日本囊对虾Ran基因的克隆表达与蛋白质GTP结合活性分析

在日本囊对虾抑制性差减杂交(suppression subtractive hybrid ization,SSH)研究过程中,首次发现一段经同源比较为Ran基因的部分序列,在抗病日本囊对虾中上调表达.为了进一步探索日本囊对虾Ran基因的功能,通过RACE-PCR的方法克隆得到了日本囊对虾Ran基因全长共1 441个碱基,其中开放阅读框为645个碱基,共编码215个氨基酸,这是首次在海洋无脊椎动物体内克隆到该基因.还将该基因克隆到原核表达载体PGEX-4T-2中并转化大肠杆菌BL21,37℃下诱导6 h,超声裂解表达菌株,结果表明GST-Ran融合蛋白在大肠杆菌中为可溶性表达,蛋白大小约为50 ku,经纯化得到了纯度大于90%的GST-Ran融合蛋白.随后的GTP结合试验验证了Ran蛋白具有GTP结合活性.

外源钙调素与拟南芥悬浮培养细胞结合位点的观测及其胞外效应

以拟南芥悬浮培养细胞为实验体系,借助外源荧光及同位素标记钙调素,研究结果表明外源钙调素不能被主动内吞入细胞内,而是主要以完整分子形式结合在细胞外表面;外源纯化钙调素可促进正向型质膜囊泡中的鸟苷酸三磷酸水解酶活性升高,也可引起拟南芥悬浮细胞质游离钙离子浓度的特异升高,表明外源钙调素可能通过细胞表面位点跨膜信号转换为细胞内信号,从而调节生物学活性。

T20N点突变对水稻OsRacD蛋白GTP酶活性的影响

OsRacD是水稻小GTP结合蛋白Rho家族成员,其功能之一是作为"分子开关",通过控制花粉管的延伸生长,参与光敏核不育水稻光周期的育性转换。在序列同源性比对和蛋白保守结构域分析的基础上,采用重叠延伸PCR方法在水稻OsRacD基因的第一个高度保守的基序G1区引入T20N点突变,模拟GDP结合形式的OsRacD。进一步构建了与组氨酸标签融合的原核表达载体,原核表达和纯化了野生型和突变型OsRacD蛋白,并通过Western blot证实了融合蛋白表达和纯化的正确性。纯化蛋白的GTP酶活性检测结果显示,突变后的OsRacD蛋白GTP水解活性显著降低,提示OsRacD在T20N突变前后具有不同的生化特性。

公共数据库分析RACGAP1在乳腺癌中的表达及临床意义

目的:探讨Rac GTP酶活性蛋白-1(RACGAP1)基因在乳腺癌中的表达及临床意义。方法:检索Oncomine数据库中有关RACGAP1信息,对所获取的数据资料进行二次分析,对其在乳腺癌中的作用进行荟萃分析。通过GOBO数据库分析该基因在乳腺癌亚型中的表达情况。利用Kaplan-Meier Plotters数据库进行患者的生存周期分析。结果:Oncomine数据库中共收集了349项不同类型的研究结果,其中关于RACGAP1表达差异有统计学意义的研究共有74项,RACGAP1表达增高的有69项,表达降低的有5项。共有3项研究,10个数据集涉及RACGAP1在乳腺癌组织和正常组织中的表达,包括2776个样本。综合比较3项研究成果,发现RACGAP1在乳腺癌中的表达量高于正常组(P<0.05)。此外,通过GOBO数据库分析发现RACGAP1表达水平在激素受体(HR)敏感亚型、三阴性(TN)和HER-2亚型间有统计学差异(P<0.05)。不仅如此,RACGAP1表达量与乳腺癌患者总体生存率存在相关性,高表达者总体生存率较差,低表达者预后较好。结论:RACGAP1在乳腺癌组织中呈现高表达,且与乳腺癌预后有关,可为乳腺癌的药物开发和预后预测提供一定的理论依据。