCR分析结果显示在不同干旱胁迫处理下铁观音茶树的E3泛素连接酶基因的表达量,与对照组相比显著增加。本研究认为铁观音茶树RING型E3泛素连接酶基因参与茶树抗旱响应机制。

具有E3泛素连接酶功能的痘病毒蛋白质

泛素化是蛋白质的翻译后共价修饰过程,可以调节蛋白质的稳定性,涉及多种生理功能。痘病毒在进化过程中形成了扰乱和操纵宿主细胞泛素系统的多种机制,包括编码多种能干扰宿主泛素系统的病毒蛋白质。近年的研究表明痘病毒编码许多具有泛素连接酶活性的蛋白质,如膜相关RING-CH(MARCH)结构域蛋白、p28/Really Interesting New Gene(RING)finger蛋白、锚蛋白重复序列/F-box蛋白、Bric-a-Brac Tramtrack Broad complex(BTB)/Kelch蛋白及APC家族蛋白等。作者在本文着重阐述了痘病毒编码的E3泛素连接酶功能蛋白的研究概况。

E3泛素连接酶介导泛素化修饰在炎症性肠病中的作用机制研究

泛素化是重要的蛋白质翻译后修饰方式,主要效应包括蛋白质的降解和功能调节。研究提示,泛素化异常参与了炎症性肠病(IBD)的发生和发展,一些泛素酶及其抗体有望成为克罗恩病(CD)临床诊断和评估病情严重程度的重要标志物。本文就E3泛素连接酶介导泛素化修饰在IBD中的作用机制研究作一综述。

E3泛素连接酶调控GA、ABA影响种子萌发综述

赤霉素(GA)和脱落酸(ABA)在植物种子萌发过程中存在着拮抗作用,两者间平衡关系的变化是维持和打破种子休眠的主要调控机制。E3泛素连接酶在种子萌发过程中起到重要的调节作用。从E3泛素连接酶的分类、作用部位和它们在种子萌发过程中参与脱落酸和赤霉素信号转导的作用机制,以及与其他基因的互作等方面展开论述,发现E3泛素连接酶可以通过影响GA和ABA信号通路成员的蛋白质活性、定位和基因互作来精确地调控GA和ABA信号转导,从而影响种子休眠与萌发。此外,GA和ABA都存在“解除抑制”信号传导模式,因此,今后在相关研究中可以利用E3泛素连接酶解除ABA对种子萌发的抑制,提高GA对种子萌发的促进作用,达到提高出芽率,培养优质种苗的生产目的;或者在成熟种子储存过程中利用E3泛素连接酶解除GA对种子萌发的促进作用,维持ABA对种子的休眠作用,延长粮食作物等的储藏期。

E3泛素连接酶Arkadia的结构特征、生物学功能及其在疾病发生发展中的作用

蛋白泛素化是一种重要的转录后修饰过程,可与蛋白酶体一起识别并降解未折叠蛋白及多余蛋白.E3泛素连接酶Arkadia由RNF-111基因所编码,决定了靶蛋白底物的特异性,是泛素化过程中起决定作用的关键酶.近年来研究发现,Arkadia可以通过泛素化降解细胞内蛋白而发挥增强转化生长因子β信号通路的作用.本文回顾了Arkadia的最新研究进展,对其基本特征、生物学功能及其在疾病发生发展中的作用综述如下.