一株野鸟源H5N8高致病性禽流感病毒的遗传演化分析及生物学特性研究

2021年本实验室从发病野鸟组织样品中分离到一株H5N8亚型禽流感病毒(AIV),命名为A/black-headed gull/Tibet/1-2/2021(H5N8),简称为BH Gull/TB/1-2/2021(H5N8)。为进一步了解该病毒的生物学特性,本研究对其基因组测序并经遗传演化分析,结果显示,该病毒HA蛋白的裂解位点为PLREKRRKR↓GLF,符合高致病性AIV(HPAIV)的分子特征。在遗传进化上HA基因属于2.3.4.4b分支,外部基因与部分内部基因(PB1、PA、NP、NS)均与2020年~2021年分离到的H5N8亚型AIV相应基因的同源性最高,且处于同一分支;PB2基因与一株H9N2亚型AIV PB2基因同源性最高,为99.25%;M基因与近两年流行的2.3.4.4b分支H5N1亚型AIV同源性最高,且处于同一分支,推测该病毒为一株重组病毒。抗原性分析结果显示,该病毒与2.3.4.4分支H5-Re8、2.3.4.4b分支H5-Re14疫苗株抗原性相近。不同哺乳动物细胞系生长曲线结果显示,该病毒可在哺乳动物细胞系中有效复制,但其在A549中的复制效率高于其在MDCK及293T细胞中的复制效率。BALB/c小鼠感染实验结果显示,该病毒不经提前适应即可在小鼠的多脏器中有效复制,对小鼠的半数致死量(MLD50)为0.98log10EID50,对小鼠呈高致病性。本研究结果对H5亚型HPAI的综合防控和公共安全预警具有借鉴意义。

1株黑天鹅源H5N8亚型禽流感病毒遗传演化分析

为分析1株黑天鹅源H5N8亚型禽流感病毒(AIV)的遗传演化特征,对2021年从北京圆明园遗址公园送检的黑天鹅样品中鉴定出的1株H5N8亚型禽流感病毒(A/Wild swan/China/Beijing0201/2021)的全基因组进行扩增、克隆与序列测序,并应用分子生物学软件对其进行遗传演化及关键氨基酸位点分析。结果显示,该H5N8亚型禽流感病毒株属于clade2.3.4.4b进化分支,其PB2、PB1、PA、HA、NA、NP、MP、NS基因均与H5N8亚型AIV的相应基因片段具有较高同源性,且与2020-2021年越南、哈萨克斯坦、俄罗斯、柬埔寨、法国等地的H5N8毒株密切相关。氨基酸位点分析显示,该毒株HA蛋白裂解位点呈现高致病性禽流感病毒的分子特征,且出现S137A、T160A、T192I、S227R氨基酸突变,158位缺失糖基化位点,这些位点的突变均能够增强H5亚型禽流感病毒对人源唾液酸受体结合的能力;该毒株的PB2蛋白、NP蛋白、M1蛋白和NS1蛋白均存在多个可以增强流感病毒在哺乳动物体内的复制能力和致病性的关键氨基酸位点。研究结果可为H5N8亚型禽流感病毒的进化规律研究及综合防控提供参考。

近期全球H5N8亚型禽流感疫情分析

近期H5N8亚型高致病性禽流感疫情相继在欧洲、亚洲和大洋洲部分地区的14个国家暴发。其中,欧洲疫情呈现出传播迅速、野禽传染家禽的特点。分析发现,此次流行的H5N8亚型禽流感病毒属于第2.3.4.4分支,与2014—2015年在全球流行的H5N8病毒属于同一个分支,但病毒已发生了较大变异;此次在欧洲开始暴发的H5N8疫情主要由野生鸟类引起,候鸟在此次禽流感病毒环球传播中起主要作用。伴随着候鸟迁徙和周边国家的疫情形势,我国家禽发生禽流感疫情的风险较大,提示应做好疫苗的免疫工作,加大对家禽和野鸟的监测力度,提高养殖场的生物安全防护水平。

陕西省一起野禽H5N8亚型高致病性禽流感疫情紧急流行病学调查

2021年6月9日,陕西省神木市红碱淖国家级自然保护区发生一起野禽H5N8亚型高致病性禽流感疫情。为了解该起疫情的发生经过、可能来源、内部传播方式以及对外扩散风险,组织开展了流行病学调查。现场调查发现:5月27日该保护区的黑颈䴙䴘种群开始发病死亡,28日保护区工作人员发现后上报疫情,经国家禽流感参考实验室确诊为H5N8亚型高致病性禽流感疫情;截至6月26日,累计死亡黑颈䴙䴘5486只,未见其他鸟类及周边家禽异常死亡。采样检测发现,野禽环境中病毒污染面较小,家禽中未检出病原,家禽H5亚型禽流感免疫抗体水平较高。调查认为:疫情由迁徙候鸟感染禽流感病毒传入引起,发病局限于野禽;因红碱淖水质碱性较强,病毒存活时间较短,疫情经湖水传播的风险性较小。疫情确诊前,保护区已采取了无害化处理病死禽、消毒、人车管控等措施,当地农业农村部门对周边家禽开展了禽流感紧急疫情排查和强化免疫。因此,结合现场调查和实验室检测结果,推断疫情由野禽向家禽扩散风险很低。本次疫情提示,应多部门密切协作,持续做好高致病性禽流感疫情监测工作,做到疫情早发现,果断处置,以降低疫情扩散风险。

Re-8株H5亚型禽流感灭活疫苗对野鸟源H5N8流感病毒的免疫保护性研究

为评估当前应用的Re-8株种毒相关禽流感灭活疫苗对野鸟源H5N8流感病毒的免疫预防效果,本研究将重组禽流感病毒(AIV)H5亚型Re-8株灭活疫苗(H5N1亚型,Re-8株)和重组AIV(H5+H7)灭活疫苗(H5N1Re-8株+H7N9 H7 Re-1株)分别以0.3 m L/只的剂量接种3周龄SPF鸡,免疫3周时进行HI抗体检测和攻毒试验。结果显示,上述2种疫苗免疫的SPF鸡血清中针对H5亚型Re-8株抗原的HI抗体均在8 log2以上,以105EID50的剂量、鼻腔感染途径攻击野鸟源H5N8病毒BHG/QH/2/16和BHG/Tibet/3/16后,所有免疫组鸡在14 d观察期内均全部健活,不排毒,而对照组鸡在攻毒后4 d内全部发病、死亡、排毒。现地免疫重组AIV H5亚型三价灭活疫苗(Re-6株+Re-7株+Re-8株)的商品蛋鸡直接进行HI抗体检测和攻毒试验,结果显示,免疫蛋鸡血清中针对Re-8株抗原的HI抗体平均滴度为8.3 log2,以相同攻毒方式和剂量分别攻击2株H5N8病毒后,免疫鸡也获得完全免疫保护,不发病、不死亡、不排毒。本研究结果表明,含有重组AIV H5 Re-8株抗原的灭活疫苗可有效防控野鸟源H5N8流感病毒,为我国及其他国家H5N8亚型禽流感免疫防控提供了科学依据。

高通量测序一株天鹅源H5N8亚型流感病毒遗传演化分析

为研究一株天鹅源H5N8亚型禽流感病毒(AIV)的遗传演化规律,本研究对2016年从山西省疾控中心送检天鹅样品中分离到的一株H5N8亚型流感病毒(A/swan/Shanxi/6/2016)的全基因组序列进行高通量测序及遗传演化分析。结果显示,分离的病毒为Clade 2.3.4.4分支高致病禽流感病毒(HPAIV);BLAST分析显示该分离株的NP基因与H3N8亚型AIV的NP基因具有较高同源性,而其它基因节段则分别与来自其它国家的H5N8亚型AIV的相应基因节段同源性较高,进一步选取与各基因节段核苷酸同源性较高的病毒株作参考序列构建其系统进化树,推测该分离株为一株重组病毒株。特殊氨基酸位点分析显示,其具有典型的禽型受体结合位点和典型的人型受体结合位点。并且M1蛋白、NS1蛋白和PB2蛋白具有H5N1亚型AIV对鼠致病性增强的分子标志,提示该株野鸟源流感病毒可能具备感染哺乳动物的能力。本研究对H5N8亚型AIV的综合防控具有一定的指导意义。

山东省首起野生天鹅H5N8高致病性禽流感疫情的紧急调查及处置

2021年1月12—19日,山东黄河三角洲国家级自然保护区大汶流管理站出现35只死亡的野生疣鼻天鹅。经现场调查,市级和省级实验室检测,诊断为疑似H5N8亚型高致病性禽流感,经国家禽流感参考实验室进行病毒分离鉴定,最终确定为H5N8亚型高致病性禽流感疫情。疫情发生后,通过现场调查、座谈及实验室检测等方式,对此次疫情开展了紧急流行病学调查,追溯疫情的可能来源,分析疫情的扩散风险,继而提出针对性的应急处置措施。调查发现,此次疫情由迁徙候鸟带毒引入引起的可能性较大;野生鸟类未及时开展免疫,导致体内抗体水平低下是疫情暴发的内源因素。由于迅速采取了合理的应急处理措施,此次疫情得到迅速控制,避免了疫情扩散。本次疫情警示,必须切实做好禽流感的强制免疫和监测工作,高度重视自然保护区及其附近场所珍稀禽类的免疫,以降低疫情发生风险。

山西省平陆县野生大天鹅H5N8高致病性禽流感疫情紧急流行病学调查

2020年11月,山西省平陆县三湾大天鹅景区发现2只野生大天鹅不明原因死亡,经山西省动物疫病预防控制中心初诊,国家禽流感参考实验室确诊,诊断为H5N8亚型高致病性禽流感疫情。为查明疫情起因,摸清疫情情况,按照国家相关技术规范,组织相关部门开展了紧急流行病学调查和疫情处置工作,查找疫情的可能来源和扩散路径,研判疫情扩散风险,并提出合理化防控建议。经调查,此次疫情起因很可能是野生大天鹅在迁徙过程中已感染高致病性禽流感病毒,到达越冬地后发病死亡。经紧急疫情处置,疫情得到有效控制,家禽发生疫情的风险较小。本次疫情提示,候鸟迁徙期间是禽流感疫情高发期,要做好候鸟栖息地周边家禽养殖场的强制免疫和监测工作,落实生物安全防护措施,避免饲养的家禽与野禽接触,以降低由野生动物引发疫情的风险。

一起野禽H5N8亚型禽流感疫情的处置与思考

2021年1月,江苏省连云港市云台山景区云台街道西隅水库发生一起疑似野禽H5N8亚型禽流感疫情,共17只鸳鸯、大雁感染死亡。江苏省动物疫病预防控制中心迅速组织相关人员,指导连云港市按照国家相关方案和规范要求,开展现场调查、实验室诊断和应急处置工作。经江苏省动物疫病预防控制中心初诊,国家禽流感参考实验室确诊,诊断为H5N8亚型高致病性禽流感疫情。同时,指导当地政府划定疫点、疫区和受威胁区,封锁相关区域,开展应急监测、紧急流行病学调查、全面消毒等应急处置工作。经果断处置,疫情得到了有效控制,未造成扩散和蔓延。本次疫情提示:野禽疫情的早期发现和及时控制对于降低疫情扩散风险至关重要;林业和农业农村部门的沟通协作要继续加强,日常的禽流感监测力度需要进一步加大,家禽的禽流感疫苗免疫要更加科学,群众的禽流感防控意识要持续提高。

H5N8亚型禽流感病毒HA基因和NA基因核酸标准物质的制备及分析

为了提高H5N8亚型禽流感病毒核酸检测结果的准确性,试验按照国家标准GB/T 19438.1-2004和GB/T 19438.2-2004选出禽流感病毒H5N8亚型毒株,根据HA和NA基因全长序列分别设计特异性引物进行扩增;利用基因克隆和体外转录技术制备出H5N8亚型禽流感病毒检测用核酸标准物质,并测定其浓度和纯度;采用实时荧光定量RT-PCR方法对体外转录产物HA-cRNA、NA-cRNA进行验证并绘制标准曲线;检测HA-cRNA、NA-cRNA的均匀性和稳定性,并通过协作标定方式对其含量及不确定度进行分析。结果表明:H5N8亚型禽流感病毒HA和NA基因片段大小为1704 bp和1413 bp,与预期大小一致。H5N8亚型禽流感病毒核酸标准物质HA基因的OD260/OD280值为1.93,浓度为11.32 ng/μL;NA基因的OD260/OD280值为2.06,浓度为14.24 ng/μL。体外转录产物HA-cRNA、NA-cRNA均有典型的扩增曲线,HA基因标准曲线回归方程为y=-3.5932x+25.867,R2=0.9971;NA基因标准曲线回归方程为y=-4.1537x+35.578,R2=0.9956。核酸标准物质的组间和组内精密度差异不显著(P>0.05),均匀性好。在不同温度保存时间内的核酸标准物质含量稳定,无明显变化;HA和NA基因核酸标准物质的最终定值结果为(4.13±0.18)×10^9copies/μL和(1.77±0.15)×10^10 copies/μL。说明试验制备的HA和NA基因核酸标准物质可作为H5N8亚型禽流感病毒核酸检测的标准质控品。

H5N8亚型禽流感病毒HA和NA基因双重荧光RT-PCR检测方法的建立

H5N8亚型禽流感是传播性极强的人兽共患病,为了简便快速的检测H5N8亚型禽流感病毒,针对H5N8亚型禽流感病毒HA基因和NA基因序列分别设计合成特异性引物和探针,通过优化反应条件,建立了同一反应程序下同时扩增HA基因和NA基因的双重荧光RT-PCR检测方法。结果显示,该检测方法特异性强,不与其他亚型禽流感病毒和禽常见病原发生交叉反应,敏感性可达10 copies/μL;组内组间重复性好,平均变异系数均小于0.4%;用该方法对108份临床样品检测,结果与病毒分离鉴定方法检出率一致。综上所述,建立的H5N8亚型禽流感病毒双重荧光RT-PCR检测方法具有快速、特异、敏感、重复性好等优点,为H5N8亚型禽流感的快速诊断和疫情防控提供了一定的技术支持。

2021年北京市野生天鹅死亡案例的诊断及其H5N8禽流感病毒的遗传变异分析

为探明2021年2月北京市海淀区圆明园遗址公园内3只野生天鹅异常死亡的原因,本试验通过临床剖检和实验室检测进行综合分析,并对临床样品进行病毒分离和基因组测序分析。结果显示:病死天鹅头面部水肿,角膜充血,消化道、呼吸道黏膜广泛充血、出血等典型禽流感特征,实验室检测确诊病原为H5N8亚型禽流感病毒;遗传进化分析显示,该病毒属于2.3.4.4分支;分离到的毒株HA裂解位点符合高致病性禽流感分子特征;氨基酸位点分析显示,该病毒含有典型的禽型α2-3受体结合位点。本研究结果对北京地区及时、准确地防控H5N8亚型禽流感病毒具有重要意义。

东营市一起野生天鹅H5N8亚型高致病性禽流感疫情疫区解除封锁风险评估

2021年1月,东营市境内山东黄河三角洲国家级自然保护区发生一起野生天鹅输入性H5N8亚型高致病性禽流感疫情,经国家禽流感参考实验室检测后确诊。东营市有关部门高度重视,立即启动应急预案,落实各项防控措施,成功处置疫情,未发生传播扩散。本文回顾了该起疫情疫区解除封锁评估有关情况,以期为重大动物疫情处置提供参考。

欧洲六国暴发H5N8禽流感

最近,德国媒体报道,六个欧洲国家已证实暴发H5N8禽流感,这种病毒已在德国引起恐慌。据德新社德国什未林报道,德国、荷兰、波兰、匈牙利、丹麦和奥地利都报告说,高致病性禽流感正在野生鸟类中传播。报道称,在德国,这种病毒首先在东部的梅克伦堡-前波美拉尼亚州和南部康斯坦茨湖的巴伐利亚州发现,北部的石勒苏益格-荷尔斯泰因州和南部的巴登-符滕堡州均发现了野生鸟类的尸体，促使部分州政府发布指示将家禽关养在室内，以防止受到野生鸟类的传染。

欧洲多国出现H5N8禽流感疫情

近期,法国、克罗地亚、丹麦、德国、瑞士、荷兰、匈牙利和芬兰等欧洲国家先后报告H5N8型禽流感病毒感染造成野生鸟类或家禽死亡事件,引起多方关注。

德国农场发现H5N8禽流感病毒扑杀约7.7万禽鸟

德国当局日前表示,德国北部下萨克森州某主要禽类养殖区农场发现高传染性H5N8禽流感病毒之后,目前有大约7.7万只火鸡和鸡鸭正在被扑杀。下萨克森州农业部发布公告称,在三个农场发现H5N8病毒,另有三个农场与之有接触,这几个农场在圣诞节周末开始扑杀5.5万只禽鸟。

H5N8高致病性禽流感病毒HA蛋白T细胞抗原表位的预测

目的利用生物信息学方法对H5N8高致病性禽流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白的T细胞的优势抗原表位进行预测,探索高致病性禽流感抗原表位快速预测方法。方法以甲型流感病毒[A/chicken/Moscow/94/2017(H5N8),ID:ATE48581.1]为原始毒株,从GenBank数据库中获取其血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白的氨基酸序列,综合应用多个生物信息学工具对HA蛋白潜在的细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)表位和辅助T细胞(helper T lymphocyte,HTL)表位进行预测。结果H5N8高致病性禽流感病毒的HA蛋白保守性较高,44条不同病毒株HA蛋白可以装进同一系统进化枝。经预测,HA蛋白的一级、二级结构明确,三级结构模型可信度高,构象合理。最终筛选到具有免疫原性且抗原性较好、无致敏性、无毒性的CTL表位8条,筛选到抗原性较好、无致敏性、无毒性、能诱导γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)、白介素4(interleukin 4,IL-4)分泌的HTL表位8条。预测的16条表位在不同的44条H5N8蛋白序列之间的保守性最好,在10条H5N6的HA蛋白序列之间的保守性次之,在13条H5N1的HA蛋白序列之间保守性较差。结论通过本研究的预测流程可以快速筛选出HA蛋白的CTL表位和HTL抗原表位,为快速高效研发新型重组多肽流感疫苗提供了技术路线和理论参考。

H5N8亚型禽流感病毒HA1蛋白的抗原表位鉴定

为了确定H5N8亚型禽流感病毒的新抗原表位,将原核表达的H5N8亚型禽流感QH448毒株HA1蛋白为免疫原免疫小鼠,通过筛选获得5株抗QH448(H5N8) HA1蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株。经鉴定,1H12B9、8A12D10和9H10F5的重链为Ig G1亚型,2A9D11和7E9G6的重链为Ig G2b亚型,而轻链均为κ链。5株单克隆抗体均能特异性识别H5亚型禽流感病毒HA蛋白。通过截短表达策略确定,1H12B9和7E9G6的识别表位为^(330)ATGLRNSPLREKRRKR^(345),2A9D11、8A12D10和9H10F5的识别表位分别为^(310)IHP LTIGECPKYVKSN^(325)、^(271)KIVKKGDSTIMKSEV^(285)和^(121)LSRINHFEKILIIPKS^(136)。同源性比较结果显示,筛选出的4个抗原表位在H5-HA蛋白序列中均高度保守。综上所述,本研究获得了5株抗H5-HA蛋白不同抗原表位的特异性单克隆抗体细胞株,为H5N8亚型禽流感的诊断提供了新的靶标抗体。

H5N8亚型禽流感病毒HA蛋白的原核及真核表达及兔多克隆抗体的制备

目的 构建H5N8亚型禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)HA基因的原核和真核表达载体,分别在E.coli Rosetta(DE3)和Sf9中进行表达,并制备兔多克隆抗体。方法 采用RT-PCR扩增H5N8亚型AIV的HA基因,并将其克隆至原核表达载体pTac-His-MBP-PreScission中,再转化至Rosetta(DE3)中,利用IPTG诱导表达。通过SDS-PAGE及蛋白免疫印迹(Western blot, WB)鉴定HA蛋白的表达,并优化IPTG浓度、诱导时间和温度以提高表达效率。将纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备兔抗H5N8亚型AIV的HA蛋白多克隆抗体,通过酶联免疫吸附实验(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测其特异性和效价。同时,将HA基因克隆到真核表达载体pFastBacHTA中,将其瞬时转染Sf9细胞并扩增3代,最后通过WB和间接免疫荧光试验(Indirect immunofluorescence assay, IFA)验证表达产物。结果 成功构建了HA基因的原核重组质粒pTac-HA-DE3和真核重组质粒pFast-HA。经SDS-PAGE及WB验证该蛋白分子质量约110 ku,最佳表达条件为IPTG浓度为0.8 mmol/L、温度37℃和诱导时间为4 h。ELISA检测显示兔多克隆抗体效价为1∶102 400。成功将真核重组质粒pFast-HA转化入DH10Bac感受态细胞中,证明HA基因成功转座。Bacmid-HA转染Sf9细胞后观察到细胞病变,WB和IFA检测表明重组杆状病毒Bac-HA感染的Sf9细胞能够表达HA蛋白。结论 本研究初步探究了H5N8亚型AIV HA蛋白的表达条件及免疫原性,并且具有良好的免疫原性和反应原性,为后续建立ELISA诊断试剂盒及H5N8 AIV疫苗的研制提供了一定的参考价值。

高致病性H5N8亚型禽流感假病毒的制备与验证

目的为研究高致病性H5N8亚型(A/Astrakhan/3212/2020)禽流感病毒的结构,制备相应假病毒,并对其在细胞水平上的感染能力以及血清抗体的中和能力进行初步验证。方法通过对H5N8亚型病毒的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的氨基酸序列分析,将目的HA和NA序列进行优化并提取相应质粒,采用慢病毒包装系统制备H5N8亚型假病毒;使用感染含有α-2,6唾液酸受体的293T-ST6GAL1细胞后的荧光素酶读值、血凝抑制试验、透射电镜以及血清中和试验对制备的假病毒进行验证。结果成功制备H5N8亚型假病毒,其对293T-ST6GAL1细胞的感染力为103TCID50/m L,浓缩50倍后血凝活性从16提高到128,透射电镜可观察到典型的流感病毒颗粒,中和试验显示3份H5N8阳性血清中和活性明显高于其他亚型阳性血清以及阴性血清。结论成功制备高致病性H5N8亚型禽流感假病毒,为未来的疫苗开发和中和抗体筛选提供了重要的实验平台。