sHLA-A*020-1抗原肽复合物的构建

以原核表达的sHLA A 0 2 0 1 BSP为重链 ,β2 m为轻链 ,与人工合成的EBV抗原肽LMP2A (4 2 6 4 34、NH2 CLGGLLTMV COOH )利用稀释法进行共折叠复性 ,形成可生物素化的可溶性HLA A 0 2 0 1抗原肽复合物。并利用仅与天然构象HLAI类分子结合的单抗W6 / 32 ,通过Dot ELISA和Westernblot对折叠产物的构象进行鉴定 ,证实复性后成功获得了天然构象的sHLA A 0 2 0 1 抗原肽复合物。为进一步组装可溶性HLA/抗原肽四聚体以及制备人工抗原提呈细胞奠定基础。

生物素化的HLA-A*2402-抗原肽复合物的制备

目的制备生物素化的HLA-A*2402-抗原肽复合物。方法将原核高效表达的sHLA-A*2402-BSP融合蛋白及β2m和HLA-A*2402限制性抗原肽EB病毒BRLF1蛋白中的九肽NH2-TYPVLEEMF-COOH进行稀释、复性、折叠,形成HLA-A*2402-抗原肽复合物单体,并在BirA酶作用下进行生物素化,使生物素结合到HLA-A*2402-抗原肽复合物中H链C端的BSP序列上形成生物素化的sHLA-A*2402-抗原肽复合物单体。利用特异性单克隆克体(W6/32和兔抗人2β微球蛋白抗体)及链霉亲合素进行ELISA和Western blot,检测稀释复性和生物素化的折叠产物。结果折叠复合物中,主要含有HLA-A*2402-肽复合物单体及β2m两种成分,其中HLA-A*2402-肽复合物单体可生物素化。结论成功制备出生物素化的HLA-A*2402-抗原肽复合物单体,为进一步构建四聚体及制备人工抗原提呈细胞奠定了基础。

sHLA-A*0201-抗原肽四聚体的构建与功能检测

目的:构建有功能的sHLA-A*0201-抗原肽四聚体,建立一套HLAⅠ类分子/抗原肽的四聚体制备技术。方法:利用基因工程及体外折叠技术构建sHLA-A*0201-LMP2A426-434复合物分子,并在BirA酶的作用下生物素化,与荧光标记的亲和素衍生物以分子数4∶1结合而形成HLA-A*0201-LMP2A426-434四聚体。获得的四聚体对长期混合淋巴细胞培养中增殖的抗原特异性CTL进行检测,同时用细胞毒实验验证。结果:荧光标记的亲和素与生物素化的HLA-A*0201-抗原肽复合物分子正确结合,制备的四聚体能够与长期混合淋巴细胞培养出的特异性T细胞结合。结论:从结构与功能上证实成功地获得有功能的HLA-A*0201-抗原肽复合物四聚体。为进一步研究T细胞识别机制与功能奠定了基础,也为过程复杂的HLA-抗原肽四聚体制备提供了可行的免疫学监控方法。

预先形成的重链二硫键有助于HLA-A2-抗原肽复合物体外折叠

目的: 提高可溶性HLA -A2 肽复合物体外折叠效率。方法: 在变性非还原条件下提取原核表达的HLA重链(HC)。通过离子交换及硫酸铵沉淀初步纯化后, 在β2微球蛋白(β2m)及特异性抗原肽 (Try369-377 )存在的情况下, 于pH6. 6的折叠缓冲体系中稀释复性。利用Westernblot及ELISA检测折叠产物。结果: 折叠复合物中主要含有HLA-A2 抗原肽复合物和β2m, 较少含有HC聚合体; 折叠效率较传统方法提高 2. 5倍。结论: 通过与传统方法作比较, 证实此法折叠效率比传统方法高, 为进一步HLA 肽四聚体及人工抗原提呈细胞的制备可提供足够可溶性的HLA -A2 肽单体。

可溶性HLA-A2-肽复合物的体外折叠与生物素化

目的 :可溶性HLA A2 抗原肽复合物的体外折叠复性与生物素化。方法 :原核高效表达的HLAH链及 β2m,在抗原肽 (EB病毒的膜潜伏蛋白LMP2A的NH2 CLGGLLTMV COOH残基 )的存在下 ,通过稀释复性折叠成HLA A2 抗原肽复合物 ,并在BirA酶的作用下进行生物素化 ,使生物素结合到HLA A2 抗原肽复合物中的H链C端。利用特异性抗体 (mAbW6 / 32和兔抗人 β2m抗体 )及链霉亲合素进行ELISA和Westernblot,检测稀释复性和生物素化的折叠产物。结果 :折叠复合物中 ,主要含有HLAH链聚合体、HLA A2 肽复合物单体及 β2m3种成分 ,其中H链聚合体与HLA A2单体可生物素化。结论 :成功地获得生物素化的HLA A2 抗原肽复合物单体 ,为进一步构建四聚体及制备人工抗原提呈细胞奠定了基础 ,也为过程复杂的HLA

Hsp70-肿瘤抗原肽复合物修饰的DC疫苗体内外特异性抗瘤作用

目的 :探讨树突状细胞 (DC)及Hsp70 肿瘤抗原肽复合物修饰后的体内外特异性抗瘤作用。方法 :采用一定的生化技术 ,从H2 2肝癌细胞中提取肿瘤抗原肽 ,并在体外与Hsp70进行结合 ;采用细胞培养技术 ,培养rmGM CSF、rmIL 4诱导的小鼠骨髓细胞 ,体外获取大量的DC ,后者经Hsp70 肿瘤抗原肽复合物修饰后刺激小鼠脾淋巴细胞 ,通过MTT法进行检测淋巴细胞的激活 ;收集上述刺激传代培养的淋巴细胞 ,检测其对H2 2瘤细胞和艾氏腹水癌细胞的杀伤功能 ;采用H2 2瘤细胞肌肉接种和H2 2瘤细胞、艾氏腹水癌细胞腹腔接种 ,对接种小鼠给予经体外修饰的DC回输 ,观察其抑制肿瘤的效果。结果 :Hsp70 肿瘤抗原肽复合物可使DC成熟 ,大量分泌IL 12、TNF α、IL 1β等细胞因子 ,并能够使DC激活小鼠脾淋巴细胞 ;激活后传代培养的淋巴细胞对H2 2瘤细胞能够特异性地杀伤 ,而对艾氏腹水癌细胞无效 ;经Hsp 70 肿瘤抗原肽复合物修饰后的DC可作为一种有效的瘤苗 ,体内能特异性地抑制小鼠H2 2肿瘤生长。结论 :Hsp70 肿瘤抗原肽复合物能够很好地修饰体外诱导获取的DC ,使后者成为一种有效的瘤苗 ,体外能够特异性地激活淋巴细胞 。

可溶性HLA-G1抗原肽复合物的体外折叠及其功能研究

目的:体外折叠形成可溶性HLA G1抗原肽复合物,并研究其生物学功能。方法:以原核表达的可溶性HLA-G1的重链及轻链β2m,与人工合成的抗原九肽体外进行共折叠复性。将折叠产物通过SephadexG75层析柱纯化,经Westernblot进行构象鉴定。探讨可溶性HLA-G1分子对NK细胞杀伤活性的影响,对混合淋巴细胞培养中T细胞增殖的影响,以及对活化T细胞凋亡的影响。结果:折叠产物可与mAbW6/32特异性结合,在Westernblot的鉴定中呈阳性反应。可溶性HLA-G1可有效地抑制NK细胞的细胞毒作用,抑制混合淋巴细胞培养中T细胞的增殖,促进活化T细胞发生凋亡。结论:体外折叠成功地形成可溶性HLA-G1抗原肽复合物,该复合物具有抑制NK细胞和T细胞的活性。

热休克蛋白-抗原肽复合物疫苗预防肝癌术后复发32例

目的:探讨热休克蛋白-抗原肽复合物(HSP)疫苗预防肝癌术后复发的效果.方法:回顾性分析32例应用HSP疫苗的原发性肝癌患者,并检测治疗前后T细胞亚群、NK细胞活性和血清IL-2受体水平的变化,计算3 a内的生存率,并与对照组比较.结果:治疗组术后3 mo CD3+,CD8+,CD4+/CD8+水平与术前和对照组比较有显著性差异(P<0.05),NK细胞活性较治疗前明显升高(P<0.01);治疗组3a生存率为68.8%,与对照组37.5%比较明显升高(P<0.05).结论:肝癌术后应用HSP疫苗能明显提高患者免疫功能,且可预防术后复发、提高远期生存率.

可溶性HLA-A*0201-PR1复合物的构建与鉴定

为制备HLA-A*0201-PR1四聚体,本课题构建了可溶性的HLA-A*0201-PR1复合物。以原核表达的HLA-A*0201-BSP融合蛋白为重链,β2-微球蛋白(β2m)为轻链,与人工合成的HLA-A2限制性抗原肽PR1(蛋白酶3的第169-177氨基酸,VLQELNVTV)进行共折叠复性,以生成可溶性HLA-A*0201-PR1复合物。应用BirA酶对复性混和物进行生物素化,再经阴离子交换柱纯化,得到生物素化的可溶性HLA-A*0201-PR1复合物。应用凝胶过滤高效液相色谱分析可溶性HLA-A*0201-PR1复合物的生成率。利用HLA-A2构象特异性抗体(BB7.2)及链霉亲和素进行Western blot和ELISA分析,对生物素化的可溶性HLA-A*0201-PR1复合物进行鉴定。结果表明:在折叠体系中,主要含有HLA-A*0201-BSP聚合体、HLA-A*0201-PR1复合物及β2m,其中可溶性复合物生成率约18%。获得的HLA-A*0201-PR1复合物可在BirA酶作用下被有效生物素化。结论:成功地获得了生物素化的可溶性HLA-A*0201-PR1复合物,为进一步制备HLA-A*0201-PR1四聚体创立了基础。

黑色素瘤B16细胞热休克蛋白-抗原肽复合物的体内外抑瘤效应

目的：黑色素瘤Ｂ１６细胞胞浆ＨＳＰ－抗原肽复合物（ＨＡＣ）的制备、免疫原性的诱导及其抑瘤作用的研究。方法：采用Ｔｒｉｓ－ＨＣＩ提取和Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－２００凝胶过滤制备Ｂ１６细胞ＨＡＣ，通过Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠体内诱导特异性ＣＴＬ，再经体内、体外实验检测其抑癌作用。结果：凝胶过滤获得的含６０～９７ｋＤ蛋白的４１，４７和５３管的ＨＡＣ可以降低肿瘤发生率、延长肿瘤出现时间及降低小鼠死亡率。结论：Ｂ１６细胞胞浆中的６０～９７ｋＤ的ＨＡＣ具有免疫原性及抑瘤作用，为制备肿瘤疫苗提供了实验依据。

小鼠肺腺癌热休克蛋白70-抗原肽复合物的纯化

目的 探索肿瘤热休克蛋白 70抗原肽复合物 (HCA70 )分离、纯化的方法。方法 采用低渗、反复冻融匀浆、ADP -Agarose亲和层析结合DEAE离子交换层析 ,从体外培养的小鼠肺腺癌细胞 (LA - 795)中纯化HAC70 ;通过SDS -PAGE电泳、Westernblot检测、小鼠移植瘤动物实验证实所获得蛋白是否为HAC70。结果 获得蛋白分子量为 70kD左右 ,与抗HSP70特异单抗结合 ,用此蛋白主动免疫的小鼠可抵抗LA795细胞的攻击 ,获得了高纯度的HAC70。结论 采用ADP -Agarose亲和层析结合DEAE离子交换层析可获得高纯度的HAC70。

HSP70-肝癌抗原肽复合物修饰DC瘤苗对CIK细胞增殖活性及表型变化的影响

目的研究热休克蛋白70(HSP70)-肝癌抗原肽(SMMC7721人肝癌细胞株)复合物修饰的树突状细胞(DC)对细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞的增殖活性及表型的影响。方法获取健康供者的外周血单个核细胞(PBMC),培养2 h,贴壁细胞诱导分化DC,非贴壁细胞用于诱导培养CIK细胞,DC生长第7日开始负载HSP70(A组)、肝癌抗原肽(B组)、HSP70-肝癌抗原肽复合物(C组),另设单纯DC组(D组),流式细胞检测CD80、CD86的表达,体外构建HSP70-抗原肽复合物-DC瘤苗,并将其和CIK细胞按1∶10的比例混合培养5 d,四甲基偶氮唑蓝法检测细胞增殖能力,以流式细胞仪检测DC及CIK细胞膜表面分子表达。结果 HSP70-肝癌抗原肽复合物可促进DC成熟,DC表面分子CD86、CD80在C组表达均较D组高(P均<0.01)。HSP70-肝癌抗原肽复合物-DC瘤苗可明显刺激CIK细胞的增殖。HSP70-肝癌抗原肽复合物-DC瘤苗与CIK共培养可使CIK细胞CD3^+CD8^+、CD3^+CD56^+的表达提高,与单纯培养CIK细胞比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论 HSP70-肝癌抗原肽复合物能提高DC表面分子CD80、CD86等表达,诱导DC的成熟,HSP70-抗原肽复合物-DC瘤苗与CIK细胞共培养可明显增加CIK细胞的增殖活性,提高CIK细胞CD3^+CD8^+、CD3^+CD56^+的表达。

HLA-表位肽四聚复合物检测系统在研究HBV/HCV抗原特异性CTL中的应用

HLA I-表位肽四聚复合物检测系统(简称:四聚复合物检测系统)是以生物素-亲和素、人工制备的HLAI类分子、β2-M和特异性抗原表位多肽构建的四聚复合物,模拟靶细胞膜表面的HLAI类分子-表位复合物检测系统。它通过T细胞受体识别并结合相应表位的特异性CTL,以生物素-荧光标记的亲和素为标记物并利用流式细胞仪进行定量检测和分拣;它能在体外直接定性、定量检测T细胞群中的特异性CTL,因而对微生物感染、肿瘤、移植排斥等疾病的细胞免疫学研究将产生重大的影响。本文着重介绍了该技术在HBV/HCV感染研究中的应用进展。

三种白癜风抗原肽HLA-A*0201四聚体的构建和临床初步应用

目的：体外构建三种白癜风抗原肽HLA-A ＊ 0201复合物四聚体,并用其检测白癜风患者外周血中抗原特异性细胞毒性CD8＋T细胞（CTL）.方法：取原核表达HLA0201＊-BSP和β2M蛋白,分别同MelanA 26-35、gp100 209-217、tyrosinase 1-9三种白癜风抗原肽进行体外复性折叠,形成可溶性抗原肽HLA-A＊0201复合物,经BirA酶作用并通过凝胶过滤层析法纯化得复合物单体,再与藻红蛋白标记的链霉亲合素按4：1比例耦合成四聚体,并采用斑点印迹法对上述构建的四聚体进行鉴定.运用流式细胞术检测分析该四聚体结合白癜风患者外周血中特异性CTL的能力.结果：斑点印迹检测显示三种具有天然构象的生物素化的白癜风抗原肽HLA-A＊0201四聚体复合物构建成功;流式细胞术检测结果显示所制备的四聚体可与白癜风患者血液中抗原特异性CTL结合.结论：成功制备了三种具有完整构象的生物素化白癜风抗原肽HLA-A＊ 0201四聚体,此四聚体均可检测白癜风抗原特异性CTL.

抗原特异性CTL检测新技术——可溶性MHC-肽四聚复合物法的功能和应用

可溶性MHC 肽四聚复合物法是近年来发展起来的一种定量检测抗原特异性CTL的新方法。该法将特异性抗原肽段、可溶性MHC分子及 β2 微球蛋白在体外正确折叠构建四聚体 ,并结合流式细胞仪定量检测外周血及组织中抗原特异性CTL的比率 ,广泛用于感染性疾病、肿瘤及自身免疫性疾病的研究 ,是一种很有前景的科研工具。

鼠胰岛素B链HLA-A*0201限制性CTL表位拮抗型改造肽的设计与鉴定

目的设计并鉴定具有负调致病细胞毒性T细胞(cytotoxic Tlymphocyte,CTL)免疫应答功能的改造肽配体(al-tered peptide ligand,APL),为基于胰岛素自身抗原的I型糖尿病特异性免疫治疗奠定基础。方法利用InSilico技术模拟构建TCR-pMHC(TCR-HLA-A*0201-mInsB5-14)复合物三维结构,根据结构选择改造位点P6;通过保守/不保守单个氨基酸虚拟替换得到若干候选APL;通过自由能变化计算、相对亲和力检测、细胞因子分泌水平检测等体外功能实验,初步鉴定具有拮抗效应的APL。结果筛选得到的APL mInsB5-14H6F(H→F)与天然肽mInsB5-14空间结构相似,能与HLA-A*0201分子结合,其HLA-A*0201分子的相对亲和力与mInsB5-14相近。该APL作用下mInsB5-14刺激CD8+T细胞分泌IFN-γ的水平明显低于天然肽单独刺激下特异性CTL分泌IFN-γ的水平(P<0.05)。结论基于天然自身抗原表位mInsB5-14改造得到的mInsB5-14H6F是HLA-A*0201限制性的APL,该APL通过降低致病CTL特异性分泌IFN-γ的水平,可能诱导HLA-A*0201转基因NOD小鼠的自身耐受,从而为I型糖尿病治疗性疫苗的研发奠定了基础。

HBc-HLA-A＊ 1101-β2m复合物单体及其四聚体的制备和鉴定

目的制备HBc-HLA-A ＊ 1101-β2m复合物单体和四聚体,并对其特异性进行了鉴定。方法原核高效表达的HLA-A ＊ 1101-BSP和β2m蛋白,在抗原肽（乙型肝炎病毒的核心蛋白HBc88-96）的存在下,体外复性折叠成可溶性的HLA-A ＊ 1101抗原肽复合物单体,经BirA酶作用并通过凝胶过滤层析法纯化复合物单体;然后将此复合物单体与藻红蛋白标记的链霉亲和素按一定比例耦合构建成四聚体;最后用流式细胞仪检测分析该四聚体结合特异性CTL的能力。结果Western blot和Dot-ELISA检测显示所制备的HLA-A ＊ 1101抗原肽复合物单体具有天然构象,且可被生物素化;流式细胞仪分析显示所制备的四聚体可与HLA-A11^＋供者的抗原特异性CTL结合。结论成功制备了具有完整构象的生物素化HLA-A ＊ 1101抗原肽复合物单体;此四聚体可以特异检测抗原特异性的细胞毒性T细胞。