FLAG标签纳米抗体的筛选、表达及验证

纳米抗体是一种新型的蛋白质工程抗体,其体积小、稳定性强、亲和力高等特性为科学研究提供了新的可能性。FLAG标签是一种广泛应用于生物学研究中的短肽标签,在生物学研究中具有重要的作用。为了制备FLAG标签的纳米抗体,利用酵母双杂交技术筛选出具有高亲和力的纳米抗体,并对制备的FLAG纳米抗体进行性能检验。通过DNA重组技术,构建包含FLAG的诱饵载体,利用酵母双杂交技术,在驼源纳米抗体酵母文库中,筛选针对FLAG标签纳米抗体。在酵母文库中筛选出5个单一的候选抗体DNA序列,为了排除载体本身表达蛋白序列对抗体筛选带来的干扰,通过“点对点”验证方法排除非特异性杂交的可能,通过该操作确认所筛选的5株纳米抗体均能与FLAG标签发生特异性亲和反应。为了制备纳米抗体,构建了5个纳米抗体原核表达载体,并利用大肠杆菌体系进行表达。通过SDS-PAGE和Western杂交(WB)分析,结果显示,成功获得2株可溶性表达的抗FLAG标签蛋白纳米抗体。对这2株纳米抗体与商品化的常规FLAG标签抗体进行效果比对,结果显示制备的2株纳米抗体与商品化抗体均能够识别FLAG多肽及含有FLAG标签的融合蛋白,且在特异性上没有明显区别,表明制备的FLAG纳米抗体具有较好的应用前景。基于酵母双杂交技术,成功筛选并制备了FLAG标签纳米抗体,这一成果不仅丰富了纳米抗体的类型,也为抗体开发及应用提供了新的途径。该研究为进一步研究FLAG标签在生物学研究中的应用,以及纳米抗体在生物工程中的应用提供有力支持。

C端带Flag标签重组小鼠IL-33慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建C端携带Flag标签蛋白的重组小鼠IL-33慢病毒表达载体,为进一步研究IL-33在肿瘤免疫中的作用提供实验基础。方法设计引物在小鼠IL-33基因的C端加入Flag标签,PCR法扩增带有标签的目的基因,再接入经酶切后的线性化pLVX-puro慢病毒载体。带标签的目的基因重组载体用两种限制性内切酶ApaI和XhoI酶切后,进行琼脂糖凝胶电泳鉴定,最后测定目的基因序列。结果成功构建重组小鼠IL-33慢病毒表达载体并将Flag标签成功插入到目的基因的C端。结论成功构建了重组慢病毒表达载体pLVX-mIL-33-Flag,为下一步在肿瘤中研究IL-33的作用和机制奠定了基础。

N-端加flag标签增加P21^(Cip1/WAF1)蛋白质稳定性

背景与目的已知细胞分裂周期抑制因子P21通过蛋白酶体通路降解,其氨基端的泛素化可能参与了这一过程。Flag为一蛋白标签,常用于标记重组蛋白质,以便对靶蛋白进行生物学功能分析。本文旨在研究N-端加flag对P21蛋白质稳定性的影响。材料与方法建立稳定表达外源flag-p21蛋白质的NIH3T3细胞株,应用蛋白印迹法(WB)检测NIH3T3细胞表达的flag-p21,并比较其与内源P21蛋白质半衰期的差异;确定阻断蛋白酶体水解通路对其降解过程的影响。结果NIH3T3细胞表达的内源P21蛋白质半衰期约30min,而同一细胞表达的flag-p21融合蛋白半衰期则明显延长;用抑制剂MG-132阻断蛋白酶体水解通路后,P21蛋白质的量明显增加,但同一细胞内表达的flag-p21量却无明显改变。结论N-端加flag标签可增加P21蛋白质的稳定性。在对P21蛋白质的生物学功能进行研究时,应考虑N-端加flag对P21泛素化-蛋白酶体依赖的降解过程的影响。

Flag标签抗原的偶联及其单克隆抗体的应用研究

探讨不同免疫原制备抗Flag标签单克隆抗体的效果,以及Flag标签单克隆抗体在融合蛋白纯化中的应用。通过碳化二亚胺分别合成Flag-BSA、Flag-OVA、Flag-KLH3种完全抗原,采用SDS-PAGE和免疫效价对比方法确定偶联效果,选最优者利用杂交瘤技术制备抗Flag标签单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备腹水,并对其纯化、分析和鉴定。制备交联抗Flag-mAb的亲和层析柱,纯化带Flag标签的融合蛋白,经SDS-PAGE电泳后薄层扫描分析纯度,用Western blot检测mAb对融合蛋白的反应性。Flag-KLH偶联效果最好,小鼠免疫效价在104以上,共制备3株抗Flag标签单克隆抗体杂交瘤细胞株2B-7、3C-5、5F-2,分泌抗体均为IgG1类型,与其他融合蛋白标签无交叉反应,经亲和层析纯化融合蛋白纯度达85%,且都可用于融合蛋白的Western blot检测,建立了带Flag标签的融合蛋白纯化和检测方法。成功偶联了Falg完全抗原并制备单克隆抗体,为带Flag标签的融合蛋白纯化提供重要工具。

抗FLAG标签单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

碳化二亚胺法合成FLAG-BSA完全抗原,利用杂交瘤技术制备5株分泌抗FLAG标签单克隆抗体的杂交瘤细胞株。制备腹水,并对其进行纯化、分析和鉴定。制备交联抗FLAGmAb亲和层析柱,纯化带FLAG标签的融合蛋白,经SDS-PAGE电泳后薄层扫描分析纯度,用Western-blotting检测mAb对融合蛋白的反应性。结果表明:5株细胞分泌的单抗都为IgG类型、IgG1亚类,腹水效价均高于1∶106,且5株单抗与其它融合蛋白标签无交叉反应性;亲和层析纯化后蛋白纯度达85%以上,5株单抗均可用于融合蛋白的Western-blotting检测,建立了可用于FLAG融合蛋白纯化和检测方法。

利用CRISPR/Cas系统构建在XRCC6内源基因插入Flag标签序列的HeLa细胞系

目的:利用CRISPR/Cas系统在XRCC6基因5′端插入Flag标签序列,筛选XRCC6-Flag稳定表达的宫颈癌细胞(He La)株。方法:根据Gen Bank中XRCC6基因序列,设计XRCC6基因敲入的g RNA序列,构建入p Cas-Guide载体中,获得p Cas-XRCC6载体;设计XRCC6基因的同源臂序列,利用搭桥PCR方法将同源臂和Flag标签序列作为模板进行扩增,得到供体DNA片段,并将其克隆到p Back Zero-T表达载体上,获得p XRCC6-Donor载体;将上述2个载体共转染He La细胞,采用PCR、Western印迹等方法检测和筛选Flag标签序列插入XRCC6基因5′端的细胞株。结果:构建了p Cas-XRCC6和p XRCC6-Donor载体,筛选获得3株XRCC6-Flag稳定表达细胞株。结论:构建了XRCC6-Flag稳定细胞株,为研究XRCC6基因及其蛋白产物的生物学功能奠定了基础。

携带FLAG标签的人BTG2真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达

目的:构建人B细胞易位基因2(BTG2)真核表达载体,并在HeLa细胞中表达携带FLAG标签的BTG2蛋白,为阐明BTG2基因的功能提供实验工具。方法:利用PCR法获得全长BTG2片段,将扩增得到的片段插入真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)的多克隆位点;然后按照FLAG序列设计并合成寡核苷酸片段,插入pcDNA3.1(+)-BTG2载体,构建pcDNA3.1(+)-FLAG-BTG2载体;将以上重组质粒转染HeLa细胞,将细胞分为转染pcDNA3.1(+)空载体组、转染pcDNA3.1(+)-BTG2组和转染pcDNA3.1(+)-FLAG-BTG2组,采用抗FLAG抗体的Western blotting法,检测FLAG-BTG2融合蛋白在HeLa细胞中的表达水平。结果:将全长BTG2片段链接于pcDNA3.1(+)质粒,经限制性核酸内切酶BamHⅠ酶切分析及DNA测序证实载体序列准确;该载体转染HeLa细胞后用抗FLAG抗体进行Western blotting法检测,在空载体组和pcDNA3.1(+)-BTG2组HeLa细胞中检测不到FLAG融合蛋白的表达,而在转染pcDNA3.1(+)-FLAG-BTG2组中检测到FLAG-BTG2融合蛋白的表达。结论:成功构建了pcDNA3.1(+)-FLAG-BTG2真核表达载体,并能在HeLa细胞中有效表达携带FLAG标签的BTG2蛋白。

口蹄疫病毒3A蛋白和FLAG标签的融合表达与血清学分析

通过对比各短肽标签,选择由8个氨基酸组成的FLAG标签弥补口蹄疫疫苗毒株OZK 3A蛋白的93～102位10个氨基酸缺失,原核表达FLAG与3A的嵌合蛋白,并命名为3AF。同时也表达了OZK毒株原始3A蛋白。分别以3A和3AF蛋白作为免疫原免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠,采用ELISA和Western-blot分析融合蛋白的血清学反应活性。结果表明,3A蛋白和3AF蛋白均能在大肠杆菌中有效表达,且主要以可溶性形式表达。纯化的3AF蛋白能与FLAG单抗特异性反应而未能诱导免疫小鼠产生针对该标签的抗体,体现了体外和体内的生物反应性差异。FLAG标签对3A蛋白的表达水平、表达形式等未产生显著影响。本研究为下一步FLAG标记病毒的拯救及其应用奠定了基础。

三种FLAG融合标签的构建、表达及亲和常数测定

FLAG融合标签是由8个氨基酸组成的短肽,可用于重组蛋白的免疫吸附纯化。为了建立一个基于FLAG融合标签的共表达纯化体系,将2个新的FLAG标签序列DYKDYKDYK和DYKDEDDK与FLAG标签的原有序列DYKDDDDK分别命名为FLAG1、FLAG2和FLAG3,利用PCR将FLAG标签融合到SHP2酪氨酸磷酸酶NSH2结构域序列的C端,并将其重组到原核表达载体pGEX-2T中,并在大肠杆菌中进行表达。利用GST亲和层析柱和分子筛层析柱纯化融合蛋白,Western blotting法检测其免疫活性。免疫印迹结果表明,3个FLAG融合标签都可以被抗-FLAG单克隆抗体M2(AFM2)特异性识别。利用ELISA技术测定3个FLAG标签与AFM2的亲和常数(1/Kd),其Kd值分别为0.143 80、.128 1、0.080 1μmol/L。

c-flag-ago3质粒在人293细胞系中的表达及AGO3蛋白复合物的细胞定位

将c-flag-ago3质粒转入人293细胞系中,使c-flaga-go3基因稳定表达,为进一步研究AGO3蛋白复合物的结构、功能奠定了基础。利用亲和标签flag对目标蛋白进行检测和监测,将已合成的c-flag-ago3质粒和用于对照的质粒si-ago3(能使ago3基因沉默的质粒)导入人293细胞系中,在荧光镜下观察转染效果。RT-PCR法检测基因含量,蛋白印迹法(WB)检测人293细胞表达的flag-ago3,并对其蛋白复合物进行细胞定位。结果显示,c-flag-ago3质粒和si-ago3质粒成功地导入人293细胞系中,免疫细胞化学显示c-flag-ago3基因在细胞中高表达、并检测到AGO3复合物定位于细胞质中。AGO3复合物在细胞中可稳定表达,为进一步研究AGO3蛋白复合物的构成及其在人体中的功能奠定了基础。

绵羊PLC-γ1基因真核表达载体的构建及鉴定

目的旨在构建携带红色荧光蛋白(RFP)报告基因的绵羊PLC-γ1非融合性真核表达载体。方法在原有PUC57-PLC-γ1克隆载体基础上,对目的片段N端前加入P2A序列和3个连续Flag序列后使用HindⅢ酶和SalⅠ酶双酶切获得P2A-3×Flag-PLC-γ1片段,将其连接至pDsRed2-C1载体获得重组质粒pDsRed2-C1-P2A-3×Flag-PLC-γ1;然后采用Lip 2000转染试剂将该重组质粒转染至HEK-293T细胞,最后利用荧光显微镜、qRT-PCR、Western blot、免疫共沉淀(IP)和免疫荧光(IF)法鉴定重组质粒pDsRed2-C1-P2A-3×Flag-PLC-γ1的表达及亚细胞定位情况。结果双酶切和测序结果显示质粒pDsRed2-C1-P2A-3×Flag-PLC-γ1构建成功,观察到红色荧光;免疫荧光的亚细胞定位检测出PLC-γ1蛋白在细胞质中表达;qRT-PCR和Western blotting法均能检测出PLC-γ1表达,与对照组有显著性差异(P>0.01);免疫共沉淀也纯化分离出含有Flag标签的PLC-γ1蛋白。结论本研究成功构建绵羊PLC-γ1基因的真核表达载体,在P2A肽作用下实现目的蛋白PLC-γ1与DsRed2的表达,构建的载体可用于研究PLC-γ1在早期胚胎发育中的作用。

Klotho基因真核表达载体的构建及其在TCMK-1细胞中的稳定表达

目的构建小鼠Klotho基因真核表达载体,进而获得稳定表达Klotho分子的小鼠肾上皮细胞株TCMK-1。方法应用PCR方法扩增带有FLAG标签的Klotho编码基因,并克隆至载体pCD-CXIN(CMVMCS-IRES-Neomycin)的相应位点;经酶切及测序鉴定重组质粒,脂质体转染TCMK-1细胞,通过G418筛选得到稳定表达Klotho分子的TCMK-1细胞株;Real-Time PCR检测Klotho mRNA水平,Western blotting检测Klotho蛋白的表达。结果将带有FLAG标签的Klotho基因重组表达载体转染至TCMK-1细胞后,经G418筛选获得TCMK-1细胞株。与对照组相比,Klotho mRNA和蛋白表达均显著升高。结论成功构建了Klotho基因的重组表达载体,并获得了稳定表达Klotho基因的TCMK-1细胞株,为进一步研究Klotho基因和蛋白在小鼠肾上皮细胞中的作用奠定了基础。

拟南芥细胞周期调控因子KRP2的原核表达及蛋白纯化

表皮毛是由高等植物地上部组织表皮细胞发育而来的一种特殊结构,细胞周期调控因子在植物表皮毛细胞形态的建成过程中发挥着重要作用。利用原核表达系统,构建pET-28a-KRP2-FLAG融合表达载体,在大肠杆菌中对拟南芥细胞周期依赖激酶抑制因子KRP2进行了体外表达,并利用蛋白标签FLAG和His对目的蛋白进行纯化。结果表明,在大肠杆菌系统中成功对KRP2-FLAG进行了体外表达并得到了纯化的蛋白,蛋白量为0.87mg。这为进一步研究KRP2在表皮毛细胞发育过程中的作用奠定了基础。

人HPIP基因真核表达载体的构建及其对肺癌细胞的生物学影响

背景人造血前B细胞白血病转录因子相互作用蛋白(hematopoietic pre-B cell leukemia transcription factor interacting protein,HPIP)参与多种肿瘤的发生发展过程,其在肺癌中的机制仍有待研究。目的构建带有Flag标签的HPIP真核表达载体,表达pcDNA3.0-Flag-HPIP融合蛋白,检测其对肺癌细胞增殖、迁移等生物学功能的影响。方法利用人乳腺文库作为模板,PCR技术扩增HPIP基因的编码序列,将其酶切产物连接到pcDNA3.0-Flag载体并测序。将重组质粒转染至A549肺癌细胞系中,Western blot验证转染后HPIP的蛋白表达情况。采用克隆形成实验、CCK-8法及细胞划痕实验等明确其对肺癌细胞增殖、迁移等功能的影响。结果PCR扩增得长度为2109 bp的HPIP基因编码序列,并成功插入至pcDNA3.0-Flag载体中。测序和Western blot验证融合蛋白构建成功。CCK-8法和克隆形成实验表明,与对照组相比,转染Flag-HPIP后肺癌A549细胞增殖能力显著增强。划痕实验证实转染Flag-HPIP后可明显提高肺癌A549细胞的迁移能力。结论本实验成功构建了带有Flag标签的HPIP基因真核表达载体,并证实其能够促进肺癌细胞的增殖和迁移,为后续HPIP在肺癌中的功能研究奠定了良好基础。

人TRAM基因真核表达载体的构建

目的构建TRAM基因真核表达载体,为研究TRAM的功能提供研究工具。方法首先采用PCR方法扩增人TRAM蛋白相应的编码序列,将扩增的特定片段克隆至pCMV-N-Flag真核表达载体。然后,对重组载体进行DNA测序,确认序列正确后将重组载体转染至HEK-293T细胞,并用Western blot方法检测TRAM蛋白的表达以评价载体是否构建成功。结果菌落PCR电泳可检测到800 bp附近出现目的条带,质粒DNA测序显示载体插入705 bp的核苷酸序列,其序列与TRAM完全一致。Western blot检测到HEK-293T细胞高表达带Flag标签的TRAM蛋白。结论基于PCR扩增、双酶切、酶连接扩增片段和载体成功构建带Flag标签的TRAM真核表达载体。构建的质粒可为进一步研究干扰素的调控和抗病毒免疫治疗提供一种研究工具。

FOXA1基因表达CMV载体的构建

目的构建叉头盒蛋白A1(Forkhead-box A1,FOXA1)的pFLAG-CMV4-FOXA1表达载体,为探究FOXA1功能和作用机制奠定基础。方法设计引物,采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增FOXA1的cDNA全长序列,产物电泳回收。随后将pFLAG-CMV载体进行酶切消化,与回收的FOXA1的cDNA全长序列连接。将构建好的质粒转化到DH5a大肠埃希菌中,将验证正确的质粒进行提取纯化,然后将其转染至FOXA1阴性细胞系HEK293T。HEK293T细胞转染pFLAG-CMV4-FOXA1载体24 h后,收集其mRNA和总蛋白。通过实时荧光定量PCR检测mRNA的变化,同时采用免疫印迹法检测蛋白质表达情况。结果测序结果显示序列正确,载体构建成功;实时荧光定量PCR结果显示在HEK293T细胞中,FOXA1基因的mRNA水平显著增加,免疫印迹结果显示FOXA1蛋白正确表达。结论成功构建了人pFLAG-CMV4-FOXA1,并可在HEK293T细胞内正确且高效表达,为后续FOXA1功能和机制的研究提供了重要的工具。

lefty1基因真核表达载体构建鉴定及转染

目的:构建lefty1基因与pcDNA3.1(+)相融合的真核表达载体,并在lefty1基因的下游加上Flag标签,转染人肾小管上皮细胞株验证重组质粒活性。方法:设计并合成lefty1基因上下游引物,同时加上Flag标签序列,PCR扩增基因,并将其连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,双酶切图谱分析和扩增产物测序鉴定所构建的真核表达载体。脂质体转染法将重组质粒pcDNA3.1(+)-lefty1-Flag和pcDNA3.1(+)分别转染至人肾小管上皮细胞株HK-2,qPCR和Western blot检测lefty1在mRNA和蛋白水平的表达。结果:以lefty1基因质粒模板扩增得到的片段约1 150bp,双酶切得到目的基因片段,测序的结果显示与lefty1基因序列相同。转染肾小管上皮细胞后,pcDNA3.1(+)-lefty1-Flag能表达lefty1蛋白。结论:成功构建lefty1基因真核表达载体,为一步研究lefty1基因功能奠定了基础。

生长抑制肽表达载体的构建及鉴定

目的构建带有Flag标签的生长抑制肽(34p)的真核表达载体,并验证其表达与功能。方法抽提人肝癌细胞系HepG2的基因组DNA为模板进行PCR扩增目的片段,通过酶切连接,将DNA片段连接到p3XFLAGCMVTM-9表达载体上,进行测序验证;随后进行瞬时转染,通过免疫荧光实验验证该载体的表达情况,用流式细胞术实验证实其功能。结果测序结果显示载体构建成功,序列正确;免疫荧光结果证实该载体可以正常表达目的肽段;流式细胞术结果过表达34p组相较于转染空载组,细胞凋亡明显增加。结论成功构建了34p的真核表达载体,并验证其促凋亡的生物学功能,为后续的机制研究提供了研究手段和工具。