薏苡ClSAD、ClFAD2基因单倍型鉴定与相关脂肪酸关联分析

薏苡仁油是薏苡仁主要功能性物质之一,脂肪酸是其重要组成部分。以中国9个省份的190份薏苡种质为材料,检测其种仁硬脂酸、油酸、亚油酸含量,分析ClSAD、ClFAD2基因序列多态性并鉴定单倍型,进行脂肪酸含量单倍型关联分析。结果表明,不同薏苡种质种仁3种脂肪酸含量存在广泛变异,变异系数为15.84%~23.05%,遗传多样性指数为5.22~5.23,其中油酸含量最高,硬脂酸含量最低,各脂肪酸组分间呈极显著正相关。ClSAD和ClFAD2内部各有14个和3个SNP,分别鉴定到5个单倍型组合,ClSAD基因单倍型Hap3和ClFAD2基因单倍型Hap1分别与参考基因组一致。ClSAD基因单倍型Hap3与硬脂酸含量显著关联且具有负效应,利于硬脂酸向油酸转化。ClFAD2基因单倍型Hap1利于亚油酸的积累,而Hap2与亚油酸酸含量显著关联且具有负效应,不利于亚油酸的合成。在2个基因内部各鉴定到1个关键SNP位点,分别是形成SAD和FAD2酶活性差异的关键位点。研究结果将为高油薏苡优良品种的选育、分子标记开发和相关分子机制解析提供理论基础。

油茶FAD2基因全长cDNA的克隆和序列分析

FAD2基因控制油酸转化为亚油酸,是油茶油脂合成代谢的关键酶基因。在构建的油茶EST文库基础上,采用5′RACE和交错延伸PCR技术获得了油茶FAD2基因的全长cDNA克隆。该基因序列长1682bp,开放阅读框为1149bp,编码382个氨基酸,并且具有FAD2特有的保守序列和相关特征。经过比对分析,发现油茶的FAD2基因与其他植物的FAD2基因具有较高的相似性。

甘蓝型油菜FAD2基因cDNA片段的克隆和序列分析

为了提高油菜的油酸含量 ,继而培育高油酸油菜品种 ,从甘蓝型油菜成熟叶片中分离总 RNA,经反转录合成 c DNA第一条链 ,以此为模板进行多聚酶链式反应 ,产物为一长 6 5 4 bp的 DNA片段 .经克隆和序列测定表明 ,其核苷酸序列与 Gen Bank中甘蓝型油菜 FAD2基因在比较区的同源性达 10 0 % .

花生FAD2基因RNAi载体转化及转基因籽粒脂肪酸分析

在构建了以花生△12脂肪酸去饱和酶(FAD2)基因自身启动子驱动、有内含子间隔的该基因编码序列反向重复片段的RNA干扰载体的基础上,对上述干扰载体进行了农杆菌介导的花生胚小叶的遗传转化,以期特异调控花生籽粒中油酸、亚油酸含量。在2个受体品种中获得105株抗性再生植株,用两对引物对其进行了PCR扩增,其中32株初步证实为转基因植株。采用近红外分析仪对转基因T1籽粒油酸和亚油酸含量的检测结果表明,转基因株系内油酸/亚油酸比值的变异高于对照,多数转基因株系油酸亚油酸比值平均数也显著高于对照。

甘蓝型油菜Fad2基因的RNA干扰及无筛选标记高油酸含量转基因油菜新种质的获得

利用已获得的油菜种子贮存蛋白——十字花科蛋白(cruciferin)基因的启动子和终止子,构建了无选择标记基因且同时具有正义及反义结构的油酰去饱和酶基因(Fad2)种子特异表达RNAi载体,并通过农杆菌介导的转化,获得了只含有油菜原有基因且Fad2基因表达受抑制的转基因植株。RT-PCR分析结果表明,在油酸含量达到83.9%的转基因植株中未检测到在非转基因植株中普遍存在的Fad2基因转录mRNA——一种典型的RNA干扰现象。通过对植株生长发育状态的观察比较,该高油酸含量转基因株系并未表现出双突变体中由于Fad2基因的失活所引起的植株抗寒能力差、发育迟缓、花蕾死亡、结实率低等不利农艺学性状。

甘蓝型油菜fad2基因片段的克隆和反义表达载体的构建

从甘蓝型油菜湘油 15号基因组中分离总DNA ,以此为模板进行多聚酶链式反应 (PCR)。PCR产物与克隆载体 pGEM -TEasy连接 ,经NotI酶切后插入 pBluescriptIISK +。序列测定表明 ,PCR产物为 6 5 4bp的DNA片段 ,fad2基因片段只朝 pBluescriptIISK +的T3-T7方向插入 ,经BamHI和SacI酶切后插入表达载体质粒pBI12 1相同的酶切位点 ,构建反义 fad2表达载体。

油茶FAD2基因的植物表达载体和RNA干扰载体构建及其功能分析

茶油是从油茶种子中提取的食用植物油,富含油酸、亚油酸以及亚麻酸等多种人体必需的不饱和脂肪酸。在植物的不饱和脂肪酸生物合成途径中,脂肪酸脱饱和酶(Fatty Acid Desaturase,FAD)有多个家族成员,可以将单不饱和脂肪酸转化成多不饱和脂肪酸,其中FAD2可以将油酸(18∶1Δ9)和棕榈油酸(16∶1Δ9)转化成亚麻酸(18∶2Δ9,11)和十六碳二烯酸(16∶2Δ9,11)。为了揭示油茶FAD2基因的功能,本研究在原有的基础上构建了这个基因的植物表达载体p BI121-Co FAD2以及RNA干扰载体p BI121-Co FAD2 RNAi,并分别对相应的拟南芥突变体和野生型植株进行了转基因研究。结果表明,同野生型相比,fad突变体中,18∶1和16∶1含量较高,18∶2和16∶2含量较低;突变体植株经过植物表达载体的转化后,脂肪酸组分得到了恢复;而野生型植株经过RNA干扰载体的转化后,18∶1和16∶1含量升高,18∶2和16∶2含量降低。由此说明,油茶FAD2基因在植物体内具有调控18∶1和16∶1转变成18∶2和16∶2的功能,对于茶油脂肪酸组分的构成起着关键的调控作用。

RNAi沉默转基因油菜fad2基因表达的种子特异性分析

为研究RNAi沉默转基因油菜fad2基因表达的效果及其器官特异性,实时荧光定量PCR法分析比较了转基因油菜W-4与非转基因对照Westar开花后第7天、第14天、第21天、第28天的种子以及越冬期油菜根、茎、叶器官中的fad2基因的相对表达量。结果显示:对照Westsr种子中fad2基因的相对表达量随开花后的天数呈逐渐增加的趋势,但W-4种子中fad2基因的相对表达量在开花后第21天、第28天较对照Westar显著下降,降幅达到60%。说明转基因油菜W-4在种子发育过程中表达的fad2基因的dsRNA干扰了fad2基因表达。W-4与Westar在越冬期根、茎、叶器官中fad2基因的相对表达量基本一致,无显著性差异。脂肪酸组成分析结果显示:W-4种子中油酸平均含量达到81.5%较Westar增加了近15%,而多不饱和脂肪酸平均含量为5.25%,较Westar下降了近70%;但根、茎、叶中的脂肪酸含量二者无显著差异;结果表明转基因油菜中RNAi干扰fad2基因表达具有种子特异性,不干扰其它器官的fad2基因表达。研究还发现转基因油菜fad2基因表达下降的时期与napin基因表达时期同步,均始于开花后21d左右,表明目标基因的表达受napin启动子的准确控制。

中间锦鸡儿fad2基因克隆与序列分析

油酸去饱和酶FAD2(fatty acid desaturase2)在油酸中引第二个双键生成亚油酸,是负责植物体内产生多不饱和脂肪酸的第一步关键酶。本研究采用RT-PCR和RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术,以中间锦鸡儿未成熟种子为材料,克隆了三个fad2基因(分别命名为fad2-2A、fad2-1A和fad2-1B)。将这三个基因与汪阳东从中间锦鸡儿枝叶中克隆的fad2-2B(CaFAD2基因,GenBank登录号AY957394)一起进行了序列比对和分析。序列同源性比较结果表明,fad2-1A与fad2-1B同源性很高,fad2-1A编码的前283个氨基酸与fad2-1B的同源性高达98.9%,fad2-2B与fad2-1A的氨基酸序列同源性最低,只有64.7%。这四个基因的成功克隆,为进一步研究基因分工、调控方式打下了基础,为实现对锦鸡儿属植物脂肪酸成分直接、精确调控提供了保证,也是从一个物种中克隆四个fad2基因的第一次报道。

甘蓝型油菜种子特异性表达fad2基因的ihpRNA载体构建

旨在通过转基因途径诱导油菜种子中fad2基因发生转录后基因沉默,本文构建了fad2基因的ihpRNA植物表达载体。通过PCR扩增分离到甘蓝型油菜种子特异性表达的Nap in启动子序列(1147bp)以及油酸脱饱和酶基因(fad2)的一个537bp的片段,并将它们分别克隆到pGEM-T easy载体中。利用中间载体pHurrican构建fad2基因的反向重复框。将fad2基因片段以正向的方式连接在一个可剪切的内含子的5’末端,而以反向的方式连接到该内含子的3’末端;然后将Nap in启动子序列连接到该反向重复框的5’端,而在其3’端接有一个nos终止子序列;最后将fad2基因的反向重复表达框分两步克隆到植物双元载体pCAMB IA2300的pUC18多克隆位点,构建具有种子特异性表达的fad2基因的ihpRNA表达载体pCNFIRnos。限制性内切酶酶切对载体作了鉴定分析。

玉米FAD2基因的克隆及序列分析(英文)

高等植物中的△12脂肪酸脱饱和酶是将油酸转化为亚油酸的酶。根据已发表的其他高等植物的FAD2基因的保守序列设计同源引物,通过RT-PCR从玉米幼胚中扩增得到一个特异的cDNA基因片段。通过生物信息学分析,从玉米幼胚cDNA和基因组中均扩增得到1164bpFAD2基因(GenBank登陆号:DQ496227),它编码387个氨基酸,含有完整的ORF框,在ORF框内无内含子。序列联配与树状分析结果表明,FAD2推导的氨基酸序列与其他物种的?12脱饱和酶基因具有同源性。它含有3个组氨酸保守域和2段很长的疏水区,是一个跨膜4次的膜结合蛋白。半定量RT-PCR分析显示FAD2基因在玉米幼胚中表达量最高,在叶、茎、根中亦有低水平表达。

甘蓝型油菜反义Fad2基因RNAi载体无选择标记转化研究

利用甘蓝型油菜种子特异性贮存蛋白基因cruciferin启动子及NOS终止子构建了无选择标记基因且含有反义结构的油酸脱饱和酶基因(Fad2)的RNA i表达载体。通过农杆菌介导法,获得了无选择标记转基因植株;再生植株的PCR检测表明,外源基因已高频率地整合到油菜基因组中,而且获得的转基因种子通过脂肪酸含量分析表明,油酸含量比对照有了很大的提高。

中间锦鸡儿FAD2基因拷贝数检测及组织表达谱分析

【目的】探索中间锦鸡儿基因组中FAD2基因的拷贝数,分析不同拷贝的表达模式,以期揭示不同拷贝在植物体内的功能分工。【方法】根据中间锦鸡儿(Caragana intermedia)FAD2基因的保守序列设计1对引物SF和SR,利用该引物对PCR扩增制备114 bp的Southern检测探针,探针进行地高辛标记后,采用罗氏Southern杂交试剂盒进行Southern检测。根据中间锦鸡儿3个FAD2基因各自的特异差异序列,分别设计定量PCR引物序列,以actin基因为内参,对中间锦鸡儿的根、茎、叶及不同发育时期(发芽15,25,35 d)种子的cDNA进行定量PCR分析。【结果】中间锦鸡儿FAD2基因至少有4个拷贝,且不同拷贝的表达模式不同。FAD2-2A基因在根和发育中期、后期的种子中低水平表达,在幼嫩的茎、叶以及发育早期的种子中高水平表达;FAD2-1A基因在根中的表达量最低,在种子发育早期、中期大量表达,在幼嫩叶子中表达水平也较高;FAD2-1B基因仅在种子发育中期大量表达,在其他组织及种子其他发育阶段的表达量均保持在本底水平。在不同组织以及种子的不同发育时期,FAD2-1A相对表达量的变化幅度最大,达到了近100倍,FAD2-1B次之,FAD2-2A最小。【结论】结合序列比对分析推测:FAD2-2A基因可能主要负责合成膜脂中的亚油酸,FAD2-1A主要负责种子及叶子贮脂中亚油酸的合成,FAD2-1B负责种子贮脂中油酸的去饱和作用。

玉米FAD2基因RNA干涉表达载体的构建及转化

根据已克隆的ZmFAD2基因(GenBank登陆号:DQ496227)设计引物,通过RT-PCR扩增得到120 bp的特异性基因片段作为hpRNA干涉片段。利用pUCCRNA i与pUb i.cas为中间载体,成功构建了含Ub iqu itin启动子和hpRNA i片段的干涉表达载体p1 300+UFIFN。以自主选育的高油玉米自交系幼胚为材料,诱导、继代出胚性愈伤组织,利用携带p1 300+UFIFN质粒的根癌农杆菌LBA4404对其进行遗传转化。对抗性植株进行PCR检测,共获得6株转基因阳性株。

中间锦鸡儿fad2基因片段克隆、反义表达载体构建及遗传转化初步研究

以我国重要的生物能源灌木——中间锦鸡儿枝叶和种子为材料,根据GenBank中已经发表fad2基因的同源序列,利用PCR技术克隆得到基因片段。在GenBank中Blast(GenBank登录号AY957393)所得基因片段和同属豆科的Glycine max Gmfad2-2a同源性高达88%,位于fad2基因编码区中部。将所得片段经BamHI和SacI酶切后插入表达载体质粒pBI121,构建了反义表达载体pBI121fad2,并利用农杆菌介导法转入烟草叶片,获得了抗卡那霉素和氨苄青霉素的再生烟草植株。初步分析结果表明:与对照烟草相比,转基因烟草种子脂肪酸含量没有明显差异,而亚油酸则减少10.3%。

不同作物FAD2基因密码子偏好性分析

本研究运用多种软件对12种作物的FAD2基因进行密码子偏好性分析。结果表明:FAD2基因在12种作物中密码子使用偏好性差异很大,禾本科作物玉米、水稻、高粱的FAD2基因有效密码子数(Effec-tive Number of Codons,ENC)在30左右,为偏好性很强的基因;油料作物油菜和亚麻的FAD2基因的ENC值分别为45.49和48.58,为一般偏好性基因;另外6种油料作物和模式植物拟南芥的FAD2基因ENC值都大于50,偏好性较弱。玉米、水稻、高粱、油菜、亚麻、花生和拟南芥的FAD2基因偏好以G或C碱基结尾的密码子,其余5种油料作物的FAD2基因偏好使用以A或T结尾的密码子。在12种作物中,密码子CTC的RSCU值都大于1,属于高频使用的密码子;而CTA、ATA、GTA、AGT、CCC属于低频密码子。在聚类分析中,12种作物基于FAD2基因密码子用法与基于CDS序列的聚类结果大体一致。

中间锦鸡儿种子特异性fad2基因克隆及fad2-1A基因酵母表达载体的构建

Δ12脂肪酸脱氢酶(Δ12 fatty acid desaturase,Δ12 FAD,也称为fad2)催化油酸生成亚油酸,是植物体内生成多不饱和脂肪酸的关键酶,种子中特异表达的fad2基因负责种子贮脂中多不饱和脂肪酸亚油酸的生成,决定种子油脂的成分和营养价值。采用RT-PCR和RACE技术从中间锦鸡儿未成熟种子中克隆了种子特异表达的fad2-1A、fad2-1B基因,fad2-1A编码的前283个氨基酸与fad2-1B的同源性高达98.9%,前者比后者多编码97个氨基酸,全部氨基酸残基的同源性为70.71%。将fad2-1A克隆到真核表达载体pYES2中,构建了重组质粒pYES2-fad2-1A,经PCR检测、质粒酶切、测序等检测,目的基因确实插入重组质粒,且方向正确,为进一步研究fad2基因的功能和表达调控机理奠定了基础。

根结线虫16D10基因与花生FAD2基因RNAi载体构建

针对根结线虫16D10基因和花生Δ12脂肪酸脱氢酶(FAD2)基因的核酸序列设计了两条含有GUS内含子的RNA干扰结构序列。以pBS-T质粒为中间载体,将这段序列连接进植物转化载体pRI 101-AN中,获得针对两个基因的RNAi载体。经SalⅠ和KpnⅠ双酶切验证,目的序列已准确插入目标载体。此载体可用以培育抗根结线虫病和高油酸花生新品种。

甘蓝型油菜和Lesquerella fendleri fad2基因片段克隆及hpRNA植物表达载体的构建

首先利用PCR从甘蓝型油菜(Brassica napus L.)和Lesquerella fendleri基因组DNA中分别扩增出Δ12-脂肪酸去饱和酶fad2基因片段,再以扩增出的片段为模板设计引物从一端扩增出相应的小片段,然后将同一基因的大小片段反向连接,插入到种子特异表达载体2300-nap多克隆位点的napin启动子和nos终止子之间,构建成可以在种子中转录表达发夹RNA(Hairpin RNA,hpRNA)结构的植物表达载体.

赤桉FAD2基因全长cDNA的克隆与生物信息学分析

桉树是世界上重要的多功能树种,从桉叶中提取的桉叶油含有不饱和脂肪酸,对于桉叶油的药用活性和桉树的抗逆性具有重要的作用。为深入了解桉树的不饱和脂肪酸的生物合成途径和分子调控机理,本研究根据FAD2基因的保守区段设计兼并引物,从赤桉嫩叶中获得了一条FAD2基因的片段,并进一步利用RACE技术得到了此基因的全长cDNA,将其命名为EC-FAD2基因。通过生物信息学分析发现,该基因全长cDNA为1 472 bp,编码389个氨基酸,并且具有FAD2蛋白特有的保守序列和相关特征。经过比对分析,发现赤桉的FAD2蛋白与其他植物的FAD2蛋白具有较高的相似性。