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氟康唑对豚鼠心室肌细胞I_K和在HEK-293细胞中表达的HERG钾通道的抑制作用 被引量:4
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作者 韩圣娜 陈秋 +4 位作者 张雨 角灿武 毛讯 付润芳 张莉蓉 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第7期861-866,共6页
目的研究氟康唑对豚鼠心室肌细胞延迟整流钾电流(IK)和在HEK-293细胞中表达的HERG钾通道的抑制作用。方法应用酶解法消化豚鼠单个心室肌细胞,观察氟康唑对IK的影响;采用磷酸钙沉淀瞬时转染的方法将HERG基因表达于HEK-293细胞上,观察氟... 目的研究氟康唑对豚鼠心室肌细胞延迟整流钾电流(IK)和在HEK-293细胞中表达的HERG钾通道的抑制作用。方法应用酶解法消化豚鼠单个心室肌细胞,观察氟康唑对IK的影响;采用磷酸钙沉淀瞬时转染的方法将HERG基因表达于HEK-293细胞上,观察氟康唑对野生型HERG钾通道电流、激活和失活曲线的影响,以及氟康唑对Y652A和F656C突变型HERG钾通道的作用;IK和HERG电流的记录均采用全细胞膜片钳技术。结果氟康唑(0.01、0.1、1、3、10、30、100、300和1 000μmol.L-1)浓度依赖性地抑制IK和HERG钾电流,其IC50值分别为(68.1±21.6)μmol.L-1和(48.2±9.4)μmol.L-1,对HERG钾通道的电压依赖性激活和失活曲线无影响;与野生型(WT)比较,Y652A和F656C突变型可减弱氟康唑对HERG通道的阻断作用。结论氟康唑能阻断IK和HERG通道,Y652和F656是氟康唑与HERG通道结合的关键位点。 展开更多
关键词 氟康唑 延迟整流钾电流 HERG钾通道 膜片钳技术 hek-293细胞 心室肌细胞
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凋亡相关蛋白在汉坦病毒诱导HEK-293细胞凋亡过程中的表达及意义 被引量:1
2
作者 高巍 王晓燕 +1 位作者 刘伟 康鹏 《哈尔滨医科大学学报》 CAS 北大核心 2012年第2期111-114,共4页
目的探讨Bcl-2、Bax及Caspase-3在汉坦病毒诱导人胚肾细胞(HEK-293)凋亡过程中的变化,为研究汉坦病毒诱导人胚肾细胞损伤的机制提供参考。方法体外培养HEK-293细胞,分为正常对照组和汉坦病毒处理的感染组,采用间接免疫荧光法检测HEK-29... 目的探讨Bcl-2、Bax及Caspase-3在汉坦病毒诱导人胚肾细胞(HEK-293)凋亡过程中的变化,为研究汉坦病毒诱导人胚肾细胞损伤的机制提供参考。方法体外培养HEK-293细胞,分为正常对照组和汉坦病毒处理的感染组,采用间接免疫荧光法检测HEK-293内汉坦病毒抗原;用Westen blot方法检测Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白表达水平。结果汉坦病毒感染HEK-293细胞1 d后即开始出现荧光阳性细胞,随着时间延长,荧光强度逐渐增强,细胞胞浆内出现大量片状或颗粒性的黄绿色荧光;Western blot结果显示,与对照组比较,汉坦病毒感染1 d后Bcl-2、Bax蛋白及Caspase-3酶原活化片段表达量未见明显变化(P>0.05),感染3 d和5 d后Bcl-2蛋白表达降低,Bax蛋白表达上调,Caspase-3酶原活化片段表达升高(P<0.05)。结论汉坦病毒可感染HEK-293细胞并在其体内增殖,其损伤机制可能与Bcl-2表达减少和Bax蛋白表达上调,通过线粒体途径诱导HEK-293细胞发生凋亡有关。 展开更多
关键词 汉坦病毒 hek-293细胞 细胞凋亡 Bcl-2 BAX CASPASE-3
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HEK-293细胞α_(1B)-肾上腺素受体引起的Ca^(2+)依赖性K^+电流和Ca^(2+)内流(英文) 被引量:1
3
作者 关永源 陶亮 +3 位作者 贺华 韩启德 张幼怡 孙家钧 《中山医科大学学报》 CSCD 1999年第4期248-251,共4页
目的:研究HEK293细胞上α1B肾上腺素受体亚型引起向外K+电流和Ca2+内流的特性。方法:细胞贴附式单通道记录K+通道和Fura2荧光测定胞浆游离Ca2+浓度。结果:肾上腺素或苯肾上腺素可引发一电导为160pS的外向K+电流。该电流可被50μmol·... 目的:研究HEK293细胞上α1B肾上腺素受体亚型引起向外K+电流和Ca2+内流的特性。方法:细胞贴附式单通道记录K+通道和Fura2荧光测定胞浆游离Ca2+浓度。结果:肾上腺素或苯肾上腺素可引发一电导为160pS的外向K+电流。该电流可被50μmol·L-1氯乙醛可乐定(CEC),5mmol·L-1依他酸(EGTA)或2mmol·L-1四乙铵(TEA)抑制。硝苯吡啶(nifedipine)不改变该电流及α1B亚型引起的Ca2+内流;后者可被1mmol·L-1LaCl3抑制。结论:激活转染在HEK293细胞上的α1B受体亚型可引起通过硝苯吡啶不敏感Ca2+通道的Ca2+内流。 展开更多
关键词 钙通道 钾通道 受体 肾上腺素能Α1 hek-293细胞
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DNA聚合酶iota在HEK-293细胞中高表达体系的建立
4
作者 周虎传 杨劲 +6 位作者 曾益军 位全芳 何凤田 赵谦 李劲 刘洋 李杰 《现代生物医学进展》 CAS 2008年第7期1267-1269,共3页
目的:将带有DNA聚合酶iota(DNA Polymerase iota,Polt)目的基因的真核表达质粒PCDNA3.1转入HEK-293细胞,建立DNA聚合酶iota在HEK-293细胞中的高表达体系,为进一步研究DNA聚合酶在DNA损伤修复中的生物学功能奠定了基础。方法:用脂质体200... 目的:将带有DNA聚合酶iota(DNA Polymerase iota,Polt)目的基因的真核表达质粒PCDNA3.1转入HEK-293细胞,建立DNA聚合酶iota在HEK-293细胞中的高表达体系,为进一步研究DNA聚合酶在DNA损伤修复中的生物学功能奠定了基础。方法:用脂质体2000(Lipofectamine2000)将带有目的基因的真核表达质粒PCDNA3.1转入HEK-293细胞,通过G418筛选抗性克隆,用一步法提取细胞总RNA,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术检测出高表达克隆。结果:通过G418筛选筛选出了具有G418抗性的克隆,通过RT-PCR技术检测出高表达DNA聚合酶iota的HEK-293细胞系。结论:建立了高表达DNA聚合酶iota的HEK-293细胞系,为进一步研究DNA聚合酶在DNA损伤修复中的生物学功能奠定了基础。 展开更多
关键词 DNA聚合酶iota hek-293细胞 DNA损伤 DNA修复
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依托咪酯对HEK-293细胞中异源表达的hERG钾通道电流的抑制作用
5
作者 韩圣娜 刘备 +4 位作者 孔岚 李靓 冯馨 张卫 张莉蓉 《郑州大学学报(医学版)》 CAS 北大核心 2016年第2期204-208,共5页
目的:观察依托咪酯对HEK-293细胞中异源表达的hERG钾通道电流的抑制作用及其机制。方法:采用脂质体瞬时转染的方法将野生型hERG(WT-hERG)、突变型Y652A-hERG和F656C-hERG分别转染人胚胎肾细胞HEK-293,应用全细胞膜片钳技术记录依托咪酯... 目的:观察依托咪酯对HEK-293细胞中异源表达的hERG钾通道电流的抑制作用及其机制。方法:采用脂质体瞬时转染的方法将野生型hERG(WT-hERG)、突变型Y652A-hERG和F656C-hERG分别转染人胚胎肾细胞HEK-293,应用全细胞膜片钳技术记录依托咪酯对转染后HEK-293细胞表达的hERG钾通道电流的抑制作用以及对激活曲线和失活曲线的影响。结果:依托咪酯可浓度依赖性地抑制WT-hERG转染的HEK-293细胞钾通道电流,其半数最大抑制浓度为(6.41±2.43)μmol/L,对激活曲线和失活曲线无明显影响。与WT-hERG转染的HEK-293细胞相比,依托咪酯对突变体Y652A-hERG及F656C-hERG转染的HEK-293细胞内钾通道电流的抑制作用减弱。结论:F656C可能是依托咪酯抑制hERG钾通道的重要靶点。 展开更多
关键词 依托咪酯 HERG钾通道 全细胞膜片钳 hek-293细胞
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人TRBP基因在HEK-293细胞中的表达
6
作者 李俊堂 王立锋 +2 位作者 王芳 许彦鸣 杨安钢 《第四军医大学学报》 北大核心 2009年第21期2263-2265,共3页
目的:构建携带人TRBP(TAR RNA结合蛋白)基因的真核表达载体,并将其在HEK-293细胞中表达.方法:用RT-PCR的方法扩增获得TRBP全长cDNA,然后克隆入pFLAG-CMV4真核表达载体.脂质体法瞬时转染HEK-293细胞,间接免疫荧光和Western Blot检测目的... 目的:构建携带人TRBP(TAR RNA结合蛋白)基因的真核表达载体,并将其在HEK-293细胞中表达.方法:用RT-PCR的方法扩增获得TRBP全长cDNA,然后克隆入pFLAG-CMV4真核表达载体.脂质体法瞬时转染HEK-293细胞,间接免疫荧光和Western Blot检测目的蛋白表达.结果:成功获得了全长的TRBP cDNA,构建了含人的TRBP cDNA的真核表达载体.转染HEK-293细胞后提取蛋白,经电泳观察到在Mr46000存在与目的蛋白分子质量相符的条带,该条带可被抗TRBP多克隆抗体及抗FLAGmAb特异性识别.结论:TRBP哺乳动物表达系统的建立,为进一步研究TRBP的生物学效应奠定了基础. 展开更多
关键词 TAR RNA结合蛋白 pFLAG-CMV4 基因表达 hek-293细胞
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菌多糖对Balb/c 3T_3、Hela、HEK-293细胞增殖的影响
7
作者 刘士德 丘劲 +1 位作者 张建华 邢苗 《深圳大学学报(理工版)》 EI CAS 2003年第3期58-63,共6页
用苯酚法提取JM109大肠杆菌、O157大肠杆菌、霍乱弧菌、伤寒杆菌及多头绒泡菌的菌多糖,用MTT法检测菌多糖在体外对Balb/c 3T_3(鼠成纤维细胞)、Hela(人上皮细胞)和HEK-293(人胚肾细胞)增殖的影响.结果表明,菌多糖在低质量浓度(低于40mg... 用苯酚法提取JM109大肠杆菌、O157大肠杆菌、霍乱弧菌、伤寒杆菌及多头绒泡菌的菌多糖,用MTT法检测菌多糖在体外对Balb/c 3T_3(鼠成纤维细胞)、Hela(人上皮细胞)和HEK-293(人胚肾细胞)增殖的影响.结果表明,菌多糖在低质量浓度(低于40mg/L)时抑制Hela细胞和HEK-293细胞的增殖,但促进Balb/c 3T_3细胞的增殖;菌多糖超过一定质量浓度(80mg/L)时,对Balb/c 3T_3细胞的增殖作用和对Hela、HEK-293细胞增殖的抑制作用趋于饱和. 展开更多
关键词 菌多糖 MTF 细胞增殖 移植性肿瘤 鼠成纤维细胞 Balb/c3T3 HELA 人上皮细胞 hek-293 人胚肾细胞
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GATA5抑制EpCAM表达对肾癌HEK-293细胞系的影响
8
作者 刘诚 石嵩 +1 位作者 陈文 关建民 《山东第一医科大学(山东省医学科学院)学报》 2021年第8期579-583,共5页
目的研究GATA5对肾癌HEK-293细胞系增殖调控及对细胞重编程因子EpCAM表达的影响。方法构建pTT5-GATA5表达载体并进行基因序列测序验证;四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖率;细胞划痕实验检测细胞划痕修复情况;实时定量反转录-聚合酶链... 目的研究GATA5对肾癌HEK-293细胞系增殖调控及对细胞重编程因子EpCAM表达的影响。方法构建pTT5-GATA5表达载体并进行基因序列测序验证;四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖率;细胞划痕实验检测细胞划痕修复情况;实时定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测基因mRNA表达;蛋白免疫印迹(Western Blot)检测蛋白表达。结果GATA5抑制HEK-293细胞增殖;GATA5抑制HEK-293细胞划痕修复;GATA5抑制EpCAM的mRNA和蛋白表达。结论GATA5可以抑制肾癌细胞HEK-293细胞的增殖率并抑制EpCAM表达。 展开更多
关键词 GATA5 EPCAM hek-293细胞 肾癌
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悬浮培养HEK-293 N3S细胞生产重组腺病毒Ad-GFP的实验研究 被引量:5
9
作者 田博 吴彬 +5 位作者 张群伟 毕建进 王澜 朱宝珍 耿越 吴祖泽 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第5期915-918,共4页
利用5L生物反应器悬浮培养HEK-293N3S细胞生产携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒(recombinant adenovirus-greenfluorescent protein,Ad-GFP),为规模化生产腺病毒基因药物建立一种稳定可行的生产工艺。复苏的种子细胞进行逐级放大最... 利用5L生物反应器悬浮培养HEK-293N3S细胞生产携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒(recombinant adenovirus-greenfluorescent protein,Ad-GFP),为规模化生产腺病毒基因药物建立一种稳定可行的生产工艺。复苏的种子细胞进行逐级放大最后接入5L搅拌式生物反应器中,采用含5%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培基灌流培养293N3S细胞,当细胞密度达到(2-4)×10^6个/mL时感染Ad-GFP,48h后收获细胞,经两步氯化铯超速离心获得纯化的Ad-GFP。采用紫外分光光度计比色法和高压液相色谱法(HPLC)测定病毒颗粒数和纯度,采用组织培养半数感染剂量(TCID50)法检测腺病毒的感染滴度。连续培养10-12d,细胞密度可达到(2-4)×106个/mL左右,纯化的Ad-GFP感染滴度和颗粒数分别为1.0×10^11IU/mL和1.68×10^12VP/mL,比活性为6.0%,A260/A280比值为1.33,产品纯度达到99.2%。建立了5L生物反应器悬浮培养293N3S细胞生产重组腺病毒Ad-GFP的生产工艺,对携带其他基因的重组腺病毒药物生产具有一定的指导意义。 展开更多
关键词 悬浮培养 重组腺病毒 hek-293N3S细胞 生物反应器
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玉屏风水煎剂及其组分对大鼠肾脏组织及HEK-293细胞OAT1/3表达的影响 被引量:2
10
作者 闻泽强 李大朗 宋珏 《中成药》 CAS CSCD 北大核心 2020年第6期1457-1462,共6页
目的探讨玉屏风水煎剂及其组分对大鼠肾脏组织及HEK-293细胞OAT1/3表达的影响。方法采用MTT法检测玉屏风及其组分水煎剂对HEK-293细胞存活率的影响;采用Western blot法和RT-PCR法检测各组水煎剂对大鼠肾脏及HEK-293细胞中OAT1/3蛋白及m... 目的探讨玉屏风水煎剂及其组分对大鼠肾脏组织及HEK-293细胞OAT1/3表达的影响。方法采用MTT法检测玉屏风及其组分水煎剂对HEK-293细胞存活率的影响;采用Western blot法和RT-PCR法检测各组水煎剂对大鼠肾脏及HEK-293细胞中OAT1/3蛋白及mRNA表达的影响。结果玉屏风、白术、防风水煎剂下调大鼠肾脏和HEK-293细胞中OAT1蛋白及mRNA表达(P<0.05,P<0.01),玉屏风及防风水煎剂下调大鼠肾脏及HEK-293细胞中OAT3蛋白及mRNA表达(P<0.05,P<0.01),白术水煎剂上调大鼠肾脏及HEK-293细胞OAT3蛋白及mRNA表达(P<0.05,P<0.01)。黄芪水煎剂对大鼠肾脏及HEK-293细胞中OAT1/3蛋白表达无抑制作用。结论玉屏风水煎剂对OAT1/3有明显的抑制作用,玉屏风的这种抑制作用可能跟其主要成分白术、防风有关。 展开更多
关键词 玉屏风水煎剂 大鼠肾脏 hek-293 OAT1/3
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稳定表达TRPA1通道的HEK-293T细胞模型的建立 被引量:2
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作者 黄娟 明露 +3 位作者 陈艳芬 唐春萍 张玉英 杨超燕 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期440-443,共4页
目的建立稳定表达TRPA1的HEK-293T细胞模型,并鉴定模型构建是否成功。方法构建TRPA1真核表达质粒,采用脂质体转染法将其转入HEK-293T细胞中,经G418筛选稳定表达株,采用RT-PCR、免疫组化技术,检测HEK-293T细胞TRPA1基因的转录和蛋白的表... 目的建立稳定表达TRPA1的HEK-293T细胞模型,并鉴定模型构建是否成功。方法构建TRPA1真核表达质粒,采用脂质体转染法将其转入HEK-293T细胞中,经G418筛选稳定表达株,采用RT-PCR、免疫组化技术,检测HEK-293T细胞TRPA1基因的转录和蛋白的表达。结果经酶切、测序证明,TRPA1基因的真核重组表达质粒已成功构建;PCR、免疫组化检测结果表明,将此重组质粒转入HEK-293T细胞可稳定表达TRPA1基因。结论成功构建了能稳定表达TRPA1通道的HEK-293T细胞株,为体外研究TRPA1生理病理功能和筛选相关TRPA1通道调节剂奠定了基础。 展开更多
关键词 TRPA1通道 克隆 hek-293T细胞 脂质体转染 真核质粒 细胞模型
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优化阳离子脂质体介导的组织因子小干扰RNA转染HEK-293的转染条件 被引量:4
12
作者 张园 李志樑 +2 位作者 邱健 易绍东 董凤英 《广西医科大学学报》 CAS 2009年第2期176-179,共4页
目的:优化lipofectamine^(TM)2000介导的组织因子(TF)小干扰RNA(siRNA)的转染条件。方法:化学合成法合成特异的TFsiRNA,利用绿色荧光蛋白(GFP)进行标记,分别将1.0μL和1.5μL的lipofectamineTM2000与含有20、30、40、50、60pmol的TFsiRN... 目的:优化lipofectamine^(TM)2000介导的组织因子(TF)小干扰RNA(siRNA)的转染条件。方法:化学合成法合成特异的TFsiRNA,利用绿色荧光蛋白(GFP)进行标记,分别将1.0μL和1.5μL的lipofectamineTM2000与含有20、30、40、50、60pmol的TFsiRNA混合液制备成相应的转染混合物,转染人胚胎肾细胞株(HKE-293)24h后,在荧光显微镜下计数阳性细胞率。同时,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测每组细胞活性。结果:转染效率和细胞活性与lipofectamineTM2000以及siRNA有明显的交互作用,在1.0μL的lipofectamineTM2000和50pmolsiRNA转染HEK-293细胞时,细胞转染效率最高,转染效率达(86.5±2.4)%,在1.5μL的lipofectamineTM2000转染40pmolsiRNA时,细胞活性为(86.0±7.8)%。结论:经优化转染条件后的li-pofectamineTM2000可高效的将化学合成的siRNA转染入HKE-293细胞株,且细胞活性达85%以上,为建立稳定的沉默转染体系提供实验基础。 展开更多
关键词 组织因子 阳离子脂质体 小干扰RNA 转染
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HEK-293细胞复苏培养及冻存 被引量:4
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作者 杨彪 梅晰凡 刘福强 《辽宁医学院学报》 CAS 2007年第6期1-3,共3页
目的通过对人胚肾293细胞的复苏培养及其冻存的研究,为进一步行干细胞标记实验奠定基础。方法复苏培养人胚肾293细胞,倒置显微镜观察人胚肾293细胞的生长状况,计算细胞贴壁率,绘制细胞生长曲线,冻存保留细胞。结果人胚肾293细胞在普通... 目的通过对人胚肾293细胞的复苏培养及其冻存的研究,为进一步行干细胞标记实验奠定基础。方法复苏培养人胚肾293细胞,倒置显微镜观察人胚肾293细胞的生长状况,计算细胞贴壁率,绘制细胞生长曲线,冻存保留细胞。结果人胚肾293细胞在普通培养条件下生长良好,6h后大部分细胞已经贴壁,8h细胞已完全贴壁。结论人胚肾293细胞采用改进方法复苏培养及冻存是简便可行的,为进一步行干细胞标记实验奠定了坚实的前期基础。 展开更多
关键词 人胚肾293细胞 细胞培养 冻存
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NMDA受体在爪蟾卵母细胞和HEK-293细胞表达体系中的建立
14
作者 胡喆 Kiran Sapkota 周燕 《广西医科大学学报》 CAS 2018年第6期779-783,共5页
目的:建立特异性表达NMDA受体(NMDAR)NR2AR、NR2BR亚型的爪蟾卵母细胞和HEK-293细胞模型,选出合适的表达体系模型,为研究药物对NMDAR介导电流的影响奠定基础。方法:分别采用显微注射法和脂质体转染法将NMDAR表达在爪蟾卵母细胞和HEK-29... 目的:建立特异性表达NMDA受体(NMDAR)NR2AR、NR2BR亚型的爪蟾卵母细胞和HEK-293细胞模型,选出合适的表达体系模型,为研究药物对NMDAR介导电流的影响奠定基础。方法:分别采用显微注射法和脂质体转染法将NMDAR表达在爪蟾卵母细胞和HEK-293细胞上,利用全细胞膜片钳技术,记录NMDAR亚型NR2AR、NR2BR介导的电流。结果:在建立的爪蟾卵母表达体系中,NMDAR基因注射成功率为100%,且能检测到NMDAR亚型NR2AR和NR2BR介导的内向电流,而在HEK-293表达体系中,转染成功率为(6.7±1.39)%,未检测到NMDAR介导的电流。结论:成功建立爪蟾卵母细胞NMDAR表达体系,可作为研究药物对爪蟾卵母细胞表达体系上NMDAR电流影响的合适的细胞表达体系模型。在HEK-293表达体系上未检测到相关电流,可能与其转染后细胞活性大大降低、脂质体转染效率低等因素有关。 展开更多
关键词 爪蟾卵母细胞 hek-293细胞 NMDA受体 全细胞膜片钳技术
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HEK-293T细胞敲除TRIM25基因促进脑心肌炎病毒复制的研究
15
作者 刘文文 吕林 +3 位作者 朱慧欣 延君芳 姜平 白娟 《畜牧与兽医》 北大核心 2022年第6期78-84,共7页
为了探究三方基序蛋白25(TRIM25)对脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)增殖的影响,在HEK-293T细胞上使用簇状规则间隔的短回文重复序列(CRISPR/Cas9)基因编辑技术敲除TRIM25基因,并通过PCR测序和Western blot确认敲除效果,... 为了探究三方基序蛋白25(TRIM25)对脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)增殖的影响,在HEK-293T细胞上使用簇状规则间隔的短回文重复序列(CRISPR/Cas9)基因编辑技术敲除TRIM25基因,并通过PCR测序和Western blot确认敲除效果,然后观察敲除细胞形态并利用试剂盒测定TRIM25缺失后细胞增殖速度的变化,确认敲除细胞与野生细胞无明显差异,用EMCV感染敲除细胞后,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、病毒滴定测定和Western blot等方法测定病毒基因转录水平、蛋白表达情况。结果显示:感染EMCV后,敲除细胞与野生细胞相比,显著促进了病毒的转录水平、病毒蛋白的翻译水平和子代病毒的毒力(P<0.05)。综上,在HEK-293T细胞上,成功构建TRIM25缺失细胞系,且试验表明TRIM25的缺失有助于EMCV的复制。研究结果为后续TRIM25抗病毒机制研究提供了理论依据。 展开更多
关键词 TRIM25基因 基因敲除 hek-293T细胞 脑心肌炎病毒
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人HNA-3a基因的克隆及其在HEK-293细胞的表达
16
作者 陈丽 周浩 +1 位作者 何宏天 管政 《蚌埠医学院学报》 CAS 2019年第1期6-8,13,共4页
目的:构建人HNA-3a基因全长的真核表达载体,探索一种检测抗人HNA-3a抗体的实验方法,观察HNA-3a蛋白表达情况。方法:参照GeneBank中人HNA-3a基因序列,设计并合成引物,采用RT-PCR方法反转录HNA-3a基因外显子片段全长,定向克隆到pEGFP-N3... 目的:构建人HNA-3a基因全长的真核表达载体,探索一种检测抗人HNA-3a抗体的实验方法,观察HNA-3a蛋白表达情况。方法:参照GeneBank中人HNA-3a基因序列,设计并合成引物,采用RT-PCR方法反转录HNA-3a基因外显子片段全长,定向克隆到pEGFP-N3载体中,然后采用Lipofectamine^(TM) 2000试剂将含目的基因的pEGFP-N3表达载体转染至HEK-293细胞中进行稳定表达,并以免疫荧光和蛋白质免疫印迹法(WB)鉴定目的基因的表达情况。结果:免疫荧光和免疫印迹结果显示,目的基因在HEK-293细胞中获高效表达。结论:成功构建了高效表达HNA-3a蛋白的真核表达载体,为检测人血浆中抗HNA-3a抗体奠定了基础。 展开更多
关键词 基因表达 克隆 HNA-3a HEK293细胞
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人SMAD4全长及剪接体在HEK-293T细胞中的亚细胞定位及转录活性分析
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作者 方晋仁 尹小慧 +3 位作者 周涛 李国庆 秦辉 杨南扬 《生命科学研究》 CAS CSCD 2021年第2期95-101,共7页
为了观察人SMAD4全长及剪接体在HEK-293T中的亚细胞定位,并分析它们在HEK-293T细胞中的转录活性差异,将SMAD4全长及剪接体的pEGFP-C1重组质粒转染至HEK-293T细胞中,在荧光显微镜下观察含GFP标签的SMAD4全长及其剪接体蛋白的亚细胞定位,... 为了观察人SMAD4全长及剪接体在HEK-293T中的亚细胞定位,并分析它们在HEK-293T细胞中的转录活性差异,将SMAD4全长及剪接体的pEGFP-C1重组质粒转染至HEK-293T细胞中,在荧光显微镜下观察含GFP标签的SMAD4全长及其剪接体蛋白的亚细胞定位,并通过双荧光素报告酶实验在HEK-293T细胞中对SMAD4全长及其剪接体激活SBE报告基因的情况进行比较。亚细胞定位观察显示,与pEGFP-C1空载组中GFP在HEK-293T中呈现核质均匀分布不同,GFP-SMAD4和GFP-SMAD4△4、GFP-SMAD4△6、GFP-SMAD4△5-6、GFP-SMAD4△4-6、GFP-SMAD4△4-7五种剪接体均分布于HEK-293T的细胞质中;而GFP-SMAD4△3则主要分布于HEK-293T的细胞核中。双荧光素酶实验结果显示,与空载组相比,在6种剪接体过表达组中,只有SMAD4△3过表达组能对SBE报告基因的荧光素酶活性起到一定的上调作用;但与SMAD4△3过表达组比较,SMAD4全长过表达组能对SBE报告基因的荧光素酶活性起到更明显的上调作用。本文观察了人SMAD4全长及剪接体在HEK-293T中的亚细胞定位,并分析了其对下游信号通路的转录激活情况,可为后续SMAD4剪接体蛋白的功能研究提供一定的基础。 展开更多
关键词 SMAD4 选择性剪接 绿色荧光蛋白(GFP) hek-293T细胞 亚细胞定位 转录活性
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不同信号肽对猪瘟E0蛋白在HEK-293F细胞中分泌表达的影响及E0-ELISA方法的建立
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作者 方琪 罗烨 +6 位作者 梁彤彤 张珊玲 冯泽中 谢诗晴 郑金 尹德明 余兴龙 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第9期1195-1201,共7页
为建立以猪瘟病毒(CSFV)E0蛋白为包被抗原的间接ELISA方法,构建含5种常用信号肽及其内源信号肽的CSFV E0重组表达质粒,瞬时转染至HEK-293F细胞中表达。Western-blot结果显示,不同信号肽介导的E0蛋白在细胞中均能分泌表达,其中人胰岛素(I... 为建立以猪瘟病毒(CSFV)E0蛋白为包被抗原的间接ELISA方法,构建含5种常用信号肽及其内源信号肽的CSFV E0重组表达质粒,瞬时转染至HEK-293F细胞中表达。Western-blot结果显示,不同信号肽介导的E0蛋白在细胞中均能分泌表达,其中人胰岛素(Insulin)信号肽介导的E0蛋白分泌表达水平最高。将其纯化后的E0蛋白作为包被抗原建立间接ELISA方法,并与IDEXX ELISA试剂盒平行检测173份血清,结果显示E0-ELISA与IDEXX ELISA符合率为92.49%。将两者分别与病毒中和试验(VNT)对比,结果显示E0-ELISA与VNT符合率为95.38%,IDEXX ELISA与VNT符合率为91.33%,说明E0-ELISA比IDEXX ELISA更敏感。本研究通过使用不同信号肽使猪瘟E0蛋白在HEK-293F中高效糖基化表达,以该E0蛋白作为包被抗原建立了E0-ELISA方法,为临床鉴别猪瘟野毒感染提供了技术手段。 展开更多
关键词 E0蛋白 信号肽 猪瘟病毒 hek-293F 间接ELISA
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高表达H2型人类组织血型抗原HEK-293T细胞系的构建及其应用
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作者 秦海艳 谢忆 +6 位作者 张巧玲 马素娟 李晨 杨林鹏 付艳丽 李奇蒙 杨俊杰 《微生物学免疫学进展》 CAS 2024年第4期9-15,共7页
目的通过在人胚肾-293T(human embryo kidney-293T,HEK-293T)细胞中过表达岩藻糖转移酶2(fucosyltransferases 2,FUT2)基因,进而催化诺如病毒受体人类组织血型抗原(histo-blood group antigen,HBGA)的形成,构建介导诺如病毒和受体发生... 目的通过在人胚肾-293T(human embryo kidney-293T,HEK-293T)细胞中过表达岩藻糖转移酶2(fucosyltransferases 2,FUT2)基因,进而催化诺如病毒受体人类组织血型抗原(histo-blood group antigen,HBGA)的形成,构建介导诺如病毒和受体发生相互作用的细胞系。方法构建FUT2慢病毒质粒,采用Lipofectamine 2000将FUT2慢病毒质粒及pMD.2G和psPAX2包装质粒共转染HEK-293T细胞,收获慢病毒颗粒。慢病毒颗粒感染对数生长期的HEK-293T细胞,嘌呤霉素加压筛选获得HEK-293T/FUT2细胞系。PCR鉴定FUT2基因是否整合到基因组中,RT-qPCR检测HEK-293T/FUT2细胞FUT2 mRNA转录水平,流式细胞术分析HEK-293T/FUT2细胞HBGAs的表达,间接免疫荧光法分析HEK-293T/FUT2细胞与诺如病毒病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)的结合活性。结果成功构建了序列正确的慢病毒质粒PLVX-IRES-Puro-FUT2,并获得了慢病毒颗粒。慢病毒颗粒感染HEK-293T细胞后,通过嘌呤霉素加压筛选获得了HEK-293T/FUT2细胞系,PCR验证显示,FUT2基因成功整合到HEK-293T细胞基因组中。HEK-293T/FUT2细胞FUT2 mRNA水平提高了330倍。99.9%的HEK-293T/FUT2细胞表达H2型人类组织血型抗原。GI.1重组诺如病毒VLP可以与HEK-293T/FUT2细胞产生很好的结合反应,EC50为2.007μg/mL。结论建立了H2型人类组织血型抗原稳定高表达的HEK-293T细胞系,并基于该细胞系初步建立了GI.1型重组诺如病毒VLP结合活性评价方法。 展开更多
关键词 人类组织血型抗原 人胚肾293T细胞(hek-293T细胞) 诺如病毒 α-1 2岩藻糖转移酶 结合活性
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乳酸脱氢酶基因调控对HEK-293细胞代谢和腺病毒生产的影响
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作者 缪俊青 易小萍 +1 位作者 李祥超 庄英萍 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第9期3863-3875,共13页
减少乳酸积累一直是哺乳动物细胞生物技术产业的一个目标。体外培养动物细胞时,乳酸积累主要是2种代谢途径作用的综合结果:一方面,葡萄糖在乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase A,LDHA)的作用下生成乳酸;另一方面,乳酸可通过乳酸脱氢酶B(... 减少乳酸积累一直是哺乳动物细胞生物技术产业的一个目标。体外培养动物细胞时,乳酸积累主要是2种代谢途径作用的综合结果:一方面,葡萄糖在乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase A,LDHA)的作用下生成乳酸;另一方面,乳酸可通过乳酸脱氢酶B(LDHB)或乳酸脱氢酶C(LDHC)氧化为丙酮酸重新进入三羧酸循环。本研究综合评估了乳酸代谢关键基因调控对人胚胎肾细胞(human embryonic kidney 293 cells,HEK-293)细胞生长、代谢和人腺病毒(human adenovirus,HAdV)生产的影响,有效提高了HEK-293细胞的HAdV生产能力,并为哺乳动物细胞的乳酸代谢工程调控提供了理论基础。通过改造乳酸代谢关键调控基因(敲除ldha基因以及过表达ldhb和ldhc基因),有效改善了HEK-293细胞的物质和能量代谢效率,显著提高了HAdV的生产。与对照细胞相比,3个基因改造均能促进细胞生长,降低乳酸和氨的积累,明显增强细胞的物质和能量代谢效率,显著提高了HEK-293细胞的HAdV生产能力。ldhc基因过表达对HEK-293细胞的生长、代谢和HAdV生产调控最显著,最大细胞密度提高了约38.7%,乳酸对葡萄糖得率和氨对谷氨酰胺得率分别下降了33.8%和63.3%,HAdV滴度提高了至少16倍。此外,相比于对照细胞株,改造细胞株的腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)生成速率、ATP/O_(2)比率、ATP与腺苷二磷酸(adenosine diphosphate,ADP)的比值以及还原型辅酶Ⅰ(nicotinamide adenine dinucleotide,NADH)含量均有不同程度的提高,能量代谢效率明显改善。 展开更多
关键词 乳酸脱氢酶 人胚胎肾细胞(hek-293) 物质代谢 能量代谢 腺病毒
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