鹅源鼠伤寒沙门菌crp、hfq基因缺失株的构建及生物学特性分析

为构建鹅鼠伤寒沙门菌单基因缺失株并鉴定其生物学特性,本研究以广东地区鹅源鼠伤寒沙门菌流行株A29为研究对象,采用λ-Red同源重组技术,分别构建crp、hfq基因缺失株(A29Δcrp和A29Δhfq)及相应基因回补株,并分别采用相应引物经PCR鉴定。通过细菌培养,对各菌株生物学特性进行比较;通过PCR鉴定各菌株的遗传稳定性;采用K-B纸片扩散法检测各菌株的药物敏感性;将各菌株纯培养物经腹腔注射4周龄小鼠,测定各菌株对小鼠的毒力,并观察感染后小鼠的临床症状及各组织剖检病变与组织病理变化。PCR和测序结果表明,正确构建各基因缺失株和相应回补株。生物学特性试验结果显示,与亲本株相比,A29Δcrp菌落直径极显著变小(P<0.001),不产酸、不产生H_(2)S,菌体极显著变短(P<0.001);A29Δhfq菌落边缘不整齐,不产生H_(2)S,菌体极显著变长(P<0.001),表明crp、hfq基因影响细菌的菌落形态、生化特性和形态特征。菌株遗传稳定试验结果显示,菌株传至60代时,基因缺失株仍能够稳定缺失。药敏试验结果显示,与亲本株比较,A29Δcrp对氨基糖苷类、碳青霉烯类、环丙沙星、甲氧苄啶、阿奇霉素等药物的敏感性降低,对四环素类药物的敏感性增强,A29Δhfq对除青霉素类、头孢唑啉以外的12种药物的敏感性增强。小鼠毒力试验结果显示,与亲本株的LD_(50)(2.479×10^(4)cfu)相比,A29Δcrp的LD_(50)(5.379×10^(5) cfu)和A29Δhfq的LD_(50)(5.012×106 cfu)均明显上升。各菌株感染小鼠后的临床症状及各组织剖检病变基本一致;组织病理变化观察显示,与亲本株相比,A29Δcrp组小鼠肝组织可见多量大小不一的坏死灶,脾组织红髓面积增大、白髓面积减小,A29Δhfq对小鼠脾脏、肝脏及脑组织损伤均较小。本研究为探究鼠伤寒沙门菌crp和hfq基因功能奠定了基础,同时也为进一步研发鹅沙门菌病疫苗提供了参考依据。

鼠伤寒沙门菌sRNA GcvB和伴侣蛋白Hfq对Ⅲ型分泌系统相关基因的调控

细菌的Ⅲ型分泌系统(T3SS)与毒力密切相关。为探究鼠伤寒沙门菌sRNA GcvB和伴侣蛋白Hfq对T3SS相关基因spaP、invC、invG、prgH、prgI、prgJ、prgK的调控,利用Red同源重组技术构建了上述基因与lacZ的融合菌株,在此基础上利用P22噬菌体转导技术分别构建上述融合菌株与gcvB、hfq的单缺失菌株,通过qPCR和β-半乳糖苷酶试验分别检测gcvB、hfq缺失后各基因的转录水平和蛋白水平的变化。结果显示:与标准菌株相比,gcvB缺失后,spaP、invC、prgH、prgI、invG的转录水平和蛋白水平均上调;prgJ、prgK的转录水平上调,蛋白水平下调。hfq缺失后,spaP、invC、prgH、prgI、invG的转录水平和蛋白水平均上调,prgH、prgI、prgJ、prgK的蛋白水平下调。表明Hfq和GcvB均可对spaP、invC、invG、prgH、prgI、prgJ、prgK进行调控。上述结果可为鼠伤寒沙门菌sRNA GcvB和Hfq的作用机理研究提供参考。

沙门氏菌sRNA RybB及伴侣蛋白Hfq对孔蛋白OmpW表达的调控作用

为探究sRNA RybB和伴侣蛋白Hfq对沙门氏菌孔蛋白OmpW表达的调控作用,研究利用λred同源重组系统构建ompW基因lacZ融合菌株,再通过P22噬菌体转导技术构建颜色指示菌株中rybB和hfq相关基因的单缺失株、双缺失株,通过β-半乳糖苷酶活性试验和qPCR分析,确定sRNA RybB及伴侣蛋白Hfq对孔蛋白OmpW表达的调控作用。结果显示:成功构建了颜色指示菌株ΔompW∶∶LacZ和相对应的基因缺失菌株;与标准株LT2相比,ΔhfqY25A、ΔhfqK56A、Δhfq65、Δhfq87基因使ompW蛋白表达水平极显著下调(P<0.01),具有正调控作用,而Δhfq72、Δhfq∶∶tet、ΔrybB、ΔrybBΔhfq∶∶tet基因使ompW蛋白表达水平极显著上调(P<0.01),具有负调控作用;与标准株LT2相比,缺失hfq定点突变和rybB对ompW基因具有负调控作用。研究表明,沙门氏菌伴侣蛋白Hfq及RybB对孔蛋白ompW基因的蛋白表达水平和转录水平产生不同程度的影响,初步阐明了伴侣蛋白Hfq、sRNA RybB和靶基因三者的内在关系,为沙门氏菌减毒活疫苗与新型抗菌药物研制的研究奠定基础。

基于转录组测序筛选鼠伤寒沙门菌hfq基因缺失菌的差异表达基因

旨在鼠伤寒沙门菌hfq基因缺失株转录组测序中分析适应环境变化及细菌分泌通路,筛选相关基因。通过使用实时荧光定量PCR对鼠伤寒沙门菌hfq基因缺失株转录组测序结果进行验证,从而对鼠伤寒沙门菌hfq基因缺失株的细菌趋化性通路、细菌双组分通路、细菌分泌通路进行深入分析,筛选相关的重要调控基因。结果显示:在细菌趋化性通路中筛选出yiaD、STM 3138、STM 3216和malE等4个共表达基因;在细菌分泌通路中筛选出spaP、invA、prgH、invE、spaS、invG和ssaV等7个共表达基因;在细菌双组分通路中筛选出ybfM、htrA、pagO、STM 3138、STM 3031、ttrB、hilD、pstS、STM 1530、hilA、pgtC、hydH、pocR、STM 3216、ttrR和fljB等16个共表达基因。在鼠伤寒沙门菌hfq基因缺失株的趋化性通路、细菌双组分通路、细菌分泌通路中筛选出差异表达基因,hfq能够对这些基因进行调控,从而影响如运动性、毒力等相关作用,为沙门菌中的sRNA与hfq后续研究及沙门菌的防治奠定一定基础。

大肠杆菌RNA分子伴侣Hfq与DsrA和rpoS作用机制的研究进展

RNA分子伴侣Hfq是细菌重要的转录后调节因子,它能够帮助非编码small RNA(sRNA)与目标mRNA配对.mRNArpoS编码的稳态sigma因子σS是大肠杆菌中应激响应的核心调控因子.在低温下,Hfq蛋白对于sRNA DsrA介导的mRNArpoS的翻译激活是必需的.然而,Hfq使用何种机制来促进sRNA和mRNA配对一直有两种并不互斥的模型存在:Hfq远侧和近侧两个表面同时结合sRNA和mRNA,使得两条RNA相互靠近,便于形成碱基配对;Hfq可能结合一条或者两条RNA,改变它们的二级结构或者三级结构,从而促进sRNA-mRNA配对的实现.最近的研究报道,成功在体外捕捉到了sRNA-Hfq-mRNA三元复合物,测定了AU6A-Hfq-A7三元复合物的晶体结构,并且在大肠杆菌体内证实了三元复合物的形成对于Hfq帮助sRNA DsrA激活mRNA rpoS的翻译是重要的.本文以sRNA DsrA和mRNA rpoS为例综述了蛋白质Hfq与RNA的结合特性,同时也讨论了sRNA-Hfq-mRNA三元复合物的存在对于研究sRNA介导的调控机制的一些启示.

肠炎沙门氏菌sRNA伴侣蛋白Hfq表达与纯化

利用pET原核表达系统和亲和层析表达纯化肠炎沙门氏菌sRNA伴侣蛋白Hfq。首先构建含靶基因hfq的重组表达质粒pET28a(+)-hfq,经PCR及双酶切鉴定构建正确,再将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导目的基因高效表达。SDS-PAGE及Western blot结果表明:Hfq在大肠杆菌中成功表达,蛋白分子质量约为16.6ku,且主要存在于上清中,以可溶形式表达。进一步对表达产物进行Ni 2+亲和层析纯化,获得纯度较高的融合蛋白,为研究Hfq蛋白与sRNA的相互作用以及sRNA的调控机制提供基础。

肠炎沙门氏菌hfq缺失株的构建和对fliC基因的调控分析

Hfq是一种介导细菌非编码小RNA(sRNA)与其靶标mRNA结合的伴侣蛋白,可协助多种sRNA在转录后水平调控基因表达。本研究通过λ噬菌体的Red同源重组系统构建了肠炎沙门氏菌hfq缺失突变株SE50336△hfq。利用荧光定量PCR技术分析了hfq突变株中鞭毛主要结构蛋白fliC的表达情况。结果表明与野生株相比,hfq突变株fliC的表达量明显下降,只有野生株的3.7%。细菌运动性试验表明突变株在半固体培养基上的运动能力减弱。以上结果表明Hfq蛋白可调节鞭毛结构蛋白FliC的表达,造成FliC蛋白表达量明显下降,鞭毛的合成受到抑制,从而导致肠炎沙门氏菌的运动能力减弱。

7XXX系铝合金HFQ温成形界面换热系数实验研究

基于自主设计的圆台模具淬火实验平台,研究高强度7075-T6铝合金在HFQ温成形过程中的瞬态传热规律。通过Beck非线性估算法(Beck反算法)获得界面换热系数(IHTC)在不同因素下(包括合模压强与表面粗糙度)随温度变化的瞬态换热规律,并分析各因素对IHTC的影响机理。结果表明:Beck反算法在计算瞬态换热系数时具有较高的计算精度。7075-T6铝合金与模具界面的瞬态换热系数随压强增大而增大,当压强增大到80 MPa时,瞬态平均换热系数IHTC趋近于3375 W/(m^2?K)。进一步,表面粗糙度也会影响7075-T6铝合金温成形过程的IHTC,当粗糙度大于0.57μm并小于0.836μm时,IHTC随粗糙度的增大而明显减小,当粗糙度小于0.57μm或大于0.836μm时,IHTC值均随粗糙度的增大而缓慢减小。

布鲁菌Hfq蛋白研究进展

布鲁菌病(布病)是一种严重的人兽共患病。作为布病的病原,布鲁菌能够耐受宿主体内的各种杀菌机制并持续的生存。当布鲁菌侵入宿主体内后,必须适应抗体免疫的环境,而这依赖于布鲁菌对自身基因表达的巧妙调控。Hfq蛋白是一个RNA伴侣分子,对于介导sRNA的转录后调控发挥着重要的作用。在多种细菌中,对Hfq蛋白的功能都进行了深入的研究,目前已经发现该蛋白与细菌基因的表达调控、细菌对多种应激环境的适应能力以及致病菌的毒力均有着密切的关系。论文对Hfq蛋白的结构,对sRNA的调控功能,特别是布鲁菌Hfq蛋白调控功能的研究现状及在布病疫苗研发中的应用进行系统的介绍,为布鲁菌基因的表达调控和布病防控技术的研究提供参考。

细菌RNA结合蛋白Hfq研究进展

Hfq蛋白是细菌中重要的转录后调控子,参与调节细菌的生长、代谢、压力环境适应能力等多种生命活动,影响细菌的多种生理代谢过程。在致病菌中,Hfq蛋白与细菌的毒力密切相关。Hfq主要通过结合RNA来影响其稳定性,或者是通过辅助非编码小RNA(sRNA)与mRNA结合来调节靶基因的表达。文章对Hfq在致病菌中的作用及寻找Hfq靶标RNA的研究方法进行了综述,以期为Hfq的功能研究奠定基础。

单核细胞增生李斯特菌sRNA伴侣分子hfq的基因克隆、表达及纯化

为克隆、表达单核细胞增生李斯特菌sRNA分子伴侣蛋白hfq基因,并纯化重组蛋白,通过PCR的方法从单核细胞增生李斯特菌基因组DNA中扩增出hfq基因,将扩增产物克隆于pMD18-T载体中,测序验证后,再将hfq基因亚克隆至表达载体pET-32a(+)中,成功构建pET-32a(+)-hfq原核表达载体。然后,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,通过IPTG进行诱导表达,对表达蛋白进行可溶性分析,并采用Ni-NTA纯化目的蛋白。结果显示:克隆的hfq基因全长234 bp,编码77个氨基酸,通过SDS-PAGE可以检测到27 kDa的蛋白特异性条带;并从上清中纯化得到了Hfq融合蛋白。为进一步研究该蛋白的生物学功能奠定了基础。

分子伴侣hfq基因缺失对单核细胞增生李斯特菌毒力及生物被膜生成的影响

为了解非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)分子伴侣蛋白Hfq在LM毒力中发挥的调控作用,在构建LM-Δhfq缺失株的基础上,通过动物攻毒试验检测野毒株LM-SB5与缺失株LM-Δhfq对昆明系小鼠的LD50,肝、脾载菌量及对肝、脾、肾的病理损伤;通过溶血试验检测二者的溶血活性;通过结晶紫染色的方法检测二者的生物被膜生成能力。以分析hfq基因缺失对LM毒力及生物被膜生成的影响。结果显示,与LM-SB5相比,LM-Δhfq对小鼠的LD50升高了6.067倍,毒力显著降低;肝、脾载菌量在第2,4,5天显著下降(P<0.05),在第3天下降极显著(P<0.01);对肝、脾、肾的病理损伤也有所减弱,LM-Δhfq较LM-SB5溶血能力下降了2倍,生物被膜生成能力在24 h时显著降低(P<0.05)。研究结果证实,Hfq蛋白对LM的毒力及生物被膜生成能力具有重要调控作用。

不同碳源对溶藻弧菌黏附相关表型的影响初探及Hfq对其的调控

为探讨不同碳源对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)黏附相关表型的影响及Hfq对其的调控作用,研究了D-葡萄糖、D-麦芽糖、D-海藻糖和D-果糖对溶藻弧菌ZJ-T野生株、hfq缺失株及回补株的运动性、菌落形态、鞭毛、胞外多糖及生物膜合成的影响。研究结果显示,4种碳源均使溶藻弧菌群集运动(swarmming)显著增强(P<0.001),并受Hfq正调控;游动性(swimming)显著减弱(P<0.01),但不受Hfq调控;菌落变得褶皱,并受Hfq负调控;4种碳源不影响溶藻弧菌鞭毛及胞外多糖合成,但D-果糖使其生物膜合成减少,并受Hfq负调控。实验分析表明:4种碳源可能通过调控溶藻弧菌黏性阻力及能量代谢来调控其运动性;并可能通过调控胞外多糖分子结构及理化性质影响其菌落形态;另外,D-果糖在调控生物膜形成过程中具有重要作用;因此,添加不同碳源会影响溶藻弧菌黏附相关表型,可能影响其致病性,但具体调控机制需进一步研究。

Hfq对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)毒力的调控分析

为探讨分子伴侣Hfq对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)毒力的调控作用,本文分析了溶藻弧菌ZJ-T野生株、hfq突变株及回补株各项与毒力相关的生理生化指标。研究结果显示:在半固体和固体LBS平板中,缺失株游动和涌动能力显著降低(P<0.001);hfq缺失株生物膜合成速度及合成量降低,但解离速度增加;在限铁环境下,缺失株生长有所减弱;缺失株胞外蛋白酶分泌增强(P<0.01);同野生株和突变株相比,缺失株对小鼠成肌细胞系C2C12细胞几乎不致死,且其对石斑鱼的半数致死量提高3个数量级。实验结果表明:Hfq对溶藻弧菌毒力具有重要调控作用,并通过调控其运动、生物膜形成、铁代谢、胞外蛋白酶分泌等生理生化过程从而调控其毒力。本研究可为溶藻弧菌病害暴发的防治提供重要理论依据。

Hfq对伤寒沙门菌高渗应激早期基因表达的调节

目的:探查伤寒沙门菌hfq基因在高渗应激早期对其他基因表达的影响。方法:用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌hfq基因缺陷变异株;利用伤寒沙门菌全基因组芯片技术,比较伤寒沙门菌野生株和hfq基因缺陷变异株在高渗应激早期的基因表达谱差异,并选择部分表达差异基因进行实时定量PCR验证。结果:伤寒沙门菌hfq基因缺陷变异株制备成功;基因表达谱比较分析结果表明伤寒沙门菌hfq基因缺陷变异株在高渗应激早期有62个基因表达上调,有32个基因表达下调。实时定量PCR结果与芯片分析一致。结论:Hfq作为一个调节因子在伤寒沙门菌高渗应激早期对基因表达起重要调节作用。

大黄鱼来源波罗的海希瓦氏菌SB-19的hfq基因功能分析

为分析大黄鱼来源波罗的海希瓦氏菌(Shewanella baltica)中分子伴侣Hfq的功能,对具有强致腐能力的波罗的海希瓦氏菌SB-19中hfq基因进行敲除,比较野生株(wide type,WT)和敲除株(knock out,KO)在生长速率、群体感应、抗逆境以及对灭菌鱼汁致腐效果的差异。结果表明:波罗的海希瓦氏菌SB-19中存在1个hfq基因,其基因表达水平随着细胞密度的增加而升高;在30℃培养条件下,WT株和KO株的生长速率接近,但在4℃培养条件下,与WT株相比,KO株的生长出现明显迟滞且稳定期的细胞密度较低;WT株与KO株分泌信号分子的能力相近,但KO株表现出较低的生物被膜形成能力和胞外蛋白酶活性,而且接种KO株的灭菌鱼汁也产生较少的挥发性盐基氮和三甲胺;此外,KO株对盐分、营养、重金属、消毒剂等胁迫条件更为敏感。上述结果表明Hfq参与波罗的海希瓦氏菌SB-19株的多种代谢调控,影响细菌的生长、群体感应、致腐能力、抗逆境能力等,即Hfq是一种全局性调控因子,整体调节波罗的海希瓦氏菌SB-19的诸多生理活动。本实验为波罗的海希瓦氏菌的基础生物学研究和海产品中微生物的致腐机制提供理论基础。

肺炎克雷伯菌Hfq蛋白特性及对耐药的影响

Hfq(host factor for RNA phage QB replicase)蛋白是一个全局性调节因子,广泛参与细菌生长、趋化、毒力、耐药及应对外界选择压力等方面的调节,但在肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,KP)中的功能尚不清楚。本研究从临床病例中分离到59株KP,将其hfq基因与11例常见临床感染菌株hfq基因〔从美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)数据库下载〕进行了比较。所有hfq基因经EMBOSS Transeq翻译成氨基酸序列,用MAFFT软件进行多序列比对,并通过NCBI数据库中的保守结构域预测Hfq蛋白结构域。分别采用ESPript3.0、Phyre2分析Hfq蛋白的二、三级结构。59株KP中仅3株hfq基因的5个密码子位点存在差异,而其蛋白质氨基酸序列完全一致。KP与大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、痢疾志贺菌之间,Hfq蛋白的氨基酸序列相似度较高,主要区别在C末端上;与金黄色葡萄球菌、产单核细胞李斯特菌相比,KP Hfq蛋白在N末端和C末端上差别较大;所有菌株C末端均呈酸性。三级结构预测提示68(66.67%)个氨基酸与模板序列一致,较为保守的功能结构为54-VYKHAI-59序列。采用CRISPR/Cas9同源重组技术敲除KP的hfq基因,并对其进行药物敏感性测试,结果显示,基因敲除菌株对抗生素的耐药性较野生株有显著下降(P<0.05),差异有统计学意义,提示KP的Hfq蛋白氨基酸序列非常保守,可能参与了KP的耐药调节。

支气管败血波氏杆菌Δhfq突变株构建及生物学特性分析

为研究Hfq蛋白在支气管败血波氏杆菌(Bb)的致病作用,本研究采用同源重组技术,将卡那霉素抗性基因替换Bb122株的hfq基因,构建BbΔhfq突变株。将其连续传20代,Δhfq突变株具有良好的遗传稳定性。生化检测试验表明,突变株与亲本株未发生明显改变。此外,在37℃培养时,突变株与亲本株生长曲线无明显差异,但在42℃培养时,突变株的生长曲线略低于亲本株。抗逆性试验表明,突变株与亲本株在紫外线照射和50℃条件下,亲本株的耐受能力均显著高于突变株(p<0.05)。然而,将亲本株与突变株分别以2×109cfu/只腹腔接种小鼠时,亲本株接种小鼠全部死亡,而突变株接种小鼠则全部存活,表明Hfq蛋白与该菌的致病性有关。本研究为进一步研究Hfq蛋白的功能及其在Bb致病机制中的作用奠定了基础。

STM LT2 Hfq与sRNA GcvB对靶基因OppA的调控作用

运用λ-Red同源重组酶和FLP重组酶系统,构建了STM OppA::lacZ基因融合菌株,并通过P22噬菌体转导技术构建了相应的GcvB和Hfq基因缺失菌株,qRT-PCR和β-半乳糖苷酶试验分别检测了重组菌株oppA基因转录和蛋白水平。结果显示,与对照组相比,敲除GcvB基因使oppA基因转录和蛋白水平分别上调了4.4和5.4倍;敲除Hfq基因使oppA基因转录和蛋白水平分别上调了6.5和6.0倍;同时敲除GcvB和Hfq基因,oppA基因转录和蛋白水平分别上调了6.8和8.3倍。结果表明,Hfq存在独立于GcvB对OppA mRNA冗余的负调控作用。该结果为进一步研究Hfq与OppA mRNA的作用机制提供了理论依据。

建立基于RNA免疫共沉淀技术的鼠疫耶尔森菌Hfq蛋白相关sRNA的体内验证方法

目的:建立RNA免疫共沉淀方法,为鼠疫耶尔森菌Hfq蛋白相关非编码小RNA(sRNA)提供体内验证方法。方法:首先在RNA结合蛋白Hfq下游加入Flag标签,用Flag标签抗体进行免疫共沉淀,获得蛋白-RNA复合物,然后从沉淀的蛋白-RNA复合物中分离得到纯化的RNA;通过Western印迹检测各步骤Hfq蛋白的表达,再利用Northern印迹检测目的sRNA——RyhB1和RyhB2。结果:构建了带有Flag标签的RNA结合蛋白Hfq的载体,此载体转导入hfq缺失株后与鼠疫菌野生株的生长曲线无明显差异;通过RNA-蛋白免疫共沉淀技术鉴定出已知与鼠疫菌Hfq蛋白结合的2个sRNA——RyhB1和RyhB2。结论:建立了利用RNA-蛋白免疫共沉淀鉴定与鼠疫菌Hfq蛋白结合的sRNA的技术,为细菌sRNA的验证、功能研究和体内蛋白质与RNA相互作用研究提供了有利工具。