牛呼吸道合胞体病毒G和F蛋白的生物学功能

牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus, BRSV)是一种在世界范围内引起牛呼吸道疾病的病毒性病因之一,主要引起1岁龄以下犊牛的严重下呼吸道感染。BRSV共编码9种结构蛋白,其中附着蛋白(G蛋白)和融合蛋白(F蛋白)是BRSV表面主要的包膜糖蛋白,参与病毒吸附、融合宿主细胞的过程。G和F蛋白含多种识别表位,能够刺激机体产生中和抗体反应,常常是牛呼吸道合胞体病(bovine respiratory syncytial disease, BRSD)疫苗开发所关注的重点。探究G和F蛋白在BRSV侵染中的作用机理对于病毒致病机理分析、疫苗开发具有重要意义。本文旨在对牛呼吸道合胞体病毒G和F蛋白的结构功能及有关疫苗的开发加以综述,以期为BRSV疫苗的研制和BRSD的防控提供参考。

新城疫病毒F蛋白和禽致病性大肠杆菌OmpA嵌合蛋白的表达及双特异性抗体制备

为获得Ⅶ型新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)融合蛋白(fusion protein,F蛋白)和O18型禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)外膜基因A(outer-membrane proteases,OmpA)嵌合蛋白和双特异性抗体,试验首先采用基因合成技术获得Ⅶ型NDV F基因和O18型APEC的OmpA基因片段,使用同源重组技术将F基因插入到OmpA基因中,再将重组基因片段插入到原核表达载体pGEX-4T-1中构建嵌合表达质粒,对重组质粒中的插入基因序列进行测序鉴定;将序列正确的嵌合表达质粒转入大肠杆菌BL21(Rosetta)感受态细胞中,利用IPTG诱导嵌合蛋白表达,使用SDS-PAGE和Western-blot检验嵌合蛋白的表达情况;纯化嵌合蛋白后免疫兔获得抗血清,抗血清再经抗原亲和纯化层析柱纯化获得多克隆抗体,采用间接酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定抗体效价。结果表明:成功合成了Fo和OmpA1、OmpA2基因片段,构建并表达了重组质粒pGEX-O1-Fo-O2,纯化后的嵌合蛋白O1FoO2在大肠杆菌中以包涵体形式存在,制备的多克隆抗体对O1FoO2的效价约为1.1×10^(6),对GST的效价约为4.1×10^(4)。说明制备的嵌合蛋白和双特异性抗体质量较好。

鹅副粘病毒F蛋白基因的克隆和序列分析

鹅副粘病毒分离株YG97经 10日龄鸡胚增殖后纯化 ,提取病毒的基因组RNA ,采用RT_PCR一次性扩增出与预期设计的 1.7kb大小相符的特异性条带。将扩增产物提纯后克隆入pGEMR_T载体 ,经转化、筛选及酶切鉴定后 ,初步获得了含鹅副粘病毒F基因的阳性克隆。将所获得的阳性重组质粒进一步进行了序列鉴定。序列分析表明扩增的F基因片段的长度为16 95bp ,共编码 5 5 3个氨基酸 ,F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为112 R_R_Q_K_P_F117,与NDV的强毒株特征相符 ,同时也与鹅副粘病毒分离株致病性实验结果相符。同源性分析表明 ,与国内标准强毒株F48E9的核苷酸同源性为 86 % ,与国内外其它毒株的核苷酸同源性在 82 %～ 89%之间 。

新城疫病毒(长春株)F蛋白基因的克隆和序列分析

新城疫病毒（ＮＤＶ）长春株在鸡胚增殖后纯化，提取ＲＮＡ，然后利用特异性引物，经ＲＴ－ＰＣＲ一次性扩增出了ＮＤＶ长春株的全长Ｆ基因。将该Ｆ基因插入ｐＫＳ（－）后，进行了序列测定。序列分析表明，该Ｆ基因核苷酸长度为１７５８ｂｐ，编码５５３个氨基酸，序列中有６个糖基化位点，１３个半胱氨酸残基，裂解位点区（１１２～１１７）氨基酸序列为Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ，与所有弱毒株在这一区域的序列（Ｇｌｙ－Ａｒｇ／Ｌｙｓ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ／Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ）相符，证明长春株为弱毒株。同源性分析表明，长春株Ｆ基因与目前国外发表的其他ＮＤＶＦ基因相比，核苷酸序列同源性在８８％～９９％之间。

鹅源副粘病毒NA-1株F蛋白基因的克隆及其载体的构建

鹅源副粘病毒分离株 NA- 1经 1 1日龄鸡胚增殖后收集尿囊液 ,浓缩 ,提取病毒基因组总 RNA,采用 RT- PCR方法 ,一次性扩增出与预期大小相符的特异性条带。将扩增产物提纯回收后克隆入 p MD1 8- T载体 ,经转化、筛选及酶切鉴定后 ,对阳性克隆进行了序列测定和序列分析。测序后拼接的 F基因长 1 6 72 bp,包含完整的开放阅读框 ( 1 6 6 2bp) ,编码 5 5 3个氨基酸 ,F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为 1 1 2 R- R- Q- K- R- F1 1 7,与 NDV的强毒株特征相符 ,同时也与鹅副粘病毒分离株致病性试验结果相符。根据 NDV基因分型标准 ,鹅源副粘病毒 NA- 1株归属基因 型 NDV。将 F基因克隆入转座载体 p Fast Bac ,得到重组转座载体 PFF,将 PFF转化大肠杆菌 DH1 0 Bac,提取质粒 ,得到阳性重组穿梭载体 re- Bacm id。

半番鸭源禽1型副粘病毒FM01株的分离鉴定与F蛋白基因分析

从表现类似新城疫症状的病死半番鸭中分离到1株病毒FM01株,经血凝及血凝抑制试验证实为禽1型副粘病毒。以SPF鸡胚测定其平均致死时间为113.4h,对1d雏鸡脑内接种致病指数为0.23,表明为温和型毒株。利用RT-PCR技术一次性扩增其F蛋白全基因,克隆到pMD18-T质粒载体,测序后获得F基因全序列,并推导出其相应的氨基酸序列。FM01株的F蛋白基因完整的编码区全长1662bp,编码553个氨基酸,其裂解位点的氨基酸序列为112G-R-Q-G-R-L117,具有温和型毒株特有的氨基酸序列结构。与常见新城疫毒株的核苷酸同源性在88.4%～99.6%之间,氨基酸同源性在89.2%～99.1%之间。

鸡痘病毒282E4株表达载体的构建及新城疫病毒F蛋白的表达

将鸡痘病毒 2 82 E4株 TK基因和 1 .5kb B片段 2个非必需区克隆后 ,分别在 TK基因 Nco 位点和 B片段 Eco R 位点插入复合启动子 (由牛痘病毒 A型包涵体启动子和 2 0个串联的痘苗病毒 ( VV)突变型 p7.5早期启动子串联组成 ) ,然后在复合启动子上游插入单一启动子 (人工合成的由 1 6个串联的 VV突变型p7.5早期启动子组成 )调控的 Lac Z基因或 GFP基因作为报告基因 ,构建成分别以 TK基因或 B片段为侧翼、以复合启动子调控目的基因的 2个以 Lac Z为报告基因的表达载体 p UTA-2 -1 6Lac Z和 p UBA-7-1 6Lac Z,2个以 GFP为报告基因的表达载体 p UTA-2 -F71 6和 p UBA-7-F71 6。在 TK基因 Nco 位点和 B片段 Eco R 位点插入单一启动子和单一启动子调控的 Lac Z基因 ,得到 2个分别以 TK基因或 B片段为侧翼、以单一启动子调控目的基因、以 Lac Z为报告基因的表达载体 p UT1 61 6Lac Z和 p UB1 61 6Lac Z。将构建的 6个表达载体分别转染 FPV HIPRA株感染的鸡胚成纤维 ( CEF)细胞 ,仅在转染以 TK基因为侧翼、以 Lac Z为报告基因的 2个表达载体 p UTA-2 -1 6Lac Z和 p UT1 61 6Lac Z收获的病毒中 ,在 X-gal存在下 ,筛选出了表达 Lac Z的蓝色重组病毒蚀斑 ,而转染以 B片段为侧翼的表达载体在同样条件下未筛选到蓝色病?

新城疫病毒(青岛株)F蛋白基因的克隆和序列分析

参考新城疫病毒 ( NDV)长春株的 F基因序列设计了 1对特异性引物 ,应用 RT-PCR对 NDV青岛株(野毒 )的 F基因进行了扩增 ,扩增产物克隆后测序。扩出的 F基因核苷酸长度为 792 bp,编码 2 6 1个氨基酸 ,包括完整的 F2片段和部分 F1片段。裂解位点区 ( 1 1 2～ 1 1 7aa)氨基酸序列为 Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Phe,与国外发表的强毒株序列相符 ,证明青岛株为强毒株。根据该基因推导的氨基酸序列 ,与国内外发表的 NDVF蛋白氨基酸序列相比 ,同源性为 88.1 %～ 94 .3%。

新城疫病毒F蛋白纳米抗体的筛选及活性鉴定

旨在筛选新城疫病毒(NDV)F蛋白的纳米抗体,并对筛选的抗体活性进行初步鉴定。以NDV F蛋白中和表位构建诱饵,利用酵母双杂交技术对双峰驼天然重链抗体可变区(VHH)酵母双杂交文库进行筛选,获得4株VHH抗体序列。挑选其中2株最符合VHH特征的进行原核表达与纯化,并对2株VHH活性进行鉴定。ELISA结果显示,VHH1与VHH2与NDV病毒的反应性显著高于阴性对照(P<0.05),表明VHH与NDV病毒反应活性良好;Western blot结果显示,2株VHH可特异性识别F蛋白;细胞中和试验结果表明,2株VHH抗体均具有一定的中和活性。以上结果提示本研究成功筛选出2株活性较好的抗NDV F蛋白的VHH抗体,为VHH在NDV防控中的应用奠定了基础。

丙型肝炎病毒F蛋白的原核表达及初步应用

目的构建丙型肝炎病毒(HCV)F基因的原核表达载体,并在大肠杆菌TG1中进行表达,用以检测丙肝患者体内抗体,并制备抗血清。方法提取患者血清中的HCVRNA,并进行基因分型。取鉴定为HCV1b型的病毒,用RT-PCR扩增HCVF蛋白基因的序列。将扩增产物插入pGEM-T载体中,测序正确后,用EcoRI、BamHI双酶切后,再插入表达载体pGEX-4T-2中,转化大肠杆菌TG1,在IPTG诱导下表达GST-F蛋白。用亲和层析法纯化GST-F蛋白免疫BALB/c小鼠制备抗血清。并用纯化的GST-F蛋白进行ELISA法检测丙肝患者血清抗F蛋白抗体。结果在细菌裂解液中检测到重组的融合蛋白,经GlutathioneSepharose4B亲和层析柱纯化获得较高纯度的GST-F融合蛋白。应用Westernblot方法检测证实,用纯化的GST-F蛋白免疫BALB/c小鼠得到了特异性的抗体。用纯化的GST-F蛋白进行ELISA检测120例丙肝患者血清抗F蛋白抗体,82例呈阳性。结论通过上述方法制备的融合蛋白纯度较高,免疫小鼠获得的抗体具有良好的特异性。用纯化的目的蛋白检测丙肝患者血清抗F蛋白的抗体的阳性率为68%,与国外的报道接近,说明在HCV感染的自然病程中有F蛋白的产生,为研究HCVF蛋白及与HCV相关疾病的诊断和治疗提供了条件。

表达小反刍兽疫病毒F蛋白的重组山羊痘病毒疫苗的研究

本研究利用gpt筛选基因和eGFP报告基因纯化筛选重组小反刍兽疫病毒(PPRV)F基因的重组山羊痘病毒(rGPV-PPRV-F),并经过PCR鉴定。免疫荧光和蛋白印迹试验都证实重组病毒能够感染绵羊羔羊睾丸细胞并表达PPRVF蛋白。以2×106PFU的rGPV-PPRV-F皮内注射免疫山羊3只,并于首次免疫后第28d以相同剂量进行二次免疫。分别于一免后21d和二免后14d采血后分离血清进行病毒中和试验。结果表明,一免后21d山羊痘病毒(GPV)中和抗体效价依次为1∶40、≥1∶80、≥1∶80,PPRV中和抗体效价依次别为1∶20、1∶40、1∶20,全部阳转;二免后14d,GPV中和抗体效价≥1∶80,PPRV中和抗体效价依次为1∶20、1∶80、1∶40。本研究为小反刍兽疫重组山羊痘疫苗的产业化奠定了基础。

番鸭源新城疫病毒F蛋白基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术对番鸭源新城疫病毒FP1/02株的F蛋白基因进行分段扩增、定向克隆到pMD 18-T SimpleVector质粒载体,然后测定其核苷酸序列,拼接出F基因全序列,并推导出其相应的氨基酸序列.FP1/02株的F蛋白基因全长1690 bp,编码553个氨基酸,其裂解位点的氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117,具有强毒株特有的氨基酸序列结构特征.核苷酸序列分析结果表明,FP1/02株与其他不同源新城疫病毒毒株之间的核苷酸序列同源性为87.2%～93.3%.

水貂、狐狸和貉源犬瘟热病毒F蛋白信号肽区基因克隆及遗传变异分析

为了解近年来犬瘟热病毒（canine distemper virus，CDV）在中国毛皮动物主要养殖区的流行情况及遗传变异情况，本试验于2012—2014年从山东、河北、辽宁收集疑似犬瘟热的水貂、狐狸和貉病料，经犬瘟热抗原检测试纸条检测和RT-PCR检测为阳性后，克隆测序了15株CDVF蛋白信号区（Fsp）基因序列。序列分析结果显示，15株CDV野毒株Fsp基因核苷酸序列和氨基酸序列的相似性均为93．6％～100．0％，与疫苗株相似性为80．7％～81.7％。基因系统进化分析结果显示，15株野毒株均属于中国当前流行的Asia-1基因型。氨基酸序列比对分析结果显示，Fsp蛋白在氨基酸3—14、16—37、47—67位等处存在高变异。通过对当前流行CDV野毒株Fsp基因序列分析，结果表明该Fsp基因区具有较高的变异率，可作为CDV基因分型的依据，同时本试验结果为毛皮动物犬瘟热的防控提供了参考依据。

新城疫病毒F蛋白免疫活性片段的原核表达

利用已构建的新城疫病毒F基因重组质粒,通过氨基酸序列分析和InsightⅡ基因工作站的MODELER程序和同源模建技术,预测了试验株F蛋白的表面抗原分布位置。设计引物扩增了2段含有多个抗原位点的多肽片段,通过双酶切定向克隆到原核表达载体pET32a,获得了重组质粒pET32a-F1和pET32a-F2以及2个片段串联起来后克隆的重组质粒pET32a-F3。重组质粒经诱导表达并取产物进行分析,结果显示,F1、F2、F3片段均获得了融合表达。Western-blotting证实,表达产物F1、F2和F3与NDV阳性血清均具有免疫反应性。用表达的重组蛋白加免疫佐剂经皮下接种免疫鸡,免疫2次后产生较高的抗体水平,用100 LD50的超强毒株GD-05-2攻击,重组蛋白免疫组鸡可达到约70%的保护率,并可显著抑制排毒。

丙型肝炎双移位F蛋白抑制肝癌细胞p16、p21的表达

目的:探讨丙型肝炎双移位F(DF)蛋白对肝癌细胞抑癌基因p16、p21转录与表达的影响。方法:PCR扩增HCV1b型DF基因,构建pCDNA3.0/HCV-DF真核表达载体。再转染至肝癌细胞HepG2中,G418筛选稳定表达细胞株,Western blot检测p16、p21蛋白表达及半定量RT-PCR法检测p16、p21基因转录,并以pCDNA3.0空质粒作为阴性对照。结果:重组质粒pCDNA3.0/HCV-DF蛋白在HepG2细胞中稳定表达,pCDNA3.0/HCV-DF转染细胞中p16、p21 mR-NA转录水平和蛋白表达水平较空质粒转染的细胞明显下降。结论:HCV-DF蛋白能够抑制p16、p21表达,提示可能参与肝细胞癌变发生发展。

4株新城疫病毒F蛋白和HN蛋白的计算机模建与表面抗原分析

选取新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)广东分离毒GM株(强毒株)和JM株(弱毒株)以及疫苗毒La-Sota株和标准强毒F48E9株,对其融合蛋白(F)和神经氨酸酶(HN)的编码基因序列进行分析,并利用Insight II软件包(Version 2000)进行F蛋白和HN蛋白C端蛋白单体的空间结构模建.结果显示,4个NDV毒株F蛋白单体分子的空间结构极为相似,大致分为3部分,即头部、茎部和柄部.其中头部结构主要由一些折叠股组成,茎部和柄部主要由螺旋结构组成.比较各毒株F蛋白表面蛋白溶剂可及表面积(ASA)后发现,该蛋白有5个线性B细胞表位和8个比较保守的抗原决定簇位点,蛋白头部残基的空间位置随毒株的不同而变异较大.GM株与F48E9株存在36个氨基酸残基的差异,JM株和LaSota株存在20个氨基酸残基的差异.研究结果还表明,4个NDV毒株的HN蛋白C端空间结构较保守,由多个折叠股和4段螺旋结构组成,其抗原决定簇位点也高度保守,只有4个氨基酸残基存在差异.

NDV La Sota株、V4株F蛋白表位的预测

为进一步研究 2 种疫苗的表位,以深入探讨NDV La Sota株、V4疫苗免疫差异的根本所在。应用亲水性、可及性、抗原性、可塑性和二级结构预测等 5 种参数分别对新城疫病毒 La Sota株和 V4 株 F蛋白的 B细胞抗原表位进行了综合预测,预测到二者的 B细胞抗原表位分别有 19 个,这些表位中含有已经确定的 5 个中和表位, A1: 72aa, A2:78aa, A3: 79aa, A4: 157 aa、161 aa、170 aa、171 aa,A5:343 aa。比较发现,二者有 9 个预测的B细胞表位氨基酸序列存在差异。

丙型肝炎病毒F蛋白反式激活基因2的表达纯化及多克隆抗体制备

目的构建丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白反式激活基因2(FTP2)的原核表达载体并诱导其表达,制备多克隆抗体并探讨其在临床病理组织中表达的意义。方法通过PCR获得HCVFTP2基因,将其克隆至原核表达载体pET32a(+)上,构建重组表达载体,在大肠埃希菌BL21中诱导表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blotting验证后进行大量表达并纯化。将纯化的重组蛋白免疫家兔获得多克隆抗体,并将此抗体作为诊断试剂观察其在正常肝组织和临床病理组织中的表达情况。结果以pET32a(+)-FTP2表达载体转化BL21菌后,经IPTG诱导,成功获得大量重组蛋白,分子量约为25kD。将此重组蛋白免疫新西兰兔获得多克隆抗体,经抗体间接ELISA检测证明,多克隆抗体效价>1:128000,免疫组化显示多克隆抗体能够与丙型肝炎、肝硬化、肝细胞癌等临床病理组织产生FTP2抗原反应。结论成功表达了HCV的FTP2蛋白并制备了其多克隆抗体,证实FTP2与丙型肝炎、肝硬化的发病机制密切相关。

呼吸道合胞体病毒F蛋白二级结构分析及其B细胞表位预测

目的分析呼吸道合胞体病毒（RSV）F蛋白的二级结构并预测其B细胞表位。方法分析RSV F蛋白的二级结构,得出RSV F蛋白中可能出现的信号肽序列以及位置。基于同源建模的方法预测RSV F蛋白的三级结构,以三级结构为基础预测F蛋白中可能存在的构象B表位和线性B表位。结果 F蛋白的574个编码氨基酸中占主要比例的是丝氨酸（10.45%）、亮氨酸（10.28%）、天冬酰胺（8.71%）和苏氨酸（8.71%）;可能有7个蛋白结合位点、6个产生螺旋结构的区域;可能存在两个主要的β-折叠片蛋白;F蛋白N-末端第1-5区段为信号肽。RSV F蛋白头部主要由β-折叠片、无规则卷曲和转角组成,尾部主要由两段长的α-螺旋组成。RSV F蛋白中可能存在4个构象B表位、8个线性B表位。结论 F蛋白编码氨基酸主要为丝氨酸和亮氨酸,可能有7个蛋白结合位点、6个产生螺旋结构的区域、两个主要的β-折叠片蛋白。RSV F蛋白中可能存在4个构象B表位、8个线性B表位。

丙型肝炎病毒F蛋白缺失对病毒复制及感染性的影响

探索了F蛋白缺失及核心蛋白(Core)二级结构改变对丙型肝炎病毒(HCV)复制和感染性的影响.利用定点突变方法,将J6JFH1的核心基因引进5个终止密码子以中断F蛋白的表达,从而获得F蛋白缺失的病毒复制子J6JFH1/ΔF.体外制备RNA转录体,并电穿孔转染Huh7.5.1细胞,采用免疫荧光、实时荧光定量PCR方法以及病毒感染等方法,观察F蛋白缺失对病毒复制、蛋白质表达及转染细胞上清感染性病毒颗粒产生的影响.在此基础上,构建5个单一突变病毒体,对HCV核心蛋白进行二级结构分析,观察核心蛋白二级结构对HCV复制和翻译的影响.结果显示,转染48 h后,J6JFH1/ΔF与野生型J6JFH1相比,J6JFH1/ΔF转染阳性细胞数明显降低,细胞内HCV RNA水平降低约95%,J6JFH1/ΔF转染后不同时间点细胞上清中HCV RNA拷贝数和病毒颗粒也明显降低.5个单一突变体不影响核心基因二级结构,病毒在细胞内复制和感染性与野生型水平一致.J6JFH1/ΔF所产生的改变可能是由于5处突变导致核心基因二级结构改变而造成的.结果说明,HCV F蛋白缺失不影响病毒的复制翻译及病毒颗粒的包装释放,核心蛋白二级结构的改变对病毒复制和翻译则产生较大影响.