猪Ghrelin基因表达质粒构建及其促生长作用

通过RT-PCR获得猪Ghlelin基因cDNA片段,克隆入pcDNA3.1(+)质粒中构建真核表达质粒pcDNA-pGhl,并将该质粒注射到大鼠和新西兰兔后腿肌肉中,以研究pGhlelin真核表达质粒对动物生长和血液相关激素分泌的影响。大鼠试验表明:pcDNA-pGhl在注射初期的1个月内有增加大鼠体重及在整个试验期有降低料重比的趋势。在注射质粒后第6天,试验组个体增重提高10.6%,差异显著;饲料转化率提高10%,差异极显著。新西兰兔试验表明:试验组血液GH水平一直高于对照组,且在注射后2周高出35%,同时随着GH浓度的增加,血液中SS的浓度相应升高。注射重组质粒pcDNA-sGhl有增加血浆GH和SS水平趋势。以上结果表明,Ghrelin基因真核表达质粒通过促进GH的分泌促进生长,但其促生长效能较短暂,可能是由于同时促进生长抑素分泌。

鸡Ghrelin基因C2100T位点与生长和脂肪性状的相关性

选取鸡Ghrelin基因C2100T多态位点,利用PCR-RFLP结合测序技术,对全同胞资源家系470只F2代家鸡进行基因型检测及标记-性状关联分析,并利用已有的mRNA测定数据分析该多态位点与Ghrelin基因mRNA表达量的关系。结果:(1)经PCR-RFLP检测出3种基因型,测序结果证实C2100T是形成酶切多态性的原因;(2)QTDT检验显示,C2100T与鸡1、6、9周龄体重和皮下脂肪厚度显著相关(P<0.05),并且不同基因型个体性状平均值大小关系为CC﹥CT﹥TT;C2100T与其他生长性状和脂肪性状均没有显著相关性;(3)不同基因型个体腺胃中的Ghrelin基因mRNA表达量差异不显著,但含C等位基因个体的mRNA表达量相对T等位基因高。试验结果表明,鸡Ghrelin基因C2100T多态性与鸡的部分生长和脂肪性状存在显著相关性,且C等位基因有利于鸡的体重增长和皮下脂肪沉积。

瘦素及ghrelin基因多态性与精神分裂症患者利培酮所致代谢变化的关系

目的探讨精神分裂症受试使用利培酮治疗后体质量、代谢相关指标的改变,并分析瘦素基因-2548G/A多态性,ghrelin基因Leu72Met多态性和体质量及代谢相关指标变化间的联系。方法68例精神分裂症患者利培酮单药治疗10周,入组,收集治疗4周和10周时的相关代谢指标体质指数(BMI)、腰围、空腹血糖和血脂指标水平。聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测瘦素基因和ghrelin基因多态性。结果治疗期间体质量、血糖和血脂指标均升高,差异有统计学意义(P<0.05)。ghrelin基因Leu72Met多态性和血糖变化相关(F=4.269,P=0.042),Leu72等位基因携带者空腹血糖水平较高。瘦素基因多态性和2种基因多态性均与体质量和代谢指标变化无关(P>0.05)。结论利培酮急性期治疗过程中,患者可以出现不同程度的体质量指标、血糖和血脂水平的升高。ghrelin基因Leu72等位基因可能是使用利培酮治疗的精神分裂症患者发生高血糖的危险因素。

儿童青少年代谢综合征与ghrelin基因Leu72Met位点多态性研究

目的探讨儿童青少年代谢综合征(MS)及其组分与胰岛素抵抗(IR)的关系,研究ghrelin基因Leu72Met位点多态性在儿童青少年肥胖症及MS中的作用。方法通过对住院的508例中、重度肥胖青少年的临床研究,计算稳态模型胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)及总体胰岛素敏感指数(WBISI)评估IR情况;对其中230例肥胖患儿和100名正常体重儿童青少年,利用PCR、RFLP及基因测序检测ghrelin基因多态性。结果中、重度肥胖儿童青少年MS的发生率为22.83%;HOMA-IR和WBISI两个指标在肥胖组与对照组中差异有统计学意义(P<0.01),且分别随肥胖程度的增加而升高和下降;与单纯肥胖组比较,伴有代谢组分异常者的HOMA-IR明显增高(P<0.05),而WBISI显著降低(P<0.05),且随着代谢组分异常的增多而加重。在儿童青少年中检测到两个ghrelin基因的多态性位点,C214A(Leu72Met)和A269T(Gln90Leu);肥胖组Leu72Met位点的多态性频率为36.09%,与对照组的41.00%比较差异无统计学意义(P>0.05);Gln90Leu在肥胖组和对照组的多态性频率分别为0.43%和2.00%,差异亦无统计学意义(P>0.05);Leu72Met位点各基因型之间比较,年龄、体质指数(BMI)、谷丙转氨酶(ALT)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、WBISI差异均无统计学意义。结论肥胖儿童青少年存在IR,且随肥胖程度及MS各代谢组分异常增加而加重;Leu72Met位点的多态性改变与汉族儿童青少年肥胖及MS的发生无关。[临床儿科杂志,2007,25(12):978-982]

大口黑鲈ghrelin基因SNPs的筛选及与生长性状关联性分析

ghrelin是脊椎动物的一种脑肠肽,有促进摄食的功能,并能促进生长激素(GH)释放,参与能量平衡调控和糖类代谢。为探索ghrelin基因多态性与大口黑鲈生长性状的相关性,针对大口黑鲈ghrelin基因的启动子序列,实验采用直接测序法获得了2个SNPs位点:S1(A-642C)和S2(A-639C)。随机选取同批繁殖、同塘养殖的大口黑鲈采用Sna Pshot方法进行SNPs位点检测和分型。结果显示,实验群体在ghrelin基因2个SNPs位点上基本处于哈温平衡,S1和S2共组成5种双倍型(D1、D2、D3、D4和D5)。基因型与生长性状的相关性分析结果表明,S1位点AC型个体在体高与全长上显著高于CC型个体,S2位点AA型个体在头长上显著高于AC型个体。双倍型D1在体质量、全长和体高方面显著高于双倍型D3,在体质量、体宽和体高方面显著高于双倍型D4。本研究在大口黑鲈ghrelin基因启动子区域获得的与生长性状相关的SNPs标记,可为大口黑鲈分子标记辅助育种提供帮助。

精神分裂症ghrelin基因多态性与利培酮治疗前后血糖的变化

目的观察精神分裂症受试者经利培酮单药治疗后血糖的变化及ghrelin基因Leu72Met多态性与血糖变化的关系。方法66例精神分裂症受试者经利培酮单药治疗10周,于治疗前和治疗4周、10周时分别检测受试者的空腹血糖水平。PCL-RFLP检测受试者ghrelin基因Leu72Met多态性。结果利培酮治疗期间,精神分裂症受试者的空腹血糖显著性增加,治疗4周和10周时与治疗前相比差异有统计学意义[(4.994±0.808)、(5.211±0.655)mmol/Lvs.(4.589±0.832)mmol/L,F=13 125.61,P<0.05];空腹血糖变化在性别间没有显著性差异(F=0.147,P>0.05),但女性血糖升高时间早于男性;空腹血糖水平变化与ghrelin基因多态性有关,Leu72等位基因携带者空腹血糖水平较高[(0.702±0.009)mmol/Lvs.(0.677±0.008)mmol/L,F=4.269,P<0.05]。结论精神分裂症患者在利培酮急性治疗期间会有空腹血糖水平的升高,尤以女性更易发生;ghrelin基因Leu72等位基因是应用利培酮时高血糖的危险因素。

Ghrelin基因在多囊卵巢综合征患者卵巢颗粒细胞中的表达

目的:探讨Ghrelin基因在卵巢颗粒细胞中的表达及其与多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)的关系。方法:选择47例在重庆医科大学辅助生育中心接受体外受精-胚胎移植治疗的不孕妇女,其中PCOS组11例,对照(Non-PCOS)组36例,采用real-time PCR及免疫印迹法分别测定2组妇女卵巢颗粒细胞中Ghrelin m RNA和蛋白的表达水平。结果:PCOS妇女颗粒细胞中Ghrelin m RNA和蛋白的表达均低于Non-PCOS妇女(0.926±0.206 vs.1.137±0.105,t=2.73,P=0.015;0.647±0.052 vs.0.937±0.038,t=7.82,P=0.001)。结论:PCOS妇女卵巢颗粒细胞的Ghrelin m RNA和蛋白表达水平明显低于Non-PCOS妇女,可能与卵泡发育障碍相关。

草鱼ghrelin基因的分子克隆与组织分布及其摄食调控作用分析

ghrelin是一种在脊椎动物摄食调节过程中起重要作用的脑肠肽,具有明显的摄食促进作用。实验利用同源克隆技术获得了草鱼ghrelin基因的cDNA序列和DNA序列,其中cDNA序列全长506 bp,包括90 bp的5′端非编码区(5′-untranslated region,5′UTR),312 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),以及104 bp的3′端非编码区(3′-untranslated region,3′UTR)。开放阅读框编码的103个氨基酸的ghrelin前体肽,经剪切加工后形成含有19个氨基酸的成熟肽。氨基酸序列分析结果显示,草鱼ghrelin与硬骨鱼类ghrelin相似度最高,而与其他脊椎动物相似度较低,同时草鱼ghrelin成熟肽N端的"活性中心"(active core)为鲤科鱼类中常见的GTSF形式。与大多数硬骨鱼类的ghrelin基因结构相同,草鱼ghrelin基因也包括4个外显子和3个内含子。荧光定量PCR检测到ghrelin mRNA大量分布于草鱼的前肠和脾,脑、肾、肝、肌肉、皮和鳔等组织也有ghrelin mRNA分布。草鱼脑和肠中的ghrelin表达水平在摄食后下降,随着饥饿时间的延长表达水平逐步升高,最后维持在较高水平,表明ghrelin作为摄食启动信号对草鱼的摄食活动起到了促进作用。

Ghrelin基因多态性与2型糖尿病的相关性

目的探讨ghrelin基因多态性与2型糖尿病之间的关系。方法进行ghrelin基因C408A和G346A的多态性分析,同时进行生化指标和临床参数的检测。结果正常对照组(NGT组)C408A基因型CC、CA、AA的基因型频率分别为75.4%、24.0%及0.6%。2型糖尿病组(DM组)中CC、CA及AA的基因型频率分别为70.8%、28.2%及1.0%。NGT组CC基因型者总胆固醇水平明显高于CA+AA基因型者(P<0.05);DM组CC基因型者血尿酸水平明显高于CA+AA基因型者(P<0.05)。在所有的受试者中未发现G346A多态性存在。结论Ghrelin基因C408A分布与等位基因频率没有明显的差异;本组人群中未发现ghrelinG346A多态性存在;C408A多态性与总胆固醇和尿酸水平相关。

黄鳝ghrelin基因的克隆及分子特征分析

Ghrelin是联系生殖和能量代谢的重要桥梁信号分子,通过克隆黄鳝(Monopterus albus)的ghrelin基因并对其基因结构和功能进行了初步分析;运用c DNA末端快速扩增技术获得了黄鳝ghrelin基因的c DNA序列和DNA序列全长。结果表明,黄鳝ghrelin基因c DNA全长552 bp(Gen Bank accession no.JX122807),包括115 bp的5'端非编码区、324 bp的完整开放阅读框以及113 bp的3'端非编码区;DNA序列全长1323 bp,由3个内含子和4个外显子构成,内含子剪切位点具有典型识别核苷酸GT/AG,3个内含子分别为594 bp、84 bp和93 bp,4个外显子长度分别为229 bp、78 bp、112 bp和133 bp。氨基酸序列分析显示,ghrelin基因推导的Ghrelin蛋白前体原(propreghrelin)序列由26 aa的信号肽、19 aa的成熟肽以及C端氨基酸残基等构成;其中,成熟肽第3位为丝氨酸(Ser3),是Ghrelin的酰基化位点;C端氨基酸残基序列极可能包括与Ghrelin成熟肽功能相互拮抗的肥胖抑制素(Obestatin)。氨基酸的同源性及进化关系分析表明,黄鳝与某些鲈形目鱼类的蛋白前体原存在高度相似性,且在进化上黄鳝与较高级的鲈形目、鲽形目鱼类聚为一支。ghrelin基因结构及其蛋白质某些氨基酸残基序列的高度保守,预示着Ghrelin在脊椎动物中有着重要的生理功能与类似的作用机制。

中国汉族人群Ghrelin基因Leu72Met多态性与2型糖尿病相关性Meta分析

目的探讨ghrelin基因Leu72Met(C408A)位点多态性与中国汉族2型糖尿病(T2DM)人群发病的关系。方法检索中国生物医学文献数据库、万方医学网,检索时间范围包括2013年5月之前的所有文献,分别检索到研究ghrelin基因Leu72Met位点多态性与中国汉族T2DM相关文献15篇。按纳入、排除标准选取病例,采用RevMan4.2.10分析其相关性。结果纳入研究文献5篇(涉及l 132例2型糖尿病患者和961名对照组)。Meta分析结果表明,中国汉族人群2型糖尿病与Leu72Met位点多态性相关:AA基因型与CA基因型和CC基因型合并后比较,固定效应模型OR=2.55,95%CI:1.07～6.11,P=0.03;AA基因型与CC基因型比较,固定效应模型OR=2.63,95%CI:1.09～6.30,P=0.03;等位基因A与C比较,固定效应模型OR=1.30,95%CI:1.06～1.60,P=0.01。结论 Ghrelin基因Leu72Met位点多态性与中国汉族人群2型糖尿病的发生发展可能有关。

贵州竹乡乌骨鸡Ghrelin基因的克隆及原核表达

采用特异性引物自贵州黑羽乌骨鸡胃部组织克隆了Ghrelin的基因,基因全长2330bp,含有4个外显子,3个内含子。采用RT-PCR技术,获得了Ghrelin cDNA片段(563bp),序列分析推测,通过可变剪切可产生两段mRNA,cDNA编码区与基因组中的编码区完全一致。黑羽乌骨鸡Ghrelin基因与已知鸡种比较有13～18个碱基不同,相似性为99.1%～99.3%,但其氨基酸序列完全一样,表明禽类的Ghrelin多肽高度保守。将其中Ghrelin编码区亚克隆到原核表达载体pTYB11中,经序列测定碱基序列正确,获得重组质粒pTYB11/G。在IPTG的诱导下,重组质粒在大肠杆菌ER2566中获得表达。当OD600=0.5,IPTG为浓度1mmol/L,诱导5小时的表达量最高,融合蛋白占细胞总蛋白的40%。采用几丁质结合的预装柱对表达产物进行纯化,产率约为5mg/L培养液。

利用RT-PCR技术扩增绵羊输卵管上皮细胞Ghrelin基因

提取绵羊输卵管上皮细胞总RNA,采用Primer 5.0软件设计引物,运用RT-PCR技术扩增Ghrelin基因。结果显示,经测序和序列比对鉴定,该方法成功地扩增到了大小为200 bp的目的基因,表明RT-PCR技术是检测绵羊输卵管上皮细胞中Ghrelin基因的有效手段,可为今后研究不同激素水平下绵羊输卵管组织中Ghrelin基因的表达量变化及进一步体外试验奠定基础。

Ghrelin基因在藏猪胃底组织中的mRNA表达

为分析Ghrelin基因在藏猪与长白猪胃底组织中mRNA的表达差异,运用实时荧光定量PCR技术,对Ghrelin基因在藏猪与长白猪胃底组织中mRNA的表达水平进行相对定量检测分析。结果显示,藏猪胃底组织中mRNA的表达量(0.495 8±0.023 1)显著低于长白猪(0.741 7±0.026 6)。说明Ghrelin基因在藏猪胃底组织中mRNA的低表达可能是藏猪生长缓慢的原因之一,这将为提高藏猪生长速度的进一步研究奠定基础。

120例类风湿性关节炎患者Ghrelin基因C408A多态性观察

目的 探讨Ghrelin基因C408A多态性与类风湿性关节炎（RA）的关系。方法 采用PCR-RFLP方法结合DNA测序技术检测120例RA患者（观察组）和150例健康查体者（对照组）Ghrelin基因C408A位点多态性及等位基因频率分布情况。结果 Ghrelin基因C408A位点存在碱基二态性C或A。对照组基因型CC型107例（71.3%）、CA型41例（27.3%）、AA型2例（1.4%）,观察组CC型71例（59.2%）、CA型46例（38.3%）、AA型3（2.5%）;对照组等位基因C频数255例（85.0%）,A为45例（15.0%）;观察组为等位基因C 188例（78.3%）,A为52例（21.7%）。各基因型在两组中的分布经卡方检验,P〈0.05。纯合AA型（P=0.019,OR=1.963,95%CI为1.362-5.015）与杂合的CA型（P=0.023,OR=1.971,95%CI为1.117-3.752）可能增加RA的发病风险。等位基因频率在两组间存在显著性差异,A等位基因可能增加发病风险（P=0.022,OR=1.607,95%CI为1.121-3.218）。观察组基因型为CC、CA、AA者发病年龄分别为（46.3±11.6）岁、（37.5±10.3）岁、（38.8±5.9）岁,不同基因型者发病年龄有统计学差异（F=26.067,P〈0.05）,基因型为AA者发病年龄较小。观察组基因型为CC、CA、AA者男性病例数目分别为27、18、1例,不同基因型RA患者性别分布差异无统计学意义。结论 RA患者Ghrelin基因C408A位点存在多态性。基因型为AA、CA者RA发病风险高于CC者。A等位基因者发病风险增加;基因型为AA者发病年龄较小。

巢湖鸭Ghrelin基因外显子3的SNP检测及其与体尺性状的关联分析

[目的]分析巢湖鸭Ghrelin基因多态性及其与巢湖鸭体尺性状的关系。[方法]以巢湖鸭为试验材料,采用PCR-SSCP分析检测巢湖鸭Ghrelin基因外显子3的单核苷酸多态性,并将其与巢湖鸭体重、体斜长、胸深、胸宽和龙骨长等体尺性状进行关联分析。[结果]检测到3种基因型AA、BB和AB。巢湖鸭外显子3第54位发生了G→A的突变,该突变位点对巢湖鸭体重、胸深和龙骨长的影响达到极显著水平(P<0.01),对体斜长、胸宽和半潜水长的影响达到显著水平(P<0.05),对胫长和胫围的影响不显著(P>0.05)。BB基因型的体重、体斜长、胸深、胸宽、龙骨长和半潜水长显著高于AA型和AB型。[结论]Ghrelin基因多态性与鸭的部分体尺性状存在显著相关性,且对B等位基因进行选择将有利于提高巢湖鸭的体尺指标。

中国人群Ghrelin基因Leu72Met多态性与2型糖尿病关系的Meta分析

目的评价中国人群Ghrelin基因Leu72Met,多态性与2型糖尿病的相关性。方法检索相关数据库,收集Ghrelin基因Leu72Met多态性与2型糖尿病的相关性研究,对纳入文献提取有效数据后应用RevMan5.1.1软件进行Meta分析,得出合并后的OR值及95%CI。结果最终纳入5篇相关文献。Meta分析结果显示:以CC基因型为暴露因素,具有CC基因型的人群2型糖尿病发病风险明显减少[OR=0.74,95%CI(0.60,0.93)],差异有统计学意义;以AA基因型为暴露因素,CA+AA基因型合并为非暴露因素,具有AA基因型的人群2型糖尿病发病风险明显增加[OR=2 32,95%CI(1.09,4.91)],差异有统计学意义;以A基因型为暴露因素,C基因型为非暴露因素,具有A基因型的人群2型糖尿病发病风险明显增加[OR=1.33,95%CI(1.10,1.61)],差异有统计学意义。结论 Ghrelin基因408位点CC基因型可能是2型糖尿病的保护性因素,而A等位基因、AA基因型可能是2型糖尿病易感性的危险因素。

绵羊Ghrelin基因的克隆和生物信息学分析

根据GenBank中报道的绵羊Ghrelin基因mRNA序列设计特异性引物,以甘肃肉用绵羊新品种选育群羔羊皱胃组织RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增出绵羊Ghrelin基因并克隆到pMD18-T载体中进行测序验证.用生物信息学软件预测其结构,并构建系统进化树,探讨了绵羊Ghrelin基因的生物学功能.结果表明:克隆的绵羊Ghrelin基因序列共409bp,包含完整的编码区序列,含有1个351bp的完整开放阅读框,编码116个氨基酸;Ghrelin蛋白分子质量为12 975.74u,理论等电点为4.70,信号肽切割点位于第23～24位氨基酸之间,整条多肽链表现为疏水性,是一种典型的跨膜脂溶性蛋白;Ghrelin基因编码产物的二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主,主要位于胞外(包括细胞膜),作为一种激素参与机体胁迫应答、免疫应答和转录调控.

Ghrelin基因Arg51Gln、Leu72Met多态性与甘肃回族2型糖尿病及血脂的关系

目的探讨Ghrelin基因Arg51Gl(G-A)和Leu72Met(C-A)多态性与甘肃回族2型糖尿病及血脂的关系。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法检测甘肃回族人251例(2型糖尿病138例,对照组113例),Ghrelin基因Arg51Gln和Leu72Met各基因型,并测定其相关临床、生化指标。结果 Ghrelin基因Arg51Gln和Leu72Met位点各基因型和等位基因的频率,2型糖尿病组和对照组比较差异均无统计学意义。Arg51Gln位点携带A等位基因者总胆固醇水平显著高于G携带者,其差异有统计学意义(P<0.05);Leu72Met位点C等位基因携带者总胆固醇明显高于A者,其差异有统计学意义(P<0.05)。结论 Ghrelin基因Arg51Gln和Leu72Met多态性与本组人群2型糖尿病无关,但Arg51Gln和Leu72Met多态性均与总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇水平相关。

Ghrelin基因多态性与原发性高血压患者危险因素的关系研究

目的:探讨人生长激素释放多肽(Ghrelin)基因多态性与原发性高血压患者危险因素的关系及其机制。方法:2014年10月至2015年10月选取80例原发性高血压患者进行研究,另选取80例健康体检者为对照组,采用Taq Man-PCR法测定两组Ghrelin基因多态性,并分析Ghrelin基因多态性与高血压患者高危因素的关系。结果:与对照组相比,高血压组患者CC、CA、AA型基因频率分布为68.75%、17.50%、13.75%,等位基因C、A频率分别为0.185、0.875,对照组分别为18.75%、35.00%、46.25%,等位基因C、A频率分别为0.125、0.815。Ghrelin基因CC型高血压患者血清甘油三脂(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、总胆固醇(TG)、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、腰臀比(WHR)、体质量(BMI)水平显著高于CA型及AA型(P<0.05),而HDL-C低于CA型及AA型(P<0.05)。经卡方及Logistic多因素分析,Ghrelin基因CC型与TC异常、LDL-C异常、SBP异常、DBP异常、BMI异常有关。结论:Ghrelin基因多态性与导致高血压的高危因素,如TC异常、LDL-C异常、SBP异常、DBP异常、BMI异常等有关,因此,Ghrelin基因多态性可能参与原发性高血压的发病机制。