N-乙酰半胱氨酸对H9N2猪流感病毒所致急性肺损伤小鼠的保护作用

目的:探讨N-乙酰半胱氨酸(NAC)对H9N2猪流感病毒所致急性肺损伤小鼠的保护作用。方法:采用BALB/c小鼠建立H9N2猪流感病毒诱导的急性肺损伤模型。实验小鼠在接种病毒前1 h腹腔注射NAC(10mg/kg,稀释于生理盐水),此后连续使用5 d。检测肺湿重与干重比变化,评估肺水肿情况,观察肺组织的病理学变化,检测支气管肺泡灌洗液内炎症细胞、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)及白细胞介素1β(IL-1β)的变化,同时检测肺组织匀浆中病毒的增殖、总超氧化物歧化酶(T-SOD)和髓过氧化物酶(MPO)活性以及丙二醛(MDA)含量。结果:NAC能降低小鼠死亡率,延长小鼠存活时间,显著降低肺组织的病理学变化和肺水肿程度,并能降低巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞等炎症细胞的数量,同时降低TNF-α、IL-6、IL-1β和MDA的含量,抑制MPO的活性以及升高T-SOD的活性。结论:NAC减轻H9N2猪流感病毒诱导的小鼠急性肺损伤,其保护作用可能与减轻氧化应激作用和炎症反应相关。

表没食子儿茶素没食子酸酯对H9N2猪流感病毒诱导小鼠肺损伤中Toll样受体-4表达的影响

旨在探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对猪源H9N2流感病毒感染诱导小鼠肺损伤及氧化应激相关信号通路Toll样受体(TLR)-4表达的影响。将6~8周龄、雌性SPF级BALB/c小鼠随机分为病毒感染致急性肺损伤(H9N2)组、H9N2+EGCG组、模拟感染(Mock)组、Mock+EGCG以及TLR-4抑制剂Eritoran5564(H9N2+E5564)对照组,观察各组小鼠肺组织病理学变化,测定肺湿/干重比;测定肺组织内MPO、T-SOD、抗HO·能力、MDA、IL-1β和TNF-α的含量;Western blot和RT-PCR方法检测肺内TLR-4 mRNA及蛋白质的表达。结果表明,H9N2组小鼠精神沉郁、呼吸困难、体重下降明显;肺组织学表现为肺泡壁水肿、炎性细胞浸润、出血为特征的弥漫性肺组织损伤。EGCG干预后,与H9N2组相比,EGCG治疗组小鼠临床症状较轻,一定程度上降低了死亡率,并明显延长小鼠存活时间(P<0.01);其肺组织损伤程度较轻,肺湿/干重比极显著下降(P<0.01);MPO和MDA的含量显著降低,与之相反T-SOD及抗HO·能力升高;同时,EGCG显著降低肺组织内IL-1β和TNF-α的含量。肺组织内TLR-4mRNA以及蛋白表达显著降低;E5564呈现与EGCG相似的干预效果,显著降低TLR-4mRNA以及蛋白表达,降低肺组织MPO、MDA、IL-1β和TNF-α的含量,减少T-SOD的消耗以及提高抗HO·能力。EGCG明显缓解小鼠肺损伤过程,其机制可能与其影响活性氧自由基的产生或清除进而显著降低TLR-4的表达有关,提示其在辅助预防和干预H9N2-SIV诱导的肺损伤方面具有潜在的应用前景。

TRPM2在H9N2猪流感病毒感染小鼠PMVEC损伤中的表达与作用

目的:探讨瞬时受体电位阳离子通道M2(TRPM2)在H9N2猪流感病毒(H9N2-SIV)感染小鼠肺微血管内皮细胞(PMVEC)损伤中的表达与作用。方法:采用H9N2-SIV感染小鼠PMVEC (每组设立3个重复),在病毒感染后24 h和48 h进行采样,根据试剂盒方法测定超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、活性氧簇(ROS)和一氧化氮合成酶(NOS)的变化;电镜观察PMVEC超微结构变化;利用Transwell培养PMVEC单层细胞,测定跨膜电阻及辣根过氧化物酶渗出率;real-time PCR和Western blot方法检测TRPM2 mRNA与蛋白的表达;采用Annexin V/PI双染法观察病毒感染细胞的凋亡情况。结果:H9N2-SIV感染后小鼠PMVEC中GSH-Px和SOD活性显著下降,而ROS水平和NOS活性显著高于未感染对照组(P<0.01);病毒感染细胞细胞器明显减少,出现空泡化结构,线粒体基质减少,细胞发生凋亡;病毒感染后跨膜电阻值明显降低,辣根过氧化物酶渗出率则显著增加;TRPM2 mRNA和蛋白表达随病毒感染时间增加显著升高(P<0.01);Annexin V/PI双染法显示病毒感染细胞的胞膜荧光显著增强,同时大量细胞的胞核显现红色,表明大量细胞发生凋亡现象。结论:TRPM2在H9N2-SIV感染PMEVC过程中表达明显增强,提示其参与了H9N2-SIV感染导致的PMVEC损伤和凋亡过程。

H9N2亚型猪流感病毒诱导小鼠急性肺损伤中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的变化和作用

目的探讨H9N2亚型猪流感病毒诱导小鼠急性肺损伤过程中炎症因子的变化和作用。方法通过滴鼻的方法将H9N2亚型猪流感病毒感染BALB/c小鼠,于感染后2、4、6、10、14 d取小鼠肺组织匀浆,分别测定肺组织匀浆中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的浓度。结果实验组肺组织匀浆中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10在不同时间点浓度均显著高于正常对照组(P<0.05),TNF-α和IL-1β于14 d后趋于正常,而IL-6和IL-10增高持续至14d后。结论 H9N2猪流感病毒诱导小鼠急性肺损伤过程中炎症因子发挥重大作用,TNF-α和IL-1β起致炎作用,IL-6可能和IL-10一样,发挥抗炎作用。

肌肽对H9N2亚型猪流感病毒致小鼠肺部组织SOD、MDA、iNOS和NO的影响

探讨肌肽（carnosine）对H9N2亚型猪流感病毒（H9N2-SIV）致小鼠肺部损伤时肺组织的超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和一氧化氮（NO）的影响。选用6~8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠150只,随机分为对照组、模型组和肌肽组,每组50只,分别给予正常鸡胚尿囊液、H9N2-SIV和肌肽＋H9N2-SIV。试验第2、4、6、8和14天分别观察小鼠的临床表现,统计死亡率,每个观测时间每组处死8只小鼠,检测肺组织匀浆中SOD、MDA、iNOS和NO。肌肽可减轻H9N2-SIV造成的小鼠临床症状,降低死亡率,在试验第6、8天显著提高肺组织的SOD活性（P〈0.05）,显著降低MDA含量、iNOS活性和NO含量（P〈0.05）。肌肽通过提高肺部SOD活性,降低iNOS活性、MDA含量和NO含量,抑制由H9N2-SIV造成的自由基和脂质过氧化反应,改善肺组织的水肿程度,减轻小鼠肺损伤的程度、降低死亡率。

H9N2亚型猪流感病毒感染BALB/c小鼠动物模型的建立

目的建立H9N2亚型猪流感病毒感染BALB/c小鼠动物模型,为研究病毒致病机制提供模型动物。方法通过滴鼻的方法将H9N2亚型猪流感病毒感染BALB/c小鼠,观察小鼠的症状和组织病理变化。结果 BALB/c小鼠的临床症状明显,病理变化典型。结论 H9N2亚型猪流感病毒感染BALB/c小鼠的疾病模型成功建立。

肌肽对H9N2亚型猪流感病毒诱导的小鼠急性肺损伤的抗氧化效果

目的：探讨肌肽（carnosine）对H9N2亚型猪流感病毒（H9N2-SIV）诱导的急性肺损伤（ALI）肺组织抗氧化的效果.方法：选用6～8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠150只,随机分为对照组、模型组和肌肽干预组,每组50只,分别给予正常鸡胚尿囊液、H9N2-SIV和肌肽＋H9N2-SIV.实验第2、4、6、8和14天,每组分别处死8只小鼠,观察肺组织的病理变化,测定肺组织匀浆中丙二醛（MDA）的含量、超氧化物歧化酶（SOD）和髓过氧化物酶（MPO）的活性及肺湿/干重比值（W/D）.结果：肌肽可减轻H9N2-SIV造成的小鼠临床症状,降低死亡率.肌肽干预于第6、8天明显改善了肺组织的水肿程度（W/D降低,P＜0.05）并减轻了肺部的病理变化;实验至第6、8天可见肺组织MDA含量显著降低（P＜0.05）,SOD活性显著提高（P＜0.05）;于实验第4、第6和第8天可见肺组织MPO活性显著降低（P＜0.05,P＜0.01）.结论：肌肽可改善H9N2-SIV感染后肺组织的水肿程度,降低肺组织MDA含量和MPO活性,提高SOD活性,抑制自由基和脂质过氧化反应,从而减轻小鼠肺损伤的程度,降低死亡率.

山柰酚通过下调NF-κB信号通路减轻猪源甲型H9N2流感病毒所致小鼠急性肺损伤

目的:探讨山柰酚是否通过下调转录因子NF-κB信号通路的表达而保护感染猪源甲型H9N2流感病毒引起急性肺损伤的小鼠。方法:猪源甲型H9N2流感病毒感染BALB/c小鼠建立急性肺损伤模型,山柰酚干预后检测肺湿重与干重比,观察肺组织的病理学变化,检测支气管肺泡灌洗液内炎性细胞数量以及肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)和白细胞介素1β(IL-1β)含量同时检测肺组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)和髓过氧化物酶(MPO)活性以及丙二醛(MDA)含量,Western blot检测小鼠肺内NF-κB P65的表达,ELISA检测小鼠肺组织匀浆细胞核提取物中NF-κB P65和NF-κB P50的核转位。结果:山柰酚能降低小鼠死亡率,改善肺组织的病理学变化和肺水肿程度,并能降低肺内巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞等炎性细胞的数量同时降低TNF-α、IL-6、IL-1β和MDA的含量,抑制MPO的活性并升高SOD的活性。另外,山柰酚可以下调NF-κB P65的表达增加细胞核提取物中NF-κB P65和NF-κB P50的核转位。结论:山柰酚通过下调NF-κB信号通路的表达从而降低猪源甲型H9N2流感病毒所致急性肺损伤小鼠的炎症程度和氧化应激损伤,最终减轻流感病毒所致的急性肺损伤。

肌肽对H9N2亚型猪流感病毒致小鼠肺病理损伤的影响

探讨肌肽（carnosine）对人工感染H9N2亚型猪流感病毒（H9N2-SIV）小鼠肺部组织病理损伤变化的影响。选用6-8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠150只,随机分为对照组、感染组和肌肽干预组,每组50只,分别鼻腔接种正常鸡胚尿囊液、含H9N2-SIV的鸡胚尿囊液和肌肽＋含H9N2-SIV的鸡胚尿囊液。试验第2、4、6、8和14天,每组分别处死8只小鼠,观察肺组织的病理变化、测定肺系数及肺湿/干质量比。结果显示,肌肽可减轻H9N2-SIV造成的小鼠临床症状,降低死亡率;肌肽干预组在试验第6天和第8天明显降低肺组织肺湿/干质量比（P〈0.05）;在试验第4、6、8天明显降低肺系数值（P〈0.05）,并减轻肺部淤血、出血、水肿、炎性细胞浸润等肺部病理变化。可见：肌肽可降低肺组织肺湿/干质量比及肺系数值并减轻肺部病理变化,从而减轻小鼠肺部损伤的程度、降低死亡率。

p38MAPK信号通路在猪源H9N2流感病毒导致小鼠肺损伤中作用的研究

探讨p38MAPK信号通路在猪源H9N2流感病毒诱导小鼠肺损伤过程中的作用。将BALB/c小鼠随机分为病毒感染组(H9N2组)、模拟感染组(NS组)和H9N2+p38MAPK抑制剂组(H9N2+SB203580)。Western blot方法检测肺组织p38MAPK表达,观察各组小鼠肺组织病理学变化、测定肺湿/干重比,衡量肺损伤情况;同时进行支气管肺泡灌洗液(BALF)内细胞计数和肿瘤坏死因子α(TNF-α)及白细胞介素-1β(IL-1β)的测定。结果如下:Western blot结果显示感染组小鼠肺组织内p38MAPK表达显著高于H9N2+SB203580抑制剂组(P<0.01);感染组小鼠精神沉郁、呼吸困难、体重下降;肺组织学表现为肺泡间质水肿、炎性细胞渗出、出血为特征的弥漫性肺泡损伤。与感染组相比,p38MAPK抑制剂组症状较轻,一定程度上降低了死亡率,并明显延长小鼠存活时间(P<0.01);同时,小鼠BALF内炎性细胞渗出减少,TNF-α和IL-1β的含量(P<0.05)以及肺湿/干重较感染组显著下降(P<0.01)。本研究证实p38MAPK信号通路参与H9N2流感病毒诱导小鼠肺损伤过程,其抑制剂SB203580能够有效减少p38MAPK表达,进而减少TNF-α和IL-1β产生以及炎性细胞渗出,缓解肺损伤的严重程度,延长小鼠存活时间和降低死亡率,提示p38MAPK信号通路抑制剂SB203580在今后作为辅助预防和干预H9N2-SIV诱导肺损伤具有一定的应用前景。

p38MAPK在H9N2亚型猪流感病毒诱导小鼠急性肺损伤中的表达

为研究p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)在H9N2亚型猪流感病毒(H9N2-SIV)诱导小鼠急性肺损伤(ALI)中的表达,将180只7周龄SPF级BALB/c雌性小鼠,随机平均分成H9N2-SIV感染组(感染组)、H9N2-SIV感染+p38MAPK特异性抑制剂SB203580组(SB组)和对照组,在感染后的第2、4、6、8和14天,分别进行临床观察、肺病理组织学观察、肺中磷酸化p38MAPK分布和表达的测定。结果显示:与对照组比较,感染组和SB组小鼠均表现明显的临床症状,感染组小鼠肺磷酸化p38MAPK蛋白表达在感染后第2天即明显增强,至第6天蛋白表达达高峰,差异极其显著(P<0.01),SB203580可抑制肺组织中p38MAPK的磷酸化,SB组小鼠肺损伤程度小于感染组,表明p38MAPK能够被H9N2-SIV激活并参与ALI的发生和发展过程,p38MAPK特异性抑制剂SB203580能够减轻ALI中肺组织的病理损伤。

两株H9N2亚型猪流感病毒全基因进化分析

用RT-PCR方法扩增了H9N2亚型猪流感病毒河南株(Swine/Henan/Y1/09)和H9N2亚型猪流感病毒上海株(Swine/Shanghai/Y1/09)的8个基因片段,进行测序分析。结果表明,这两株猪流感病毒HA基因长度均为1701 bp,编码566个氨基酸,HA切割位点序列均为R-S-S-R-G,属非高致病性毒株;这两个毒株的HA蛋白均有8个潜在的糖基化位点。两个分离株的NA基因长度为1401 bp,编码467个氨基酸,这两个毒株均在茎区63、64、65位发生氨基酸缺失。两株猪流感病毒HA基因的同源性为96.6%,NA基因的同源性为98.6%。两株毒株的8个基因片段系统发生树分析表明它们均为重组体,与2008年上海地区健康鸡群中分离的H9N2亚型毒株(Ck/Shanghai/Y1/2008)8个基因片段均分别属于同一个基因群。

H9N2亚型猪流感病毒的增殖及毒力测定

目的将H9N2亚型猪流感病毒(H9N2-SIV)进行增殖并测定其毒力。方法采用鸡胚尿囊腔增殖法,将病毒接种于10日龄SPF鸡胚进行增殖,血凝(HA)试验测定病毒液效价,Reed-Muench法测定病毒的鸡胚半数感染量(EID50)和小鼠半数致死量(MLD50)。结果经过增殖后,H9N2-SIV血凝效价为1∶256,EID50=10-6.5·0.1mL-1,MLD50=10-2.32·0.l mL-1。结论 H9N2-SIV可以作为进一步试验用病毒。

H9N2亚型猪流感病毒诱导小鼠肺急性损伤模型的研究

本试验采用100μLA/swine/HeBei/012/2008/(H9N2)猪流感病毒(H9N2SIV)经鼻腔接种6～8周龄的BALB/c小鼠,通过定时称量小鼠的采食量和体质量、观察肺病理组织学变化以及测量肺系数、肺湿质量/干质量、动脉血气和支气管肺泡灌洗液内炎性细胞等拟建立H9N2SIV感染诱导小鼠急性肺损伤模型。结果显示:(1)感染后第2天试验组小鼠出现精神沉郁、被毛松乱、采食量和体质量下降。感染后的第3天开始感染小鼠采食量和体质量显著下降(P<0.01);(2)试验组小鼠在感染后的第3天末出现死亡,死亡率约为62.5%,剖检可见肺部明显水肿、出血,肺泡内有大量的炎性细胞渗出;肺系数和湿质量/干质量比显著增加(P<0.01);(3)与对照组相比感染组小鼠动脉血中氧分压从第2天开始降低,第4天出现明显的差异(P<0.01),第6天最低时仅为(6.79±1.27)kPa,呈现严重的低氧血症,同时,二氧化碳分压显著上升;(4)支气管灌洗液(BALF)内炎性细胞在感染后第4-8天增加显著,尤其以肺泡巨噬细胞和多核型白细胞增加最为明显(P<0.01)。本研究证实采用A/swine/HeBei/012/2008/(H9N2)病毒感染小鼠引起肺组织弥漫性急性渗出性炎症为主的病理过程和严重的低氧血症,表明成功建立了H9N2SIV诱导小鼠的肺损伤模型,为进一步研究其对哺乳动物肺损伤的致病机理奠定基础。

SB203580对猪流感病毒诱导小鼠急性肺损伤中炎症因子的影响

为探讨SB203580对猪流感病毒（SIV）诱导小鼠急性肺损伤（ALI）中炎症因子的影响,将180只6~8周龄SPF级BALB/c雌性小鼠,随机平均分成SIV感染组（感染组）、SIV感染＋SB203580组（SB组）和对照组,于感染后2、4、6、8和14d,分别进行临床症状、肺脏病理组织学观察和肺组织中炎症因子测定。结果显示,感染组和SB组小鼠均表现明显的ALI症状,但SB组小鼠症状较轻,肺损伤程度明显低于感染组;感染组和SB组中炎症因子水平均高于对照组,SB组小鼠肺脏炎症因子水平较感染组降低。说明p38MAPK特异性抑制剂SB203580可以下调磷酸化p38MAPK的表达水平,降低炎症因子的表达,减轻ALI中肺组织的病理损伤。