利用CRISPR/Cas9系统创制水稻品种GW2基因的突变体

培育具有育种价值的GW2基因编辑的水稻优异新品种在水稻育种中具有重要意义,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,以生产上广泛推广应用的13份水稻品种为材料,对粒质量基因(GW2)进行定向性状改良,通过农杆菌转化创制出一批无T-DNA元件的水稻非转基因GW2突变纯合株系。结果表明:13份T0代水稻转基因中,有28.0%~59.1%植株的GW2基因发生了突变,纯合突变株数量占总突变株数量的35.0%,双等位突变株数量占总突变株数量的14.2%,杂合突变株数量占总突变株数量的50.8%。此外,不同水稻品种发生的突变类型也略有不同。对13份T2代非转基因水稻GW2突变纯合株进行千粒质量性状的考种分析。与对应的野生型亲本品种相比,纯合突变水稻植株的千粒质量显著提高10.81%~58.22%。本研究结果极大地丰富了GW2的突变类型,为不同水稻品种的高产稳产创造了重要的种质资源,同时也为利用基因编辑提高水稻产量提供了有价值的育种信息。

葡萄VvGW2基因的克隆及表达

为了从葡萄品种美人指中克隆Vv GW2基因,并对其结构特征及表达模式进行分析。在NCBI中查找与水稻粒形基因Os GW2同源性最高的葡萄序列,根据葡萄的GW2基因序列设计特异引物。采用改良CTAB法提取美人指花序中总RNA,运用RT-PCR技术进行克隆。利用NCBI数据库中的BLASTn和BLASTp程序进行相似性分析;利用Bioxm2.6推测分析蛋白质分子量和等电点;根据NCBI中Conserved Domains程序进行蛋白质保守域结构预测;用Ex Pa Sy提供的在线SOPMA程序进行蛋白质二级结构预测;利用实时荧光定量RT-PCR研究该基因表达模式。结果显示,从美人指中克隆得到1个GW2基因同源序列,命名为Vv GW2基因。Vv GW2基因开放阅读框长度为1 272 bp,共编码423个氨基酸,预测蛋白质分子量为46 960,理论等电点为4.68。该基因编码的氨基酸具有GW2蛋白质保守的环指结构域,该环指蛋白质为C5HC2类型。与Gen Bank中登录的其他植物GW2蛋白质序列相似性为47%～53%。根据Vv GW2基因所编码的氨基酸序列构建系统进化树,结果显示,葡萄与可可聚为一类。实时荧光定量RT-PCR分析结果显示,Vv GW2基因在美人指花或果实的各时期均有表达,其中在开花期基因表达量最高。不同葡萄品种中,Vv GW2基因的表达量存在差异,在指形葡萄品种美人指的表达量最高,在圆形葡萄品种中的表达量很低。表明Vv GW2基因在不同时期和不同品种中的表达量差异可能与葡萄果实形状相关。

极端粒形水稻粒宽基因GW2的序列分析和效应

粒形是影响水稻产量的重要因子,对粒形相关基因的发掘和利用一直倍受重视。在已克隆的粒形基因中,GW2是一个控制粒宽的重要基因。通过同源克隆的方法,获得极端大粒水稻TD70和极端小粒水稻Kasalath的GW2基因cDNA片段,分析序列差异,设计功能标记,检测240个来源于TD70/Kasalath的重组自交系(RILs)和部分籼稻骨干恢复系、江苏省主栽粳稻品种的基因类型及其效应。结果表明,TD70的GW2与大粒粳稻WY3完全一致,与已知序列(GenBank:EF447275)相似性达99.77%,在碱基的第114位,T突变为C,但并不改变氨基酸性质;在第316位缺失碱基A,造成316位以后的所有碱基前移一位,氨基酸均发生变化,在碱基的第346、第347、第348位形成TAA的终止密码子,提前结束了TD70的GW2蛋白的表达。而Kasalath的GW2序列仅在碱基的第114位,由T突变为C,但并不改变氨基酸性质;GW2Kasalath的316位没有突变,表达没有提前终止;设计的dCAPs标记,产物经内切酶ApoI酶切,TD70为21bp和30bp两个片段,而Kasalath条带为51bp;240个RILs中含GW2TD70基因的株系有82个,含GW2Kasalath基因的株系有158个,两者在粒宽和粒重表型上存在显著差异;8个籼稻骨干恢复系和10个江苏省主栽粳稻品种中都不存在GW2TD70基因。GW2TD70基因对籽粒宽度有一定的调控作用,水稻育种中可以利用GW2TD70基因来提高籽粒粒重。

水稻粒型基因GW2和GS3遗传效应分析

以大粒品种TD70和小粒品种Kasalath为背景材料,分别对其中的GW2和GS3基因进行了反义和超表达载体的构建和转化。结果表明,Kasalath来源的GW2(GW2~K)和GS3(GS3~K)转化TD70的超表达材料籽粒质量均降低,且GW2~K的贡献大于GS3~K;GW2~K和GS3~K转化Kasalath的反义表达材料籽粒质量均增加,GW2~K的贡献大于GS3~K;TD70来源的GW2(GW2~T)转化Kasalath的超表达材料千粒质量显著增加,而TD70来源的GS3(GS3~T)转化Kasalath的超表达材料粒型和籽粒质量没有显著变化,说明不同遗传背景中GW2和GS3的基因效应有差异,但同一背景下GW2对籽粒质量的贡献大于GS3。