一株鸡源H6N1亚型禽流感病毒全基因的分子特征

2008年国家禽流感参考实验室在我国禽流感流行病学调查期间分离到1株鸡源H6N1亚型禽流感病毒(AIV)A/Chicken/ZheJiang/80/2008(H6N1)(简称为CK/ZJ/80/08),为了弄清该病毒的分子特征,我们对其8个基因片段分别进行扩增和序列测定,对每个基因进行BLAST分析,找出同源性最高的毒株。利用DNAStar中的Megalign功能进行进化分析。结果表明CK/ZJ/80/08的HA裂解位点附近的氨基酸序列为QIETR↓GLF,推测可能为一株低致病力AIV。其HA基因与日本北海道的A/duck/Hokkaido/228/2003(H6N8)和黑龙江的A/mallard/Heilongjiang/131/2006(H6N2)以及香港早期分离株A/chicken/HongKong/17/77(H6N1)等处于同一分支;NA基因在颈部没有缺失,与A/duck/Tsukuba/718/2005(H1N1)、A/goose/Guangdong/1/96(H5N1)等处于同一分支;M基因与A/duck/Hokkaido/W90/2007(H10N7)高度同源(同源性为99%);NS基因与A/duck/Denmark/65047/04(H5N2)和A/goose/Guangdong/1/96(H5N1)处于同一分支。NP、PA、PB1、PB2分别与贵州和江西分离的H5N2亚型AIV的相应基因关系密切,同源性分别为98%、97%、97%、97%。由此推测CK/ZJ/80/08可能是由H6N2、H1N1、H10N7、H5N2等多个亚型病毒重组而成。

H6N1亚型禽流感病毒跨种属传播研究进展

禽流感病毒H6N1亚型广泛存在于水禽和陆禽,是最常分离到的甲型流感病毒亚型,遗传分析表明该病毒可能是高致病禽流感病毒H5N1的前体。随着病毒基因的持续进化,H6N1可跨种间屏障传播至哺乳动物,其对于哺乳动物小鼠、猪和雪貂已经具有较强感染能力。血清流行病学调查结果显示少数人H6禽流感病毒抗体阳性,2013年5月,我国台湾出现全球首例人类感染H6N1亚型流感病毒。因此,H6N1病毒宿主范围不断扩大,在这些宿主内可发生病毒基因突变、基因重配,进而演变为具有感染人类潜能的新变异株的可能。本文从病原学、流行病学、病毒感染哺乳动物和人类等方面对H6N1亚型禽流感病毒的研究进展进行综述,以期为H6N1禽流感病毒的防控提供参考。

PB2 E627K对A/H6N1亚型禽流感病毒致病性的影响分析

目的利用A/H6N1亚型禽流感病毒的反向遗传平台,评估PB2 E627K对A/H6N1亚型禽流感病毒的致病性,探究A/H6N1流感病毒的致病性分子基础。方法通过A/H6N1亚型禽流感病毒A/Mallard/San-Jiang/275/2007株反向遗传操作系统和点突变技术拯救病毒rA/H6N1和PB2 E627K位点发生突变的rA/H6N1-627,两株拯救病毒分别以101EID50～106EID50的攻毒剂量人工感染BALB/c小鼠,通过体重变化、死亡率、病毒滴定等方面进行致病性分析。结果成功构建A/H6N1亚型禽流感病毒的反向遗传平台,rA/H6N1的8个基因片段完全源于A/H6N1的基因组,核苷酸序列及生物学特性与A/H6N1完全一致。rA/H6N1能够人工感染BALB/c小鼠,但不致死,对BALB/c小鼠呈现低致病性(MLD50>106.5EID50),病毒在小鼠体内的分布情况及各个脏器中的病毒滴度与A/H6N1保持一致;rA/H6N1-627能感染小鼠,引起小鼠体重下降,但不能引起所有106EID50组小鼠死亡,病毒能在小鼠的肺脏和脑部进行增殖。结论实验结果表明,在H5N1禽流感中发挥重要作用的PB2-E627K位点并非A/H6N1流感病毒的毒力决定因子。A/H6N1流感病毒致病性的分子基础还有待继续研究,该反向遗传操作系统和点突变技术的建立为研究该亚型流感病毒致病机制、传播机制及病毒基因功能奠定了基础,同时也为A/H6N1亚型禽流感病毒新型疫苗的研制开辟了新途径。

A/H6N1亚型禽流感病毒致病性评估及与2009 A/H1N1亚型流感病毒在哺乳动物体内的遗传兼容性

目的探讨人、禽流感病毒在哺乳动物体内的遗传兼容性,为下一步研究H6亚型禽流感病毒重配和致病性变异的分子机制奠定基础。方法野鸭源A/H6N1亚型禽流感病毒A/Mallard/SanJiang/275/2007以101EID50～106EID50的攻毒剂量经鼻内途径感染小鼠,通过临床症状观察、病毒滴定和病理切片观察进行病毒学和组织学两方面检测对小鼠的致病性;同时,将此病毒与2009年A/H1N1流感病毒A/Changchun/01/2009(H1N1)混合感染豚鼠,分析两株病毒在哺乳动物体内的遗传兼容性。每天采集豚鼠鼻洗液并用噬斑纯化技术获得重配病毒,对获得的重配病毒进行全基因组序列的测定。结果 H6N1亚型禽流感病毒能直接感染小鼠,但对小鼠不致死。106EID50的攻毒剂量可有效感染小鼠,攻毒后第5天,小鼠表现出被毛较粗乱、活动减少、体重下降、呼吸急促的临床症状,但至攻毒后第10天开始康复,而对照组(MOCK)小鼠在14 d的观察期内无明显临床症状。病毒滴定结果表明,该病毒主要在小鼠肺脏和鼻甲骨中复制,病毒滴度可达104.5EID50/mL。病理学观察发现感染小鼠肺泡壁增厚,有大量炎性细胞浸润,纤维蛋白渗出并伴有轻微出血;在A/H6N1和A/H1N1混合感染豚鼠的重配实验中,经过三轮噬斑纯化从豚鼠鼻洗液中分离到6株重配病毒,说明A/H6N1亚型禽流感病毒与A/H1N1亚型流感病毒具有很好的遗传兼容性,能在豚鼠体内能发生重配。结论野鸭源A/H6N1亚型流感病毒无需适应就能够感染哺乳动物;该病毒与A/H1N1流感病毒具有很好的遗传兼容性,在哺乳动物体内能够发生基因重配,产生新的重配病毒,其公共卫生意义应引起高度关注。

H6N1亚型禽流感病毒二重荧光RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中H6、N1亚型禽流感病毒(AIV)的HA、NA基因序列,设计2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针。经反应条件优化,本试验建立了检测H6N1亚型AIV的二重荧光RT-PCR方法。该法特异性强,只对H6亚型和N1亚型AIV进行特异性扩增,对其他H亚型AIV、N亚型AIV及新城疫病毒、传染性支气管炎病毒等病原体的检测均为阴性;该法敏感性好,对H6N1亚型AIV的检测限为100拷贝/μL。本试验建立的H6N1亚型AIV的二重荧光RT-PCR方法,具有快速、敏感、特异的优点,为H6N1亚型AIV的防控提供技术支撑。

鸭源性H6N1亚型禽流感病毒在猪和人呼吸道的复制及其基因特点

目的:探索鸭源性H6N1亚型禽流感病毒是否可在人以及流感病毒的重要中间宿主猪中有效复制、感染。方法:选择前期分离的2株鸭源性H6N1病毒DK/Jiangxi/35634/2016、DK/Guiyang/2462/2007,受体结合特异性法分析病毒的受体结合特性,全基因组测序分析病毒基因位点的变化,体外感染人和猪呼吸道组织。结果:2株鸭源性H6N1病毒均与禽型SAα-2,3Gal受体结合,基因测序分析显示HA裂解位点为PQIETR/GL,属低致病性禽流感病毒的分子特征,HA、NA、PB2等主要基因位点未发生突变,但病毒可在人肺组织的肺泡细胞和巨噬细胞、猪气管上皮细胞以及肺组织的肺泡细胞和巨噬细胞增殖并引起细胞损伤、组织结构的破坏。结论:鸭源性H6N1亚型禽流感病毒具有禽流感病毒的基因特点,虽然仍与禽型SAα-2,3Gal受体结合,但已具有跨种间屏障感染猪和人的能力。因此,必须密切监测家禽中流感病毒H6N1流行和进化演变。

一株鸭源H1N6亚型禽流感病毒的分离鉴定及HA和NA基因序列分析

为了解禽流感病毒(AIV)在广西中越边境地区的流行情况,本研究在该地区活禽市场开展禽流感病原监测。监测过程中分离鉴定出1株H1N6亚型禽流感病毒,命名为A/Duck/Guangxi/F01/2016(H1N6),对其HA和NA基因进行序列测定,并与GenBank中下载的相关参考序列进行比对和遗传进化分析。结果显示,分离株HA基因与A/sparrow/Guangxi/GXs-1/2012(H1N2)的核苷酸同源性最高(96.9%),NA基因与A/Pavo cristatus/Jiangxi/JA1/2016(H5N6)的核苷酸同源性最高(98.2%)。HA基因裂解位点氨基酸序列为PSIQSR↓GLF,符合低致病性禽流感病毒分子特征;与部分N6亚型禽流感病毒一样,分离株NA基因有11个氨基酸缺失。此外,本研究还对分离毒株的受体亲和性进行了测定,结果显示该病毒优先结合唾液酸α-2,3-Gal受体。本研究结果表明A/Duck/Guangxi/F01/2016(H1N6)是一株重组低致病性禽流感病毒。

H6N1亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中H6亚型禽流感病毒(AIV)的HA基因、N1亚型AIV的NA基因和所有亚型AIV的M基因序列,分别设计并筛选出3对特异性引物,优化引物之间的浓度,建立了H6N1亚型AIV三重RT-PCR检测方法。对该法进行特异性、敏感性和临床样品检测。结果显示,所建立的方法对H6N1亚型AIV可特异性扩增出447(H6亚型AIV)、325(N1亚型AIV)和669bp(AIV)目的条带,对H6亚型AIV扩增出447、669bp目的条带,对N1亚型AIV扩增出325、669bp目的条带,对其他亚型AIV仅扩增出669bp目的条带,对常见禽病病原体均未扩增出任何条带;该法对H6N1亚型AIV检测下限为0.1pg;305份临床样品检测结果与病毒分离鉴定一致。本研究所建立的H6N1亚型AIV三重RT-PCR检测方法特异性强、灵敏度高,可同时快速鉴别检测H6、N1亚型AIV和所有亚型AIV,为H6N1亚型AIV的检测提供1种简便、快速和有效的方法。

H6N1亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中H6、N1亚型禽流感病毒(AIV)HA、NA基因,分别设计并筛选出2对特异性引物,用于H6亚型AIV和N1亚型AIV的检测,优化反应条件,建立了H6N1亚型AIV的二重RT-PCR检测方法。对该法进行特异性、敏感性检验,并用该法对临床样品进行检测。所建立的方法对H6N1亚型AIV可特异性扩增出447 bp(H6亚型)和325 bp(N1亚型)目的条带,对H6Ny亚型AIV仅扩增出447 bp目的条带,对HXN1亚型AIV仅扩增出325 bp目的条带,对常见禽病病原体均未扩增出任何条带;该法对H6N1亚型AIV检测下限为5×102拷贝/μL;341份临床样品检测结果与病毒分离鉴定一致。本研究所建立的H6N1亚型AIV RT-PCR特异性强、灵敏度高,一管可同时检测H6和N1亚型AIV,为H6N1亚型AIV的检测提供一种简便、快速和有效的检测方法。

H6N1亚型禽流感病毒GeXP检测方法的建立

根据基因库中H6亚型禽流感病毒（AIV） HA基因、N1亚型AIV NA基因和所有亚型AIV M基因序列,分别设计筛选出3对特异性引物,优化反应条件,建立了H6N1亚型AIV GeXP检测方法。该法对H6亚型AIV的检测出现194 bp （H6）、164 bp （AIV通用检测） 2个目的峰,对N1亚型AIV的检测出现249 bp （N1）、164 bp 2个目的峰,对H6N1亚型AIV的检测出现194 bp、249 bp和164 bp 3个目的峰,对其他亚型AIV的检测只出现164 bp通用检测目的峰,对常见禽病病原体均未出现任何检测峰;该法对H6亚型和N1亚型AIV检测下限为102拷贝/μL。本研究建立的H6亚型和N1亚型AIV高通量GeXP检测方法特异性强、灵敏度高,可同时快速鉴别检测H6亚型、N1亚型和所有亚型AIV,为H6N1亚型AIV的检测提供了一种简便、快速和有效的方法。

AA肉仔鸡禽流感H5N1亚型Re-6株母源抗体跟踪监测报告

笔者跟踪监测了肉仔鸡母源抗体。结果表明,在2 d时母源抗体水平较高,集中在6log2~9log2,平均抗体滴度为7.10,抗体阳性率为100%;在8d时母源抗体水平集中在4log2~7log2,平均抗体滴度为5.70,抗体阳性率为100%;在17d时母源抗体水平主要集中在2log2~5log2,平均抗体滴度为3.19,抗体阳性率为42.31%;在24 d^37 d的3次检测结果,母源抗体水平均为≤2log2,平均抗体滴度分别为0.47、0.13和0,抗体阳性率均为0%;跟踪检测抗体的下降具有明显的线性关系。通过监测数据分析,该场雏鸡14日龄左右是最佳的AIV H5N1 Re-6免疫日龄。

H6亚型流感病毒在小鼠肺内的适应性传代研究

目的为了进一步探讨H6亚型禽流感病毒(AIV)对哺乳动物的感染与致病能力,建立H6亚型AIV哺乳动物感染模型。方法用H6N1亚型AIV感染BALB/c小鼠,并在小鼠肺组织中连续传代,测定病毒的EID50。观察感染鼠临床症状和体征,评价病毒的致病性。结果经8～9代的适应后,该病毒即对小鼠产生明显的致病性,小鼠表现出精神萎靡、食欲减退、竖毛、弓背等临床症状。测定鼠肺适应株病毒H6N1-P8-M1、H6N1-P9-M2、H6N1-P8-M3的EID50分别为108.5、106.75和108.25/ml,三毒株感染鼠在发作期全部死亡。H6N1-P0组小鼠感染后14d仍全部存活。结论 H6N1亚型AIV与其他亚型相似,同样具有经适应后对哺乳动物呈现高致病性的能力,提示应关注H6亚型AIV对人类的潜在风险,得到的毒力增强鼠肺适应株为H6N1流感病毒疫苗和药物研究以及致病分子机制研究提供了动物模型。