采用Fluo-3 AM-ester探针研究桃不同组织的Ca^2＋信号分布

钙作为植物最重要的矿质元素之一,在植物生理和生化活动中起重要作用。采用激光扫描共聚焦显微镜,以Fluo-3 AM-ester为荧光探针研究了桃果肉和叶柄组织中Ca2+的分布,结果表明Fluo-3 AM-ester可作为荧光探针对桃不同组织中游离的Ca2+信号强度和分布特征进行分析。不同的物镜观察(10×和20×)下,Ca2+荧光信号相对强度差异不大;在叶柄中Ca2+荧光信号主要分布于维管束,在果实中多分布于细胞壁;但叶柄中荧光信号分布明显高于果肉组织,这与钙在不同组织中的功能有关。

应用Ca^(2+)荧光探针fluo-3和fluo-4测定H_2O_2诱导的A549细胞凋亡过程中的[Ca^(2+)]_i变化

背景与目的肺癌是世界范围内常见的恶性肿瘤,Ca2+对于肿瘤细胞凋亡有重要的调控作用。实时监测肺癌细胞内Ca2+水平,有助于深入研究Ca2+介导肺癌细胞凋亡的分子机制。本研究旨在观察Ca2+荧光探针fluo-3和fluo-4在H2O2诱导的A549细胞凋亡过程中的应用,实时测定胞浆Ca2+浓度([Ca2+]i),探讨[Ca2+]i与细胞凋亡的关系,并比较两种Ca2+探针在荧光强度及[Ca2+]i测定值方面的差异。方法采用Ca2+荧光探针fluo-3和fluo-4负载细胞,1 h后用不同浓度的H2O2刺激细胞,激光扫描共聚焦显微镜实时测定选取细胞的[Ca2+]i变化。采用DAPI染色试剂盒观察H2O2刺激后细胞凋亡情况。结果在相同的探针浓度、负载时间和相同的图像采集参数的条件下,选定细胞内fluo-4平均荧光强度高于fluo-3。50 mM H2O2刺激后,A549细胞胞浆内[Ca2+]i迅速升高,通过公式计算发现采用fluo-3探针负载的选定细胞中[Ca2+]i变化范围是112.2 nM-1,069.6 nM,采用fluo-4探针负载的选定细胞中[Ca2+]i变化范围是7.6nM-505.4 nM。同时发现经H2O2刺激后,凋亡细胞百分比明显增加(P<0.01)。结论 H2O2促进A549细胞内Ca2+释放,诱导细胞凋亡。Ca2+探针fluo-4可能更适合于监测含量较低的细胞中[Ca2+]i变化。

Ca^(2+)荧光蛋白探针Cameleon和荧光染料探针fluo-3测定H_2O_2刺激的A549细胞中Ca^(2+)浓度变化

目的:本研究旨在观察Ca2+荧光蛋白探针Cameleon和荧光染料探针fluo-3在H2O2刺激的A549细胞中的应用,实时测定细胞质Ca2+浓度([Ca2+]i),并比较两种Ca2+探针在荧光曲线及[Ca2+]i测定值等方面的差异。方法:采用Ca2+荧光蛋白探针Cameleon YC3.6转染A549细胞,24h后用50mmol/L H2O2刺激细胞,激光扫描共聚焦显微镜实时测定选取细胞的[Ca2+]i变化。采用Ca2+荧光染料探针fluo-3负载细胞,1h后用50mmol/L H2O2刺激细胞,激光扫描共聚焦显微镜实时测定选取细胞的[Ca2+]i变化。采用DAPI染色试剂盒观察H2O2刺激后细胞凋亡情况。结果:采用Cameleon探针转染的细胞中,反映[Ca2+]i变化的R值曲线迅速升高后逐渐降至刺激前水平,通过公式计算发现[Ca2+]i变化范围是33.1-596.1 nmol/L。采用fluo-3探针负载的细胞中,反映[Ca2+]i变化的荧光强度F值曲线逐渐升高至稳定,通过公式计算得到[Ca2+]i变化范围是131.8-695.6 nmol/L。同时发现经H2O2刺激后,凋亡细胞百分比显著增加(P<0.01)。结论:Ca2+荧光蛋白探针Cameleon YC3.6和荧光染料探针fluo-3均检测到H2O2诱导的细胞内[Ca2+]i变化,Cameleon YC3.6可能更灵敏地反映快速变化的钙信号。

激光扫描共聚焦显微镜检测Fluo-3 AM负载大鼠心肌微血管内皮细胞最佳浓度和时间的探讨

为了探讨Ca2+荧光探针Fluo-3 AM对大鼠心肌微血管内皮细胞(Rat Myocardial Microvascular Endothelial Cells RMMECs)最佳装载浓度和时间。将Fluo-3 AM分别稀释成1、2、3、4、5μM/L,每一浓度的探针分别装载细胞5、10、15、20min,应用激光扫描共聚焦显微镜检测细胞内荧光信号的强度、位置、装载探针后细胞的形态来观察装载效果。结果表明:1～3μM/L的Fluo-3 AM负载5～20min均不出现荧光信号;4μM/L的Fluo-3 AM负载5～10min时即出现荧光信号;5μM/L的Fluo-3 AM孵育细胞15min后出现清晰且分布均匀的荧光信号。Fluo-3 AM对贴壁生长的RMMECs负载效果主要受探针浓度和负载时间的影响。

Fluo-3检测细胞内钙离子的条件优化

目的:优化用于检测细胞内钙离子的Fluo-3浓度条件和羧苯磺胺浓度条件,以得到最适的检测用浓度组合。方法:应用析因实验设计方法,选择32种不同的Fluo-3和羧苯磺胺浓度组合孵育CHO-K1细胞,通过FlexStation检测平台检测细胞内的钙离子浓度。结果与结论:检测信号随着Fluo-3浓度的升高而增强,同时随着羧苯磺胺浓度的升高而减弱。4μmol/L的Fluo-3和1mmol/L的羧苯磺胺浓度组合是最适用的检测条件。

2,3,7,8-TCDD对培养乳鼠心肌细胞内游离钙离子浓度影响的研究

目的测定培养SD大鼠乳鼠心肌细胞内游离钙离子浓度[Ca2+]i,观察2,3,7,8四氯二苯并二噁英(2,3,7,8tetrachlorodibenzopdioxin,以下略为TCDD)对心肌细胞[Ca2+]i的影响。方法将实验动物分为0.05、0.5、5、10μg/kg4个染毒组,采用Fluo3/AM同时加入PluronicF127作为细胞内游离钙离子的荧光探针,负载培养的心肌细胞,应用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)技术检测空白组及染毒组乳鼠心肌细胞[Ca2+]i。结果静息时,心肌细胞[Ca2+]i为(77.68±12.00)nmol/L。染毒组心肌细胞的[Ca2+]i显示不同程度的升高,且呈剂量依赖性。结论应用Fluo3/AM和PluronicF127结合CLSM技术可以精确的反映细胞内游离钙离子浓度,TCDD可能通过某种机制增加心肌细胞[Ca2+]i,从而对乳鼠心脏功能产生一定损伤。

多非替利衍生物CPU228(V03)对大鼠心室肌细胞钙瞬变的调节

目的 :在β 受体激动情况下 ,研究多非替利衍生物CPU 2 2 8对电刺激触发心肌细胞的胞浆Ca2 + 浓度([Ca2 + ]i)变化及钙瞬变动力学参数的影响。方法 :游离单个大鼠心室肌细胞 ,Fluo 3 AM负载 ,电刺激诱发心室肌细胞钙瞬变 ,定量测定心室肌细胞内Ca2 +浓度变化 ,异丙肾上腺素 (isoproterenol,ISO) 10 0nmol·L-1激动β 受体 ,观察CPU 2 2 81μmol·L-1对钙瞬变动力学参数、[Ca2 + ]i 及钙负荷水平的影响。结果 :CPU2 2 81μmol·L-1对大鼠心室肌细胞 [Ca2 + ]i 的影响不明显 (P >0 .0 5 ) ;ISO 10 0nmol·L-1显著升高大鼠心室肌细胞 [Ca2 + ]i 和细胞内钙负荷水平 ,缩短钙瞬变时程 ,并且增加钙瞬变的消除速率。CPU 2 2 81μmol·L-1显著抑制ISO的上述作用。结论 :在β 受体激动情况下 ,CPU 2 2 8可以降低心肌细胞 [Ca2 + ]i,使ISO改变的钙瞬变动力学参数恢复到正常水平。

低温处理对冬、春小麦细胞Ca^(2+)时空变化的影响

用Fluo 3/AM染色 ,通过激光扫描共聚焦显微镜 (LSCM)方法 ,对静息态及连续降温条件下不同抗寒性小麦(TriticumaestivumL .)叶肉细胞原生质体 [Ca2 + ]cyt (thefreeCa2 + concentrationinthecytoplasm)的时空变化进行了比较。结果表明 ,静息态下小麦原生质体整体荧光强度基本不变 ,暗示 [Ca2 + ]cyt能维持在一稳定水平 ;同时 ,不同品种小麦间也显示了 [Ca2 + ]cyt水平荧光强度的不同。温度由 15℃连续降至约 2℃时 ,抗寒冬小麦 [Ca2 + ]cyt出现升高后的回复 ,2℃之后逐渐升高 ;冷敏感春小麦则无此回复过程 ,而是一直升高到最大值。推测这一不同的动态变化最终决定了植物在低温下产生冷适应的不同能力。这进一步为“Ca2 + 是低温下生理信号的传导者”

九节龙皂甙对Hela细胞生长的抑制作用

目的 观察九节龙皂甙 (Ardiusilloside)对人宫颈癌Hela细胞的抑制作用。方法 九节龙皂甙 6 2 5mg·L-1处理Hela细胞 0～ 72h ,在不同时间点采用光镜观察Hela细胞形态 ,以琼脂糖凝胶电泳检测Hela细胞凋亡DNA的梯形带 ;应用特异性Ca2 + 荧光探测剂Fluo 3 /AM在LSCM条件下检测不同时期细胞内Ca2 + 分布情况。结果 光镜下体外培养的Hela细胞在九节龙皂甙作用 2 4h开始出现细胞质皱缩和细胞核凝缩等凋亡的形态学特征。 60、72h均检测出DNA梯形带等凋亡的生物化学特征。诱导Hela细胞48、60、72h内Ca2 + 严重超载且维持在较高浓度水平。结论 九节龙皂甙对体外培养的Hela细胞具有明显的抑制作用且诱导Hela细胞凋亡发生 ;细胞凋亡时细胞内 [Ca2 +

百合花粉细胞中钙离子的荧光测定法

以川百合花粉为材料 ,利用孵育法在花粉原生质体中 ,特别是利用低温装载法在完整花粉粒中 ,成功地载入酯化形式的钙离子荧光探针fluo 3AM。利用激光共聚焦显微技术对花粉细胞质中游离钙离子的分布特点进行研究的结果表明 ,花粉萌发初期细胞质内游离钙离子呈极性分布 ,萌发沟附近的钙离子浓度明显高于其他部位 ,萌发孔附近最高 ,花粉细胞核中较低。文中对低温装载法的可行性进行了讨论。

慢性非细菌性前列腺炎SD大鼠前列腺平滑肌细胞内钙离子浓度的变化

目的:探讨SD大鼠慢性非细菌性前列腺炎(CAP)炎症组与正常对照组前列腺平滑肌细胞(PSMCs)内游离钙离子浓度([Ca2+]i)的差异及其在CAP中的意义。方法:利用SD大鼠前列腺蛋白提取液与弗氏完全佐剂(FCA)诱导出CAP模型,体外贴壁培养并纯化炎症组与正常对照组PSMCs,细胞经钙离子荧光探针FLUO-3AM孵育后在激光共聚焦显微镜(LSCM)下连续动态扫描。结果:CAP组与对照组的PSMCs钙离子荧光强度分别为80.39±9.00和27.95±10.04,差异具有显著性(P<0.01)。结论:CAP SD大鼠PSMCs[Ca2+]i明显升高,其升高可能增强了PSMCs的收缩作用,从而引起CAP的一系列如对疼痛敏感性增强、下腹部疼痛不适的症状。

黄芪甲苷对心肌细胞L型钙电流及细胞内钙的影响

目的研究黄芪甲苷(astragaloside IV,AS-IV)对豚鼠心室肌细胞L型钙电流和细胞内钙的影响。方法分离单个豚鼠心室肌细胞,应用全细胞膜片钳技术测定钙电流,并采用荧光显微镜CCD成像系统动态观察细胞内钙(intracellular calcium concentration,[Ca2+]i)变化。结果 1×10-6mol·L-1AS-IV可明显抑制I Ca-L,使最大电流峰值降低32.6%。AS-IV对60 mmol·L-1KCl诱导的[Ca2+]i升高有抑制作用,最大荧光密度变化值从1.17±0.30(n=6)降低到0.26±0.16(n=5,P<0.05)。AS-IV可直接促进钙池内钙释放,使[Ca2+]i从0.08±0.02(n=10)升高到0.23±0.07(n=8,P<0.05)。结论 AS-IV抑制L型钙通道,可减少细胞外钙内流;同时它促进内钙释放,对心肌细胞内钙稳态表现为双向调节作用。

西红花苷对牛主动脉平滑肌细胞内钙离子浓度的影响(英文)

目的 研究西红花苷对血管平滑肌细胞内钙离子浓度的影响。方法 以Fluo-3/AM作为Ca2+荧光探针,采用激光扫描共聚焦显微镜观察牛主动脉平滑肌细胞内钙离子浓度的变化。结果无论细胞外有无钙离子,西红花苷(1×10～8,1×10～7,1×10～6mol·L-1)均能明显抑制1×10～2mol·L-1H2O2引起的细胞内钙离子浓度的升高,其抑制率含钙条件下分别为34.1％,57.1％和74.3％(P<0.01),无钙条件下分别为26.2％,32.1％和50.0％(P<0.01);在胞外无钙的条件下,西红花苷(1×10-8,1×10～7,1×10-6mol·L-1)能抑制70 mmol·L-1 CHCl3导致雷洛丁敏感钙池的释放,其抑制率分别为27.8％,27.8％和50.0％(P<0.01)。结论 西红花苷能抑制胞外钙离子的内流及内质网上钙离子的释放。

酿酒酵母细胞增殖对Ca^(2+)需求的新证据

本文研究了酿酒酵母细胞增殖对Ca2+需求的证据。结果表明:SD-Ca培养基中外加1mmol/L的Ca2+明显促进酿酒酵母细胞增殖,外源Ca2+浓度在0~20mmol/L范围内变动时,随Ca2+浓度增加,细胞生长到达稳定期的终浓度也越大;5、10mmol/L的EGTA可明显延缓细胞生长的延滞期,但是最终不能抑制细胞增殖;酿酒酵母在SD-Ca培养基中继代培养4次,随增殖代数增加,细胞总钙含量没有明显变化,说明酵母能够在低钙介质中生长可能是因为具有捕捉和富集钙的功能;以Fluo-3作为胞质Ca2+指示剂,通过激光扫描共聚焦显微镜观察,发现随胞外Ca2+浓度增加,胞质中游离Ca2+浓度也相应增加。这些证据都揭示了Ca2+在酿酒酵母细胞增殖过程中是必需的。

荧光指示剂孵育法测定小麦叶肉细胞原生质体胞质游离Ca^(2+)的变化

研究以孵育法将Ca2+荧光探针Fluo-3AM载入小麦叶肉细胞原生质体胞质中,并结合激光共聚焦扫描显微技术,建立了测定原生质体胞质游离Ca2+动态变化的试验方法。

测定蚕豆保卫细胞胞质中游离Ca^(2+)的荧光染料孵育法

采用孵育法将Ca2 + 荧光探针Fluo 3AM引入蚕豆保卫细胞 ,结合激光共聚焦扫描显微技术 ,测定了胞质游离Ca2 + 及外源刺激引起的Ca2 + 的动态变化。测得的蚕豆保卫细胞胞质游离Ca2 + 的浓度为几十至上百nmol·L-1之间 ,与胞质游离Ca2 +

拟南芥叶细胞游离钙离子的测定

低温(4℃)条件下将钙离子荧光探针Fluo-3/AM导入拟南芥叶细胞,利用激光共聚焦显微技术检测了胞内钙离子荧光强度的分布。实验证明,低温导入Fluo-3/AM法测定拟南芥叶细胞中钙离子荧光强度的变化切实可行。茉莉酸(JA)处理能够诱导胞内游离钙离子浓度的升高。

芥子碱对PC12细胞内游离钙升高的影响

目的:考察芥子碱对高钾除极和谷氨酸引起细胞外钙内流以及咖啡因和环匹阿尼酸(cyclopia-zonic acid,CPA)引起细胞内钙释放所导致的PC12细胞内游离钙升高的影响。方法:PC12细胞用终浓度为5μmo.lL-1的钙离子荧光指示剂Fluo-3/AM于37℃避光负载孵育。细胞内游离钙([Ca2+]i)用VictorⅡ1420多功能标记分析仪检测,以荧光强度(FI)表示。结果:当有外钙存在时,PC12细胞静息[Ca2+]i的FI值为(1 188±163),75 mmol.L-1KCl和10 mmol.L-1谷氨酸引起细胞外钙内流,使[Ca2+]i增高,FI峰值分别增至(4 270±982)和(3 096±402)。芥子碱(0.01,0.1,1.0,10,100μmol.L-1)对静息[Ca2+]i没有明显的影响,但浓度相关性地抑制高钾和谷氨酸诱发的[Ca2+]i增高,抑制率分别为10.2%,39.5%,53.7%,71.8%,88.4%和30.3%,55.7%,68.5%,79.2%,94.1%。当无外钙存在时,PC12细胞静息[Ca2+]i的FI值为(813±112)。咖啡因(40 mmol.L-1)和CPA(30μmol.L-1)分别引起Caffeine-ryanodine和三磷酸肌醇(InsP3)敏感型-钙池释放而使[Ca2+]i升高,FI值分别增至(2 944±371)和(1 844±332)。芥子碱(0.1,1.0,10,100μmol.L-1)浓度相关性地抑制咖啡因和CPA诱发的[Ca2+]i增高,抑制率分别为23.7%,61.9%,77.5%,88.2%和10.9%,23.8%,44.6%,68.3%。结论:芥子碱能显著抑制电压依赖性和受体依赖性钙通道开放所引起的外钙内流,且对受体依赖性钙通道的抑制作用更强。此外,芥子碱对Caffeine-ryan-odine受体和InsP3敏感型钙池的内钙释放也有明显抑制作用,且对Caffeine-ryanodine受体敏感型钙池的抑制作用更强。这提示芥子碱有望成为很有研发前景的新型钙阻滞剂。

西红花苷对培养的牛内皮细胞内钙的调节作用

目的 观察西红花苷对不同刺激因子5-羟色胺（5-HT）、组胺（His）、过氧化氢（H2O2）所致内皮细胞内钙升高的影响。方法 采用Fluo-3/AM荧光染色剂负载细胞,在激光共聚焦扫描显微镜上测定培养的单个牛内皮细胞内游离钙的浓度。结果 在含钙的Hank’s液中,5-经色胺、组胺、过氧化氢能明显升高静息状态的细胞内钙,增幅分别为280％、320％、285％。西红花苷1、10μmol/L对5-羟色胺、组胺、过氧化氢引起的钙增高有显著的抑制作用,并呈一定的剂量依赖性。0.1μmol/L西红花苷对细胞内钙升高无显著影响。结论 西红花苷抗动脉粥样硬化、高血压及炎症作用可能与其内皮细胞保护作用有关。