基于PERK-eIF2α-NF-κB信号通路研究苁蓉散治疗阿尔茨海默病的作用机制

目的基于PERK-eIF2α-NF-κB信号通路研究苁蓉散治疗阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的作用机制。方法将60只SD大鼠分为正常组,模型组、苁蓉散组(4.62、9.24、18.48 g·kg-1)和安理申组,每组10只。除正常组外其余大鼠组予双侧海马注射Aβ1-42建立AD模型。灌胃结束后进行水迷宫行为学检测学习记忆能力;尼氏染色观察神经元及尼氏小体变化;免疫荧光检测NF-κB核转移情况;透射电镜观察大鼠海马区内质网形态;酶免疫测定Aβ1-42及炎症因子含量;Western blot检测PERK、eIF2α、NF-κB的蛋白表达水平。结果水迷宫结果显示,苁蓉散能提高AD大鼠的逃避潜伏期时间、增加穿越求生平台次数、延长目标象限停留时间(P<0.05或P<0.01);尼氏染色结果显示,苁蓉散各剂量组神经元细胞排列较整齐,胞核存在,尼氏小体较为丰富;免疫荧光表明,苁蓉散可降低AD大鼠脑内NF-κB入核表达(P<0.05或P<0.01);透射电镜结果显示,苁蓉散各剂量组内质网形态整齐、未见明显扩张,结构正常;ELISA结果表明,苁蓉散可降低AD海马中的Aβ1-42,IL-1,TNF-α的含量;Western blot结果显示,苁蓉散各剂量组p-PERK/PERK,p-eIF2α/eIF2α,p-NF-κB p65/NF-κB p65的蛋白比值明显下降(P<0.05或P<0.01)。结论苁蓉散可通过抑制PERK-eIF2α-NF-κB信号通路的活化,缓解神经元细胞ERS状态下免疫炎症反应,以改善AD大鼠的认知功能。

内质网应激PERK-eIF2α-AFT4-CHOP信号通路在血液肿瘤中的研究进展

在生理状态下,内质网主要负责蛋白质的生物合成和成熟。然而,当机体稳态受到内外因素干扰破坏后,引发内质网中未折叠和错误折叠蛋白的累积,进而诱导产生内质网应激和未折叠蛋白反应(UPR)。在内质网应激条件下,未折叠蛋白反应可通过不同途径来维持细胞内稳态,其中活化蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)是其重要途径之一。活化的PERK使真核翻译起始因子2亚基α(eIF2α)磷酸化,引发活性转录因子4(ATF4)选择性翻译,并与促凋亡转录因子C/EBP同源蛋白(CHOP)的启动子直接结合诱导细胞凋亡。该信号通路也是UPR参与血液肿瘤细胞和免疫细胞调节的重要机制之一。本文阐述了PERK-eIF2α-ATF4-CHOP信号通路在血液肿瘤中的研究进展,以及靶向该信号通路在血液肿瘤治疗中的潜在价值。

FABP4沉默通过调节PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路对妊娠糖尿病大鼠内质网应激和胰岛素抵抗的影响

目的:探讨脂肪酸结合蛋白4(FABP4)沉默通过调节蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)/真核细胞启动因子2α(eIF2α)/转录因子4(ATF4)/C/EBP同源蛋白(CHOP)信号通路对妊娠糖尿病(GDM)大鼠内质网应激(ERS)和胰岛素抵抗(IR)的影响。方法:腹腔注射链脲佐菌素(STZ)建立GDM大鼠模型。通过尾静脉注射FABP4 siRNA质粒(si-FABP4)、阴性对照质粒(NC)和PERK激活剂(CCT020312),将大鼠随机分为Normal组、GDM组、GDM+NC组、GDM+si-FABP4组、GDM+si-FABP4+CCT020312组。检测胰腺组织中FABP4含量、血脂水平、炎症标志物水平和氧化应激标志物水平,检测胰腺组织中PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路相关蛋白表达。HTR-8/SVneo细胞分为5组:对照(Control)组、高糖(HG)组、HG+NC组、HG+si-FABP4组、HG+si-FABP4+CCT020312组,24 h后检测细胞中FABP4及PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路相关蛋白表达。结果:与Normal组相比,GDM组大鼠血清和胰腺组织中FABP4水平显著上调(P<0.05)。FABP4沉默显著降低了FBG和IR,并伴有血脂、CRP、TNF-α、IL-6及MDA水平降低和SOD、CAT水平升高(P<0.05)。此外,FABP4沉默减轻了胰腺和胎盘组织损伤。而CCT020312上调PERK、eIF2α磷酸化水平和ATF4、CHOP蛋白表达后,FABP4沉默对GDM大鼠IR、炎症、氧化应激以及胰腺和胎盘损伤的抑制作用均被逆转(P<0.05)。FABP4在HG诱导的HTR-8/SVneo细胞中上调表达,沉默FABP4可抑制PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路蛋白表达,CCT020312则逆转这种变化(P<0.05)。结论:FABP4沉默通过抑制炎症和氧化应激,改善GDM大鼠的IR和ERS,其机制与抑制PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路有关。

基于PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路探讨健骨颗粒对UMR-106细胞内质网应激凋亡的影响

目的探讨健骨颗粒含药血清对UMR-106成骨样细胞内质网应激ERS凋亡的影响和作用机制。方法选用UMR-106成骨样细胞,采用0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05μmol/L不同浓度的GSK2606414(PERK抑制剂)对细胞进行干预,采用CCK8法筛选GSK2606414最佳干预浓度。将生长状态较好的UMR-106细胞随机分为阴性对照组(NC组)、模型组(H_(2)O_(2)组)、健骨颗粒组(H_(2)O_(2)+JG组)和阳性对照组(H_(2)O_(2)+GSK2606414组)4组。NC组和H_(2)O_(2)组采用10%生理盐水血清干预12 h,H_(2)O_(2)+JG组采用10%健骨颗粒含药血清干预12 h,H_(2)O_(2)+GSK2606414组采用0.03μmol/L的GSK2606414和10%生理盐水血清干预12 h,除NC组外,其余各组在不更换新培养基的情况下,再分别加入10μmol/L H_(2)O_(2)干预12 h。采用激光共聚焦显微镜观察细胞内NC组和H_(2)O_(2)组GRP78和Caspase-12荧光表达情况,DCFH-DA检测活性氧(ROS)含量,激光共聚焦显微镜观察细胞内钙离子实时动态变化判断ROS/ERS模型是否成立。再采用An⁃nexin V-FITC/PI检测4组细胞晚期凋亡率,qPCR和Western blot检测4组ERS相关标志指标GRP78、PERK、eIf2α、ATF4和CHOP mRNA转录水平和蛋白相对表达量。结果与0μmol/L组比较,0.03μmol/L的GSK2606414是干预UMR-106细胞12 h后对细胞活力没有影响的最大浓度,故使用该浓度作为后续H_(2)O_(2)+GSK2606414组的实验干预条件。与NC组相比,H_(2)O_(2)组ROS含量显著增高(P<0.01),GRP78和Caspase-12的蛋白荧光表达量明显增加,细胞内钙离子流动速度加快并持续增高,表明H_(2)O_(2)诱导UMR-106细胞ROS/ERS模型的成功建立。与NC组相比,H_(2)O_(2)组凋亡率显著增高(P<0.05),GRP78、PERK、eIf2α、ATF4、CHOP mRNA转录水平和蛋白相对表达量均显著增高(P<0.01)。与H_(2)O_(2)组相比,H_(2)O_(2)+JG组和H_(2)O_(2)+GSK2606414组ROS含量显著降低(P<0.01),凋亡率显著降低(P<0.05),GRP78、PERK、eIf2α、ATF4、CHOP mRNA转录水平(P<0.05)和蛋白相对表达量(P<0.01)均显著降低。结论健骨颗粒可通过PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路缓解内质网过度应激,降低成骨细胞凋亡率,发挥防治绝经后骨质疏松症的作用。

基于PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路探讨四味黄芪散对高原低氧致脑损伤大鼠的保护作用及机制

目的基于PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路探讨四味黄芪散(藏黄芪、藏红花、川芎、沉香)对高原低氧致脑损伤大鼠的保护作用及机制。方法将SD大鼠随机分为空白组、模型组、阳性药物组(诺迪康,0.125 g·kg^(-1)·d-1)以及四味黄芪散低、中、高剂量组(3.255、6.510、13.020 g·kg^(-1)·d-1),每组10只。四味黄芪散各剂量组灌胃给药,每日1次,连续14 d;阳性药物组给予诺迪康灌胃给药,每日1次,连续给药7 d。采用实验动物低压模拟舱复制高原低氧致脑损伤大鼠模型,低氧暴露持续7 d。采用HE染色法观察大鼠脑组织病理变化;TUNEL染色法检测大鼠脑组织细胞凋亡情况;TBA法、微板法分别检测脑组织中丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)的水平;Western Blot法检测大鼠脑组织中p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表达水平;RT-qPCR法检测大鼠脑组织中PERK、eIF2α、ATF4、CHOP mRNA表达水平。结果与空白组比较,模型组大鼠海马CA1区锥体细胞水肿,排列不规则,胞质疏松淡染;海马CA1区红色荧光强度显著增强(P<0.01);脑组织中MDA含量显著升高(P<0.01),GSH活性显著降低(P<0.01);脑组织中p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表达水平显著升高(P<0.01),PERK、eIF2α、ATF4、CHOP mRNA表达显著上调(P<0.01)。与模型组比较,阳性药物组及四味黄芪散高、中、低剂量组大鼠海马CA1区锥体细胞排列紧密,边界较清,细胞水肿得到改善;海马CA1区的红色荧光强度明显减弱(P<0.05);脑组织中MDA含量显著降低(P<0.01),GSH活性显著升高(P<0.05,P<0.01)。四味黄芪散高、中剂量组大鼠脑组织中p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表达水平显著降低(P<0.05,P<0.01),PERK、eIF2α、ATF4、CHOP mRNA表达显著下调(P<0.05,P<0.01);四味黄芪散低剂量组大鼠脑组织中p-eIF2α/eIF2α、CHOP蛋白表达水平显著降低(P<0.05,P<0.01),eIF2α、CHOP mRNA表达显著下调(P<0.05,P<0.01)。结论四味黄芪散能改善高原低氧致脑损伤大鼠的脑组织神经元细胞水肿,增强抗氧化应激能力,减少脑组织细胞凋亡,可能与其调控PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路抑制内质网应激有关。

抵当汤对脑出血大鼠eIF2α、p-eIF2α及CHOP蛋白表达的影响

目的讨论抵当汤对脑出血大鼠的内质网应激损伤而导致的神经细胞凋亡相关的信号蛋白真核细胞起始因子(eIF2α)、磷酸化真核细胞起始因子(p-eIF2α)及特异性蛋白C增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)表达的影响。方法以健康的Wistar大鼠60只作为研究对象,采用自体血注射尾状核的方法制作大鼠脑出血模型,将大鼠随机分为5组:假手术组、模型组,以及抵当汤低、中、高剂量组,每组 12只。采用免疫蛋白印记(western blot)方法,比较各组eIF2α、p-eIF2α及CHOP蛋白在脑出血半暗带区的动态表达;采用Longa五级评分法对几组大鼠进行神经功能评分;采用Billot公式计算法测定出脑出血半暗带的脑含水量。结果与模型组比较,抵当汤组p-eIF2α及CHOP蛋白表达降低;与模型组比较,抵当汤组大鼠神经功能评分较模型组低;与模型组比较,抵当汤组大鼠脑含水量较模型组低。结论抵当汤可以通过下调p-eIF2α及CHOP蛋白的表达,抑制与细胞凋亡相关的信号通路的活化,从而抑制过度的内质网应激损伤,对脑出血半暗带区的神经细胞有保护作用,从而减轻凋亡。

家蚕eIF2α全长cDNA克隆及生物信息学分析

目的克隆家蚕eIF2α全长cDNA,分析家蚕抗BmDNV-Z品系、感性品系eIF2α的点突变。方法利用荧光差异显示技术,在易感浓核病毒中国镇江株(BmDNV-Z)的家蚕品系华八中获得感性特异条带G13-1b650,通过电子延伸,设计特异引物验证。结果克隆了家蚕eIF2α(BmeIF2α)全长cDNA。其全长为1100bp(GenBank登录号:DQ073458),ORF框为999bp,编码332个氨基酸。BmeIF2α蛋白与草地贪夜蛾eIF2α蛋白同源性高达94.3%。具有保守的磷酸化位点S(51)R(52)R(52)R(54)R(56)K(60)R(63)。BmeIF2α有推定的3个蛋白激酶C磷酸化、5个酪氨酸激酶磷酸化、9个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化、3个依赖cAMP与cGMP蛋白激酶磷酸化位点,2个酪氨酸硫酸盐化位点,1个糖基化位点。结论家蚕易感品系的eIF2α在113～127位的“HVAELLHYETSEQSE”为酪氨酸硫酸盐化位点,而完全抗性品系eIF2α发生C378→T突变,导致Ser126→Leu,缺少了113～127位的酪氨酸硫酸盐化位点。

远隔缺血预适应对脑缺血再灌注损伤大鼠缺血半暗带区PERK/p-eIF2α通路及自噬的影响

目的研究远隔缺血预适应(remote ischemic preconditioning, RIPC)对局灶性脑缺血再灌注大鼠缺血半暗带区自噬相关蛋白Beclin1、LC3B以及内质网分子伴侣GRP78、内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)相关通路PERK/p-eIF2α的影响,探讨RIPC保护脑缺血损伤作用的相关机制。方法将24只健康雄性Sprague-Dawley大鼠采用抽签法随机分为3组:假手术(Sham)组、大脑中动脉梗塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)组和RIPC+MCAO组。每组8只大鼠。采用改良线栓法制备大鼠MCAO再灌注模型,于缺血90 min后拔出线栓再灌注24 h。其中RIPC+MCAO组在MCAO之前,给予大鼠连续3 d的RIPC(采用夹闭双侧股动脉10 min开放10 min,每天3个循环的方法)。免疫荧光双标染色法检测再灌注大鼠缺血半暗带区自噬相关蛋白Beclin1、LC3B以及GRP78、p-eIF2α的表达。结果 1)Sham组大鼠脑内偶见Beclin1阳性细胞。MCAO组大鼠再灌注24 h缺血半暗带区Beclin1表达水平比Sham组显著升高(P<0.05)。给予RIPC的脑缺血再灌注大鼠半暗带区Beclin1的表达水平比MCAO组显著减少(P<0.05)。Beclin1与神经元标志物NeuN共定位。2)MCAO组大鼠再灌注24 h,脑缺血半暗带区GRP78分别与Beclin1和LC3B免疫荧光染色共定位。3)MCAO组大鼠再灌注24 h,脑缺血半暗带区Beclin1与p-eIF2α免疫荧光染色共定位。Sham组大鼠未见Beclin1和p-eIF2α双标阳性细胞,MCAO组大鼠再灌注24 h半暗带区可见大量Beclin1和p-eIF2α双标阳性细胞。给予RIPC后,缺血大鼠半暗带区Beclin1和p-eIF2α双标阳性细胞数目比MCAO组明显减少(P<0.05)。结论 RIPC可能通过抑制ERS相关通路PERK/p-eIF2α,减少神经元中自噬相关蛋白产生,避免神经元过度激活自噬,发挥对脑缺血再灌注损伤的保护作用。

针刺对实验性脑缺血大鼠内质网未折叠蛋白反应通路eIF2α基因表达的影响

目的:观察针刺百会、内关穴对大脑中动脉阻塞(MCAO)大鼠未折叠蛋白反应(UPR)通路eIF2α因子基因表达的影响,探讨针刺抑制细胞凋亡、保护脑神经元的内在机制。方法:将SD大鼠60只随机分为捆绑组、假手术组、模型组、针刺组、依达拉奉组,每组12只。线栓法制备MCAO大鼠脑缺血再灌注模型,RT-PCR法检测缺血侧顶叶大脑皮层eIF2α基因表达变化。结果:与捆绑组和假手术组比较,模型组、针刺组及依达拉奉组eIF2α表达明显增高(P<0.01或P<0.05);与模型组比较,针刺组及依达拉奉组eIF2α基因表达显著降低(P<0.01);与依达拉奉组比较,针刺组eIF2α表达变化差异无统计学意义(P>0.05)。结论:针刺可以下调脑缺血大鼠未折叠蛋白反应通路eIF2α因子基因的表达,这可能是针刺发挥脑保护作用的内在机制之一。

siRNA靶向抑制eIF2α基因对非酒精性脂肪性肝病自噬及凋亡的影响

目的探讨siRNA靶向抑制eIF2α基因对非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)细胞模型自噬及凋亡的影响。方法体外0.6 mmol/L油酸诱导HepG2细胞脂质沉积建立NAFLD细胞模型,将HepG2细胞分为对照组、模型组、eIF2α-siRNA干扰组、NC-siRNA干扰组。油红O观察各组细胞内脂滴分布。采用Real-time PCR检测各组细胞eIF2αmRNA表达情况。LC3质粒标记绿色荧光蛋白(GFP-LC3)转染HepG2细胞后,荧光显微镜下观察细胞内绿色点状聚集的自噬小体分布,Honchst 33258染色观察细胞凋亡情况。Western blotting检测自噬、凋亡相关蛋白P62、LC3Ⅱ、Beclin-1、Bcl-2、Bax、Caspase-3及p-eIF2α、eIF2α的表达。结果Real-time PCR及Western blotting实验表明,与对照组相比,模型组eIF2α蛋白及mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05);与模型组相比,eIF2α-siRNA干扰组eIF2α蛋白及mRNA表达明显下降。与对照组相比,模型组p-eIF2α表达增加;与模型组相比,eIF2α-siRNA干扰组p-eIF2α表达明显下降。荧光显微镜观察提示,与对照组相比,模型组自噬体数量明显降低;与模型组相比,eIF2α-siRNA干扰组自噬体数量明显增加。Hoechst 33258染色分析提示,与对照组相比,模型组凋亡率明显增加;与模型组相比,eIF2α-siRNA干扰组凋亡率明显减少。Western blotting检测提示,与对照组相比,模型组细胞Bax、P62、Caspase-3蛋白表达均增加,而Bcl-2、Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均降低(P均<0.05),经过eIF2α-siRNA干扰后,eIF2α-siRNA干扰Bax、P62、Caspase-3蛋白表达均降低,而Bcl-2、Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ增加。结论siRNA靶向抑制eIF2α基因通过增强自噬及抑制细胞凋亡改善NAFLD,细胞模型脂肪变性。

基于PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路探讨化浊解毒消痈方对溃疡性结肠炎小鼠结肠黏膜的保护作用

目的基于PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路探讨化浊解毒消痈方对溃疡性结肠炎(UC)小鼠的作用。方法将48只小鼠随机分成正常组、模型组、美沙拉嗪组(阳性药,045 g/kg)和化浊解毒消痈方高、中、低剂量组(2868、1434、717 g/kg),每组8只。除正常组外,其余各组小鼠均采用25%葡聚糖硫酸钠(DSS)自由饮用7 d建立溃疡性结肠炎模型,造模后各组灌胃给予相应剂量药物。给药7 d后,分析小鼠疾病活动指数(DAI)评分,HE染色观察结肠组织病理学改变,RT-qPCR和Western blot法检测结肠组织PERK、eIF2α、ATF4、CHOP mRNA和蛋白表达。结果与模型组比较,化浊解毒消痈方各剂量组和美沙拉嗪组小鼠DAI评分降低(P<005),结肠组织病理形态得到改善,结肠组织PERK、eIF2α、ATF4、CHOP mRNA和蛋白表达降低(P<005),其中高剂量组作用与美沙拉嗪组相当。结论化浊解毒消痈方能抑制结肠上皮细胞的过度凋亡,对UC小鼠结肠损伤具有保护作用,其作用机制可能与抑制PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路活化、抑制凋亡,进而修复结肠黏膜、促进溃疡愈合有关。

HPV(16/18)E6、PKR、p-PKR、p-EIF2α在宫颈病变组织表达的意义

目的:探讨HPV(16/18)E6、蛋白激酶R(PKR)、磷酸化型PKR(p-PKR)、磷酸化型真核细胞翻译起始因子2α(p-EIF2α)在各级别宫颈病变组织的表达差异与宫颈病变级别的相关性及对宫颈癌患者预后的影响。方法:采用免疫组化法检测HPV(16/18)E6、PKR、p-PKR、p-EIF2α在63例宫颈癌、114例宫颈上皮内瘤样病变(CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ)、15例正常宫颈组织中的表达。结果:HPV(16/18)E6在各组的阳性表达率为6.7%、15.4%、22.9%、27.5%、39.7%,宫颈癌组明显高于正常组及CINⅠ组(P<0.01,P<0.05);PKR在各组的阳性表达率为6.7%、17.9%、25.7%、30.0%、46.0%,宫颈癌组明显高于正常及CINⅠ-Ⅱ组(P<0.01,P<0.01,P<0.05);p-PKR在各组的阳性表达率(6.7%、15.4%、20.0%、15.0%、15.9%)无统计学差异(P>0.05);p-EIF2α在各组的阳性表达率为6.7%、23.1%、31.4%、40.0%、30.2%,CINⅢ组高于正常宫颈组(P<0.05);HPV(16/18)E6、PKR在各组的阳性表达率与宫颈病变级别成正相关(P<0.05,P<0.05);在宫颈癌组,PKR的阳性表达率明显高于p-PKR(P<0.01);宫颈癌患者临床分期晚者病情进展快(P<0.01),p-PKR、p-EIF2α阴性表达者病情进展快(P<0.05,P<0.05)。结论:HPV(16/18)E6使p-PKR、p-EIF2α失活,促进宫颈病变进展,导致宫颈癌患者预后不良;p-PKR、p-EIF2α能抑制病情进展,改善其预后。

REM睡眠剥夺对大鼠额叶皮质磷酸化eIF2α表达的影响

目的观察不同时间的快速眼动(REM)睡眠剥夺对大鼠额叶皮质磷酸化真核翻译起始因子(elF2α)蛋白表达的影响。方法采用改良多平台睡眠剥夺法,将Sprague-Dawle大鼠分为6h、12h、24h和72h时间段进行REM期睡眠剥夺。采用免疫组织化学方法和蛋白质免疫印迹(Western blot)技术观察REM睡眠剥夺后大鼠额叶磷酸化eIF2α蛋白表达的分布特点和变化规律。结果免疫组化观察到eIF2α(P)免疫反应阳性表达在睡眠剥夺6h开始增多,12h、24h显著增多,72h降低,阳性指数分别为80.733±4.094、121.288±3.453、106.197±6.611、67.890±4.173;Western blot实验发现,与对照组相比,REM睡眠剥夺早期大鼠额叶皮质激活了磷酸化的eIF2α,在12h(1.103±0.200)达到高峰,并持续到24h(1.095±0.157),睡眠剥夺72h(0.566±0.074)后逐渐下降。结论短期REM睡眠剥夺能诱导大鼠额叶皮质磷酸化eIF2α蛋白表达,使蛋白合成抑制。

基于PERK-eIF2α通路探讨苁蓉舒痉颗粒对帕金森病模型大鼠黑质纹状体内质网应激的调节作用

目的 研究苁蓉舒痉颗粒对鱼藤酮诱导的帕金森病(PD)模型大鼠黑质纹状体内质网应激蛋白激酶样内质网激酶(PERK)-真核翻译起始因子2α(eIF2α)通路的调节作用。方法 将100只健康SD大鼠随机分为正常组33只和造模组67只,造模组采用颈背部皮下注射鱼藤酮葵花油乳液建立PD模型,参照行为学评分标准鉴定造模成功后,随机分为模型组34只和治疗组33只。治疗组予苁蓉舒痉颗粒药液6.8 mL/(kg·d)灌胃,正常组、模型组予等量生理盐水灌胃,连续干预14 d。于灌胃第1、3、5、7、9、11、13、14天,采用平行反应监测(PRM)蛋白相对定量分析检测大鼠黑质纹状体eIF2α特异性肽段定量的变化;灌胃14 d后应用透射电镜观察3组大鼠黑质神经细胞超微结构;采用免疫组化法检测大鼠黑质PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α表达的平均光密度值。结果与正常组比较,在灌胃第13、14天模型组黑质纹状体eIF2α特异性肽段定量明显增高(P均<0.05),灌胃14 d后黑质神经细胞肿胀,内质网扩张,黑质PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α的平均光密度值增高(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,治疗组在灌胃第5天黑质纹状体eIF2α特异性肽段定量明显增高(P<0.01),灌胃第13、14天时明显减低(P均<0.05),灌胃14 d后黑质神经细胞肿胀、内质网扩张等形态异常有所改善,黑质PERK、pPERK、eIF2α、p-eIF2α的平均光密度值明显降低(P<0.05,P<0.01)。结论 苁蓉舒痉颗粒可能通过动态调节内质网应激PERK-eIF2α通路,起到恢复内质网稳态的作用。

呋塞米对脑出血模型大鼠PERK/eIF2α/CHOP通路及继发性脑损伤的影响

目的探讨呋塞米(FUR)对脑出血(ICH)大鼠RNA依赖的蛋白激酶样内质网激酶(PERK)/真核起始因子2α(eIF2α)/转录因子CCAAT增强子结合蛋白的同源蛋白(CHOP)通路及继发性脑损伤的影响。方法将大鼠分为假手术组、模型组(脑定位注射Ⅳ型胶原酶,建立ICH模型)、FUR低剂量组(FUR-L)、FUR中剂量组(FUR-M)、FUR高剂量组(FUR-H)、神经节苷脂组,每组18只。药物处理后,检测神经功能,对其进行Longa评分;测量大脑含水量;用Evans蓝外渗实验检测血脑屏障损伤;用HE染色检测海马神经元损伤;用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-6(IL-6)水平;用免疫印迹法检测大鼠脑组织PERK/eIF2α/CHOP通路相关蛋白p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、CHOP表达。结果相比假手术组,模型组大鼠海马神经元变性坏死,皱缩变小,数目明显减少,呈现严重病理损伤,Longa评分、Evans蓝渗出量、大脑含水量、血清IFN-γ及IL-6水平、p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、CHOP表达水平明显升高(P<0.05)。相比模型组,FUR-L、FUR-M、FUR-H组及神经节苷脂组大鼠海马神经元形态有不同程度恢复,病理损伤减轻,Longa评分、大脑含水量、Evans蓝渗出量、血清IFN-γ及IL-6水平、p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、CHOP表达水平均降低(P<0.05)。结论FUR可下调PERK/eIF2α/CHOP通路蛋白表达,缓解脑水肿及海马神经元损伤,修复ICH模型大鼠神经功能。

PERK-eIF2α-ATF4信号通路参与调控磷酸三钙磨损颗粒诱导的假体周围骨溶解

目的探讨蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)-真核细胞起始因子2α(e IF2α)-活化转录因子4(ATF4)介导的内质网应激通路在磷酸三钙(TCP)磨损颗粒诱导假体周围骨溶解中的作用。方法取雄性ICR小鼠30只,随机分为3组:假手术组(sham,n=10)、TCP磨损颗粒组(模型组,n=10)和salubrinal干预组(SAL,n=10)。采用TCP磨损颗粒诱导小鼠颅骨溶解模型,于术后第2天颅顶局部注射SAL(1 mg/kg),每隔2 d 1次,持续干预2周。实验结束后处死动物取颅骨和外周血。Western blotting法检测TCP磨损颗粒植入部位周围骨组织中内质网应激分子伴侣葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、C/EBP同源蛋白(CHOP)表达水平及PERK-e IF2α-ATF4信号通路的活化情况;HE染色和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色观察SAL对假体周围骨溶解和破骨细胞形成的影响;Real-time PCR检测SAL对破骨细胞活化相关基因抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和c-fos的mRNA水平;ELISA法检测SAL对血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)和前列腺素E2(PGE2)水平的影响。结果 TCP磨损颗粒可诱导假体周围骨组织发生内质网应激反应,同时激活PERK-e IF2α-ATF4信号通路,表现为TCP磨损颗粒组小鼠颅骨组织中内质网应激通路蛋白GRP78、CHOP和磷酸化PERK(pPERK)、磷酸化e IF2α(p-e IF2α)和ATF4蛋白表达均显著上调,而PERK和e IF2α蛋白明显下调(P<0.05);而颅顶局部注射e IF2α特异性抑制剂SAL可明显阻止TCP磨损颗粒诱导假体周围破骨细胞形成和骨溶解,减少TRAP、MMP-9和cathepsin K的mRNA水平(P<0.05);同时抑制TNF-α、PGE2和IL-1β等炎症因子的产生(P<0.05)。结论 PERK-e IF2α-ATF4介导的内质网应激通路参与调控TCP磨损颗粒诱导的小鼠颅骨溶解;抑制该信号通路可减轻TCP磨损颗粒诱导的假体周围骨溶解和关节松动。

尖吻蝮蛇毒抑瘤组分I通过PERK/eIF2α通路诱导Tca8113细胞凋亡的机制研究

目的:探讨内质网应激(ERS)相关的蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)/真核翻译起始因子2α(eIF2α)通路在尖吻蝮蛇毒抑瘤组分I(AAVC-I)诱导人舌鳞癌Tca8113细胞凋亡中的作用及机制。方法:不同实验浓度(4. 0、8. 0和16. 0 mg/L)的AAVC-I处理Tca8113细胞24 h后采用苏木素-伊红(HE)染色观察细胞形态;流式细胞术(annexin V-FITC/PI双荧光染色法)检测细胞凋亡;Western blot检测ERS相关蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78),PERK/eIF2α通路中的磷酸化PERK(p-PERK)、磷酸化eIF2α(p-eIF2α)及下游的活化转录因子4(ATF4)和CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP),以及细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的蛋白表达水平。结果:AAVCI各浓度组分别与正常对照组相比以及各浓度组之间相互比较的结果显示,随着AAVC-I浓度的增加,Tca8113细胞活力逐渐降低,细胞逐渐皱缩变小,间隙增大,胞核浓缩、碎裂,出现凋亡小体,细胞凋亡率增高(P<0. 05);GRP78、p-PERK、p-eIF2α、ATF4、CHOP及Bax蛋白水平上调,Bcl-2表达下调(P<0. 05)。结论:AAVC-I抑制Tca8113细胞活力的同时引发细胞发生ERS并诱导细胞凋亡,其诱导细胞凋亡的机制与PERK/eIF2α通路密切相关。

耐力训练对心肌PERK/eIF2α/ATF4信号通路激活的影响

探讨内质网应激机制在耐力训练对心肌功能影响过程中的作用。方法:通过建立不同运动方式、运动训练状态和不同恢复阶段的动物模型,测定心肌中与内质网应激相关的信号通路PERK/eIF2α/ATF4激活水平的变化。结果:无论是急性运动,还是4或10周的递增负荷耐力训练,都没有显著激活PERK/eIF2α/ATF4信号通路,但是以延长运动时间为特征的耐力训练能够激活PERK/eIF2α/ATF4信号通路。结论:以递增运动时间为特征的耐力训练能够激活PERK/eIF2α/ATF4信号通路,该通路的激活对运动心肌的结构和功能变化可能产生影响。

基于PERK-eIF2α-CHOP通路调控巨噬细胞胆固醇稳态及冠心康含药血清干预机制研究

目的观察具有益气化痰活血作用的冠心康对人单核/巨噬细胞株THP-1细胞PERK-eIF2α信号通路及相关活化转录因子(ATF)和C/EBP同源转录因子(CHOP)的影响,探究冠心康对胆固醇在巨噬细胞内质网中的代谢稳态调节及作为“脂毒”流出后异常沉积的相关作用。方法采用100 ng·mL^(-1)PMA及80μg·mL^(-1)氧化低密度脂蛋白诱导THP-1细胞株,构建巨噬细胞模型,并随机分为模型组、冠心康组、辛伐他汀组、正常组。分别采用10%小牛血清及含药血清干预模型细胞72 h后收集细胞。HE染色观察巨噬细胞病理形态变化,同时进行胆固醇及脂滴含量测定。分别采用Real-time PCR及Western blot法检测各组细胞PERK、eIF2α、ATF、CHOP mRNA及蛋白的表达。结果HE染色观察到模型组细胞内呈现较多红色脂滴,经胆固醇含量测定,明显高于正常组,脂滴含量测定与前者一致(P<0.01)。模型组细胞ATF、CHOP基因表达水平均显著升高(P<0.01)。与模型组比较,冠心康组和辛伐他汀组细胞ATF、CHOP基因表达水平均显著降低(P<0.01)。PERK磷酸化以及CHOP蛋白表达水平在冠心康和辛伐他汀干预组表现为显著下调,与模型组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论冠心康可能通过调控PERK-eIF2α-CHOP通路相关基因及蛋白,减少泡沫细胞形成,从而减轻内质网应激,维持细胞内胆固醇稳态,减少细胞内胆固醇沉积。

胃腺癌中eIF2α的表达及意义

目的观察真核生物翻译起始因子2α(eukaryotic translation initiation factor 2α,e IF2α)在胃腺癌中的表达,探讨其在不同临床特征中的表达差异及临床意义。方法选取华北理工大学附属医院确诊为胃腺癌,并行手术根治的患者48例作为观察组,同时选取距肿物边缘>5 cm的非肿瘤性胃黏膜组织29例作为对照组,应用免疫组化法检测两组中e IF2α的表达,分析其在不同临床病理特征中的表达差异。结果 e IF2α在观察组中的阳性率为37.5%(18/48),明显高于其在对照组中的阳性率0(0/29)(P<0.05)。观察组中e IF2α表达与患者性别、年龄、Lauren分型、分化程度、是否有癌栓、是否有癌结节、淋巴结转移及浸润深度分组中的差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 e IF2α在胃腺癌组织中高表达,其作用可能与去磷酸化有关,对病变的形成可能有一定的促进作用。