三步法制备级纯化抗CD20(Fab′)_2

目的在小规模蛋白纯化系统AKTA prime上建立制备级纯化抗CD20(Fab′)2的方法。方法将通过高渗溶液提取的周质腔蛋白抗CD20(Fab′)2依次经过离子柱、疏水柱和亲和柱纯化,采用蛋白电泳和高效液相色谱法分析检测其分离效果及纯度,同时测定其与Raji细胞的结合活性。结果在该纯化条件下一次可获得8mg纯度为96.678%的抗CD20(Fab′)2,其与CD20+Raji细胞的结合活性与采用亲和柱联合分子筛柱得到的抗体活性基本一致。结论三步法制备级纯化抗CD20(Fab′)2操作简单,能获得制备级高纯度抗CD20(Fab′)2。

抗CD20嵌合抗体片段Fab′突变体的表达和活性研究

利用PCR方法从抗CD2 0单链抗体 (ScFv)表达载体上扩增抗CD2 0抗体轻链可变区基因 (VL)、重链可变区基因 (VH) ,同时在抗体的可变区引入突变 ,然后将VH、VL 基因重组到Fab′表达载体pYZF1中 ,构建抗CD2 0嵌合抗体Fab′片段表达载体 ,并在大肠杆菌 16c9中进行高效可溶性分泌表达。经大量的筛选 ,获得一个产量和活性均有所提高的突变克隆。其突变位点在轻链可变区的CDR1区 ,即G77→A(Ser→Asn)。突变的抗体的表达量为每克干菌 3 8mg ,而未突变抗体的表达量为每克干菌 1.3mg。突变体的亲和力常数Ka为 2 .2× 10 9L mol,约为突变前的 2倍。竞争性免疫荧光抑制实验表明 ,突变的Fab′片段能竞争性抑制鼠源性抗CD2 0抗体HI4 7和CD2 0表达细胞Raji细胞的结合 ,使HI4 7的结合阳性率由 98%下降至 37.5 5 % 。

平阳霉素与单克隆抗体Fab′片段偶联物的抗肿瘤作用

目的 研制一种以单抗Fab′片段为基础的抗肿瘤导向药物。方法 制备单抗 3A5Fab′片段及其与平阳霉素 (PYM )偶联物Fab′ PYM后 ,测定Fab′ PYM与肿瘤细胞的免疫反应性、偶联物中PYM的抑菌活性、对肿瘤细胞的杀伤作用和体内抑瘤作用。结果 Fab′及Fab′ PYM保持了与靶细胞C2 6的免疫反应性 ;偶联物中PYM的抑菌活性为游离PYM的 15 % ;Fab′ PYM对C2 6细胞的杀伤作用强于PYM ;对非靶细胞KB的杀伤作用与PYM相似 ;ip和iv给药 ,Fab′ PYM对小鼠皮下接种的肠癌 2 6生长抑制作用均强于 3A5 PYM和PYM。结论 Fab′ PYM具有比PYM及 3A5

鸡卵黄抗体Fab′的制备及鉴定

目的鸡卵黄抗体(immunoglobulin Y,IgY)的活性片段Fab′免疫原性低,可口服用于预防胃肠道感染。文中制备并鉴定IgY Fab′片段。方法采用胃蛋白酶水解法制备Fab′,对酶与IgY混和质量比、pH值、酶解时间进行优化;采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)及Western blot对酶解产物进行鉴定。结果胃蛋白酶∶IgY的质量比为1∶40,缓冲液pH4.2,酶解时间9 h的条件下,可得到无pFc片段的特异性抗体Fab′片段。结论获得制备IgY Fab′的最佳条件,得到的Fab′产量高、纯度高,特异性强,是规模化制备特异性Fab′片段的良好的实验方法。

抗CD20嵌合抗体片段Fab′突变体对B淋巴细胞凋亡及胞内Ca^(2+)的影响

目的研究抗CD20嵌合抗体片段Fab′突变体诱导B淋巴细胞凋亡的发生、凋亡相关基因表达以及细胞内钙离子的浓度变化。方法以人B淋巴细胞(Raji细胞)为凋亡细胞模型,通过MTT法、Western blot和流式细胞仪等方法观察bcl-2/bax基因表达、细胞色素c及胞内Ca2+的变化。结果抗CD20嵌合抗体片段Fab′突变体对Raji细胞生长增殖具有明显的抑制作用,并呈剂量依赖性。细胞中bcl-2表达有微弱的下降,而bax表达明显升高,并出现细胞色素c的释放和胞内Ca2+浓度的升高。结论抗CD20嵌合抗体片段Fab′突变体诱导Raji细胞凋亡,与bcl-2/bax表达、细胞色素c的释放和胞内Ca2+浓度的升高有关。

嵌合抗CD_(20) Fab′对B淋巴瘤细胞Raji细胞生长的影响

目的：研究嵌合抗CD_(20)基因工程抗体Fab′的抗肿瘤活性。方法：利用MTT法以及3H掺入法测定嵌合抗CD_(20) Fab′对Raji细胞生长的影响。结果：MTT法测定结果显示嵌合抗CD_(20) Fab′对Raji细胞的生长具有抑制作用，抑制作用成剂量依赖性，其IC50为24μg／ml；嵌合抗CD_(20) Fab′对3H－TdR掺入Raji细胞无抑制作用，表明抗CD_(20) Fab′不影响Raji细胞DNA的合成；但嵌合抗CD_(20) Fab′抑制3H－UdR掺入Raji细胞，表明嵌合抗CD_(20) Fab′对Raji细胞RNA合成具有抑制作用，其抑制作用成剂量相关性。结论：嵌合抗CD_(20) Fab′抑制Raji细胞生长，嵌合抗CD_(20) Fab′具有较好的抗肿瘤活性。

抗CD_3基因工程嵌合抗体片段Fab′的构建、表达和活性测定

PCR扩增抗CD3单抗轻链可变区 (VL)和重链可变 (VH)片段基因 ,将其重组到Fab′表达载体中 ,构建成抗CD3嵌合抗体Fab′表达载体 ,转化大肠杆菌 16C9进行可溶性表达。产物经蛋白G亲和层析柱纯化。免疫荧光竞争结合实验和3H掺入实验证实能与小鼠抗CD3IgGHIT3a竞争性结合表达CD3的T淋巴细胞 。

嵌合抗CD20 Fab′诱导Raji细胞凋亡

为了研究嵌合抗CD2 0基因工程抗体Fab′的抗肿瘤活性及其抗肿瘤机制 ,利用3H掺入法测定嵌合抗CD2 0Fab′对Raji细胞生长的影响 ,结果显示嵌合抗CD2 0Fab′对Raji细胞的生长具有抑制作用 ,利用流式细胞仪测定嵌合抗CD2 0Fab′诱导Raji细胞凋亡作用 ,结果显示嵌合抗CD2 0Fab′可诱导Raji细胞凋亡作用。这些实验结果证明嵌合抗CD2 0Fab′通过诱导Raji细胞凋亡的机制抑制Raji细胞生长。

IgG型自身抗体Fab段遮断红细胞自身抗原的探索研究

目的应用自身抗体的Fab段结合红细胞上的自身抗原,以遮断完整自身抗体与自身抗原的结合。方法含自身抗体的患者血清,通过吸收放散试验获得成分单一的自身抗体,再应用木瓜酶37℃过夜水解自身抗体IgG分子获得Fab段,用Fab段特异性结合相对应的自身抗原,从而遮断完整自身抗体与自身抗原的结合。结果3例含自身抗体的患者血浆标本,经过吸收放散试验获得的组分单一的自身抗体,均经过木瓜酶水解处理生成Fab段,此Fab段与各自放散液中的完整自身抗体混合后,均能遮断完整自身抗体与红细胞自身抗原的结合。同时3例标本之间,1号标本与2号标本的有相互遮断效应,而2号标本和3号标本之间未见相互遮断效应。结论自身抗体Fab段能消除完整自身抗体与红细胞自身抗原的凝集,此方法可以应用到临床实践中,解决多种临床问题。

扩大FAB法焊接范围技术研究与应用

文中介绍了扩大FAB法焊接范围的工艺方法,从焊接材料、焊接设备、坡口准备、焊接参数及操作要点等方面进行研究,突破了国内外FAB单丝焊接25 mm的板厚上限,实现30 mm厚度钢板FAB单丝焊接,为21万吨散货船槽型舱壁分段制作全面采用FAB法焊接提供了技术支撑,焊接效率提升2倍以上,槽型舱壁分段制作周期缩短3天以上。

SWA-Fab'对肿瘤细胞的凋亡作用(英文)

目的研究SEA-Fab'对肿瘤细胞的凋亡作用及单克隆抗体于肿瘤定向治疗作用.方法实验分为三组:SEA-Fab'、SEA及对照组,三组肿瘤细胞分别用SEA-Fab'、SEA及PBMC+Walker-256细胞处理,在24～72 h内观察肿瘤细胞的凋亡情况.结果SEA-Fab'组、SEA组的肿瘤细胞指数分别为(34.6%～68.9%)和(15.5%～31.9%)高于对照组(5.5%～12.5%),差异存在显著性,SEA-Fab'组高于SEA组差异显著.结论SEA-Fab'在激活T细胞和杀死肿瘤细胞效果好于SEA,将来有可能利用单克隆抗体来作定向靶位治疗.

Fab Lab创新模式及其启示

信息技术融合与发展为科技创新模式嬗变提供了新机遇。本文讨论了Fab Lab创新模式的发展背景及典型案例,并重点分析了其对我国以用户创新为中心的应用创新实践的理论及现实意义,以期引发研究与实践领域围绕用户参与的创新2.0模式发展的深入思考。

人源中和性抗汉滩病毒单克隆抗体Fab段基因的获得和表达

运用噬菌体表面表达（Ｐｈａｇｅｄｉｓｐｌａｙ）技术，获得人源中和性抗汉滩病毒汉滩型Ｇ１基因工程单克隆抗体（单抗）Ｆａｂ段基因及其表达，并同时获得抗汉滩病毒核蛋白（ＮＰ）的Ｆａｂ抗体。从肾综合征出血热疫区恢复期病人抗凝血中分离到的外周淋巴细胞中，提取了总细胞ＲＮＡ。通过ＲＴ－ＰＣＲ方法，用一组人ＩｇＧＦａｂ基因特异性引物，从合成的ｃＤＮＡ中经ＰＣＲ扩增了一组轻链和重链Ｆａｂ段基因，将轻链和重链先后插入噬菌体载体ｐＣｏｍｂ３，成功地建立了抗汉滩病毒抗体基因库，并用纯化的汉滩病毒颗粒及抗汉滩病毒糖蛋白鼠单抗捕捉糖蛋白抗体原的方法，对此抗体库进行了富集筛选，在短期内成功地获得了抗汉滩病毒核蛋白和糖蛋白Ｇ１的人源单抗Ｆａｂ段基因，并在大肠杆菌中获得有效表达。核苷酸序列分析证实，所获得的基因为人源ＩｇＧＦａｂ基因。用特异性放射免疫沉淀（ＩＰ）、ＩＦＡＴ和ＥＬＩＳＡ以及空斑减少中和试验鉴定表明，表达的人Ｆａｂ抗体能识别汉滩病毒结构蛋白，其中抗Ｇ１人Ｆａｂ抗体具有体外中和活性。人源抗汉滩病毒基因工程抗体的获得，为今后可能的临床应用提供了良好前景。

人源性抗HBsAg抗体Fab段在酵母中的表达

通过分步整合的方式 ,将人源性抗乙肝表面抗原 (HBsAg)抗体Fab的轻、重链基因分步整合到巴斯德毕赤(Pichiapastoris)酵母GS115菌株的染色体上 ,经甲醇诱导 ,成功地分泌表达出抗HBsAg抗体的Fab片段 ,表达量达5 0～ 80mg L。ELISA结果显示重组酵母分泌表达出的Fab具有较强的结合HBsAg的能力。通过抗Fab的抗体柱亲和层析 。

抗HBsAg抗体Fab段在大肠肝菌中的高效表达与复性

将抗ＨＢｓＡｇ 抗体的轻链（Ｌ）和重链Ｆｄ 段基因，分别克隆于ｐＥＴ２０ｂ 质粒中并分别转化到大肠肝菌ＢＬ２１（ＤＥ３），ＬＰＴＧ诱导后，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析发现在２７ＫＤ（Ｌ）和２５ＫＤ（Ｆｄ）处有外源蛋白表达，表达蛋白含量分别为５３％ 和４８％ 。Ｌ链和Ｆｄ 包涵体蛋白经盐酸胍变性后，等量混合于折叠液中，Ｌ和Ｆｄ 可复性形成了约５０ＫＤ的蛋白。ＥＬＩＳＡ结果表明，复性蛋白具有与ＨＢｓＡｇ 结合的能力。抗ＨＢｓＡｇ 抗体Ｆａｂ 段在大肠杆菌中的表达与复性的成功，表明包涵体表达基因工程抗体在技术是可行的。

397例急性白血病细胞遗传学与FAB分型相关性研究

本研究探讨急性白血病的细胞遗传学改变,了解染色体核型异常与急性白血病FAB分型的关系及其对预后因素的影响。397例急性白血病患者于治疗前抽取骨髓标本,采用短期细胞培养法制备染色体标本,应用G显带技术进行染色体核型分析。结果显示,397例急性白血病中78例无分裂相,319例可供染色体核型分析的患者中染色体核型异常175例(占54.9%)。在急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓系白血病(AML)和急性混合细胞白血病(AMLL)3种类型的白血病患者中,染色体核型异常分别为33/120例(占27.5%)、129/252例(占51.2%)和13/25例(占52.0%)。超二倍体41例(占23.4%),亚二倍体22例(占12.5%),正常二倍体112例(占64.0%)。AML染色体核型异常中与FAB分型相关的特异性染色体重排74/129例(占57.4%)。结论:大约55%左右的急性白血病存在克隆性染色体异常,一些特异性染色体异常改变是急性白血病的细胞遗传学特征,与急性白血病的FAB分型有明显相关性,染色体检查和分子遗传学方法相结合,对于白血病的诊断、分型、治疗和预后都具有重要意义。

抗乙型肝炎表面抗原Fab片段联合抗细胞核单抗为载体的肝癌放射免疫治疗实验研究

目的探讨核素标记人源化抗(乙型肝炎)乙肝表面抗原Fab片段(抗HBsAgFab)联合核素标记抗细胞核单克隆抗体(chTNT)瘤内注射治疗荷人肝癌移植瘤裸鼠的可行性和优越性,为临床应用核素标记多种不同性质的单克隆抗体进行放射免疫治疗肝癌提供实验依据。方法荷瘤裸鼠分为五组,分别瘤内注射131I-抗HBsAgFab、131I-chTNT、131I-抗HBsAgFab联合131I-chTNT、131I-无关抗体(131I-IgG)及PBS。治疗后行SPECT显像观察标记抗体在肿瘤内的浓聚,并测量肿瘤大小变化,计算肿瘤抑制率。结果研究发现2种标记抗体联合应用组的肿瘤抑制率为73.09%,明显高于131I-抗HBsAgFab组的47.8%和131I-chTNT组的54.26%。联合应用组标记抗体在肿瘤组织/非肿瘤组织内的放射活度比值(T/NT值)大于单独应用组。结论131I-抗HBsAgFab联合131I-chTNT瘤内注射放射免疫治疗可增加标记抗体在肿瘤组织内的浓聚,并能提高放射免疫治疗效果。

IgG Fab-BPI融合蛋白真核表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达

目的构建抗抗LPSFab-BPI真核表达载体,并在CHO细胞中表达。方法通过RT-PCR,获得广谱抗LPSmAbC3A2IgG的Fd和完整轻链LCcDNA片段。在分别构建了pcDNA3-Fd和pcDNA3-LC表达载体的基础上,将包括BPIN端抗LPS活性中心的180bpDNA片段,通过一段长16个氨基酸的linker连接于上述Fab表达载体中Fd基因的下游,构建成Fab-BPI融合蛋白FB真核表达载体。将pcDNA3-LC质粒中包括hCMV启动子、LC和BGHpolyA等序列在内的片段,插入到pcDNA3-Fd中hCMV启动子上游,从而构建成单质粒的Fab-BPI表达载体pcD-NA3-FB,转染真核细胞。结果序列测定表明,重组质粒构建正确。pcDNA3-FB转染CHO细胞后,经ELISA、免疫荧光和mR-NA鉴定表达成功,免疫印迹试验显示,与抗κ轻链和抗BPI抗体反应的蛋白区带的Mr均为60000左右。交叉反应试验证明,Fab和FB与多种革兰氏阴性菌的LPS有交叉反应性。结论成功地在CHO细胞中表达出了抗LPSFab-BPIFB融合蛋白。FB作为融合蛋白,集广泛交叉反应性和强大中和活性于一身,有可能成为更适于临床应用的新的抗LPS免疫制剂。

人源噬菌体Fab抗体库构建过程中引物的优化和初步鉴定

目的 优化设计一套引物 ,扩增全套人抗体Fd片段和L链基因 ,改善扩增效率 ,益于人源噬菌体抗体库的构建。方法 根据V BASE数据库提供的人抗体可变区胚系基因 ,在其家族分类基础上 ,根据FR1区 5’端保守序列重新分组 ,设计特异性的 5’端扩增引物。同时对设计引物的匹配情况进行分析 ,并应用PCR扩增和测序反应对其扩增效果进行鉴定。结果 Fd链 5’端扩增引物有 5条 ,κ轻链有 6条 5’端扩增引物 ,而λ轻链 5’和 3’扩增引物有 10条。分析表明 ,人抗体可变区胚系基因与 5’引物有较好的匹配率 ,数目较少 ,匹配率较高。PCR结果显示 ,全部的重链及轻链引物对均能高效扩增出特异性较高的目的片段。测序结果表明PCR扩增产物具有较好的亚类和可变区家族分布。结论 优化了一套扩增全套人抗体Fd片段和L基因的引物 。