加载HPV6E7抗原肽的HLA-A2单体及其四聚体的制备和鉴定

目的制备可生物素化的可溶性HLA-A2/HPV6E7单体,进一步组装成PE标记的可溶性HLA-A2/HPV6E7四聚体。方法以原核表达的sHLA-A2BSP为重链,β2m为轻链,与人工合成的HPV6E7(22-30)抗原肽(GLH-CYEQLV)利用稀释法进行共折叠复性得到单体。利用HLAI类分子单抗(W6/3)和抗Bzm抗体进行Westernblot和ELISA鉴定折叠产物的构象。以BirA酶对其进行生物素化,经过超滤离心后得到纯化的sHLA-A2/HPV6E7单体,再与Streptavidin-PE按4:1比例混合形成四聚体。结果该四聚体具有与HLA-A2阳性HPV6感染的CA患者的抗原特异性CTL结合活性。结论成功获得了天然构象的sHLA-A2/HPV6E7单体及PE标记的HLA-A2/HPV6E7四聚体。

反义HLA-A2和GDNF共表达逆转录病毒载体的构建和鉴定

为构建GDNF和反义HLA -A2共表达的逆转录病毒载体,将人GDNF酶切片段(XhoI/SalI)克隆于逆转录病毒载体pLNCX2 的XhoI位点,再将HLA A2cDNA片段反向克隆于上述重组载体的HindIII/SalI位点,对其作酶切鉴定和测序后转染PA317包装细胞系进行病毒的包装。收获重组病毒感染的NIH3T3并进行病毒滴度的测定,GDNF及HLA- A2表达的RT -PCR检测,进一步感染人胚肺成纤维细胞,观察GDNF分泌情况。结果表明:GDNF和反义HLA -A2两片段的序列和插入方向完全正确,包装后获得的重组病毒的平均滴度为5×105 CFU/ml。RT PCR显示:在小鼠源性的PA317细胞中有人GDNF和HLA A2的表达,ELISA法测得病毒感染人胚肺成纤维细胞上清液中GDNF含量为450pg/ml。通过本实验,我们获得能共表达GDNF和反义HLA -A2的重组逆转录病毒,其转染的人成纤维细胞具有合成GDNF的能力。

HPV16E7抗原HLA-A2限制性CTL表位预测及其合成

目的 预测、合成、纯化及鉴定人乳头瘤病毒E7抗原的HLA A2限制性细胞毒性T淋巴细胞表位 ,为表位抗原特异性鉴定和临床研究提供靶肽。方法 采用超模体、多项式和量化模体方案相结合的方法 ,对靶抗原HPV16E7的HLA A2限制性细胞毒性T淋巴细胞 (CytotoxicTlymphocyte ,CTL)表位进行预测 ,并运用固相合成法合成多肽 ,经RP HPLC纯化及纯度分析 ,用质谱进行定性鉴定。结果 分别预测出了 16个、10个和 3个九肽表位 ,确定其中 5个九肽为候选合成表位 ,各合成肽的纯度都在 95 %以上。经质谱分析 ,各肽的分子量测定值与理论值相符。结论 超模体、多项式和量化模体方案联合应用可提高预测效率 ,避免了在研究E7抗原表位时盲目合成多肽 ;所合成的多肽为高纯度靶肽 。

HLA-A2^+供者外周血hCMV特异性CTL的定量及其表型分析

目的:利用加载人巨细胞病毒(hCMV)结构蛋白pp65衍生抗原肽NLV(pp65495-503)的HLA-A0201(A2-NLV)四聚体,探讨四聚体染色条件的优化及其在特异性CTL表型分析中的应用。方法:取HLA-A2+供者外周血,以A2-NLV四聚体/PE在不同条件下染色,然后以anti-CD3-FITC和anti-CD8-APC标记,流式细胞术分析染色结果,寻找四聚体最佳染色条件,并分析特异性CTL的表型和活化抗原表达。结果:以全血样进行四聚体染色结果优于分离的PBMC。A2-NLV四聚体用量为0.3μg时,与100μL全血于4℃温育1h,特异性染色效果最佳,而与CD8-T细胞非特异性结合很低。以此优化条件进行特异性CTL表型分析,结果显示CD28阳性的A2-NLV四聚体特异性CTL的百分率较非特异性CTL低,表达CD57的百分率较非特异性CTL高,CD25分子只表达于活化的特异性CTL上。结论:通过对染色条件进行优化可明显提高四聚体染色的特异性,降低非特异性结合,优化的四聚体染色法能用于抗原特异性CTL的表型和功能分析。

人肿瘤转移相关抗原肝素酶HLA-A2.1限制性CTL表位的预测及初步鉴定

目的预测并鉴定肿瘤转移相关抗原肝素酶来源的HLA-A2.1限制性CTL表位。方法采用超基序、量化基序和分子模拟相结合的方法,对肝素酶HLA-A2.1限制性CTL表位进行预测,合成候选表位肽;利用T2细胞的特点,对合成的候选肽与HLA-A2.1分子进行亲和力分析,初步验证预测结果;利用标准51Cr释放试验检测特异性CTLs诱导活性。结果在所筛选的5个候选CTL表位中,Hpa(525-533)、Hpa(277-285)、Hpa(405-413)可在体外有效诱导肝素酶特异性CTLs的产生,对肝素酶阳性且HLA-A2阳性的KATO-Ⅲ细胞具有明显的杀伤效应。结论Hpa(525-533)、Hpa(277-285)、Hpa(405-413)有可能是肿瘤抗原肝素酶HLA-A2.1的限制性CTL表位。

基于HCA587的HLA-A2限制性表位肽的体内免疫原性研究

目的检测来源于HCA587的HLA-A2限制性表位肽免疫HLA-A2转基因小鼠后产生细胞应答的水平,筛选出体内具有免疫原性的HLA-A2限制性表位肽。方法将来源于HCA587的候选HLA-A2限制性肽与MHC-Ⅱ类限制性肽HBV-core128-140、不完全弗氏佐剂、Cp G ODN1826联合应用皮下免疫HLA-A2转基因小鼠,用酶联免疫斑点实验(ELISpot)检测小鼠脾细胞表位肽特异性细胞免疫应答的水平,流式细胞术检测表位肽特异性的CD8+T细胞比例。结果在检测的4个表位肽中,p248-256诱导HLA-A2转基因小鼠产生的细胞免疫应答最强,HLA-A2-H-2Kb-p248-256四聚体染色进一步表明p248-256免疫后可产生p248-256特异性的CD8+T细胞。结论来源于HCA587的HLA-A2限制性表位肽中,p248-256具有较强的体内免疫原性。

肿瘤抗原MAGE-3HLA-A2限制性CTL表位的预测

目的预测肿瘤抗原 MAGE- 3的 HL A- A2限制性 CTL 表位。方法以肿瘤特异性抗原 MAGE- 3为研究目标 ,采用基序方案和二级锚点相结合的 CTL 表位预测方法。结果预测出了 MAGE- 3的 6个 HL A- A2限制性 CTL 表位。结论所预测出的 6个 HL A- A2限制性 CTL 表位经后续实验筛选、鉴定后 ,可用于基于 MAGE-

肝癌相关肿瘤抗原HLA-A2限制性CTL表位的预测

目的 :预测肝癌肿瘤抗原的HLA A2限制性CTL表位 .方法 :选择与肝癌相关的肿瘤抗原MAGE 1,MAGE 3 ,MAGE 8,p5 3及AFP为研究目标 ,采用SYFPEITHI基序法远程预测系统和量化基序多项式法结合的预测方法进行HLA A 0 2 0 1限制性CTL表位预测 .结果 :共预测出与肝癌相关的肿瘤相关抗原的 3 5个HLA A2限制性CTL表位 .结论 :两种预测方法结果的一致性较好 ,所预测的 3 5个肿瘤抗原HLA A2限制性CTL表位经实验筛选、鉴定后 ,可望用于新型肝癌治疗性多肽疫苗的设计研究 。

通过两步离子交换层析建立保留HLA-A2二聚体构象的纯化方法

目的建立两步离子交换层析纯化方法以获得浓缩的高纯度HLA-A2二聚体。方法收集转染有HLA-A2-IgG1 Fc重组基因的7A2D细胞上清,并进行ELISA和Western blot鉴定7A2D细胞表达的HLA-A2二聚体,检测其浓度;应用SPA亲和层析和两步法离子交换层析技术分别纯化HLA-A2二聚体,并比较2种方法纯化HLA-A2二聚体的效率。结果7A2D细胞可表达正确构象的HLA-A2二聚体,Western blot检测显示融合蛋白的分子量与预期大小一致,7A2D细胞上清中HLA-A2二聚体的浓度为4.4μg/mL。SPA亲和层析法中pH3.0的洗脱条件使大部分的HLA-A2二聚体发生了变性反应,纯化后构象正确的HLA-A2二聚体纯度为(10.4±1.3)%,回收率仅为(7.3±1.1)%;两步离子交换层析后HLA-A2二聚体纯度为(72.9±4.6)%、回收率为(51.9±6.5)%,均显著高于SPA亲和层析法。结论建立了一种纯化条件相对温和的两步法离子交换层析纯化方法,经过该方法制备获得的高纯度与较高浓度的HLA-A2二聚体可保持正确的空间构象,达到纯化与浓缩的目的。

mPEG-BTC对淋巴细胞表面HLA-A2抗原化学修饰效果评价

目的 研究mPEG BTC有效修饰淋巴细胞表面HLA A2抗原、阻断其与相应抗体间特异性结合的方法。方法 在室温下、pH 7.4的磷酸盐溶液中 ,采用浓度梯度法修饰淋巴细胞表面HLA A2抗原 ,用微量淋巴细胞毒试验检测其修饰效果。结果 经mPEG BTC处理后的淋巴细胞微量淋巴细胞毒试验为阴性。结论 在本实验条件中 ,mPEG BTC对淋巴细胞表面HLA A2抗原具有良好的化学修饰作用 ,可以完全阻断其与HLA A2抗体的反应。

人可溶性单链β2m-HLA-A2-BSP融合蛋白表达载体的构建及其表达

目的构建并表达了人可溶性单链β2m-HLA-A2-BSP(scHLA-A2)融合蛋白表达载体,为进一步制备HLA-A2四聚体及其功能研究奠定了基础。方法应用重叠延伸PCR(overlap-PCR)对编码HLA-A2的cDNA序列进行一个碱基的同义突变,并将β2m和HLA-A2胞外段亚单位两段编码序列的cDNA通过一疏水性多肽接头(Gly4Ser)3的DNA序列进行前后拼接,并利用引物所带的BSP编码序列,构建单链β2m-HLA-A2-BSP融合基因,将测序正确的β2m-HLA-A2-BSP融合基因插入原核表达载体pET-22b中,转化BL21(DE3)细菌,SDS-PAGE检测其表达,融合蛋白于体外抗原肽存在条件下稀释复性后由Western blot鉴定其空间构象。结果经DNA序列分析表明:同义突变与预期结果一致,β2m和HLA-A2-BSPl、inker的连接顺序、方向及序列完全正确,表达载体转化BL21(DE3)细菌后可表达β2m-HLA-A2-BSP融合蛋白,SDS-PAGE显示该融合蛋白分子量为45 kD,与理论值一致,将融合蛋白与特异性抗原肽在体外进行稀释复性后经Western blot鉴定表明该复合物能与HLA-Ⅰ类分子特异性结合的单克隆抗体W6/32结合。结论人可溶性单链β2m-HLA-A2-BSP融合蛋白的构建及其表达获得成功,经体外复性可获得HLA-Ⅰ类分子天然构象。

Survivin-△Ex3蛋白HLA-A2.1限制性CTL表位的基因疫苗抗肿瘤效果初探

预测并合成survivin-△Ex3 HLA-A2.1限制性CTL表位的基因疫苗,探讨携带表位基因的减毒鼠伤寒沙门氏菌口服疫苗对小鼠移植肝癌模型的保护作用。将表位基因序列连接,构建pVAX1-STEsEGFP真核表达载体,转化入减毒鼠伤寒沙门氏菌作为口服疫苗。实验动物分为未免疫对照组、口服沙门氏菌组、pVAX1质粒转染的减毒鼠伤寒沙门氏菌组;口服pVAX1-Survivin-△3(T34A)–EGFP质粒转染的的减毒鼠伤寒沙门氏菌组和口服pVAX1-STEs–EGFP质粒转染的的减毒鼠伤寒沙门氏菌组。结果表明:在5组肿瘤模型小鼠中,肿瘤瘤块平均直径分别为:15.11±2.43 mm、13.70±2.97 mm、13.05±1.77 mm、7.46±2.61 mm、9.05±2.18 mm;表位疫苗组与其他组相比,有显著性差异(P<0.01)。说明小鼠口服携带survivin-△Ex3 HLA-A2.1限制性CTL表位的基因疫苗后,能抑制小鼠肝癌细胞的增殖和扩散。

HLA-肽复合物研究HBV/C区变异对HLA-A2限制性表位的影响

目的 探讨乙型肝炎病毒 (HBV)C区热点变异S87G和 (或 )I97L对细胞毒T细胞表位形成的影响。方法 以我国C基因型HBVDNA参照序列为标准 (EMBL :Y1885 5 1885 8) ,在计算机预测I97L和 (或 )S87G变异对HLA A 0 2 0 1限制性表位影响的基础上 ,利用基因工程制备的HLA A 0 2 0 1轻链、重链多肽在体外只能与相应表位短肽形成稳定复合物的特点 ,对预测到的可疑表位肽段进行验证。结果 I97L时 ,肽段HBcAg 96 10 5 (KLRQLLWFHI)的DC50比正常 (KIRQLLWFHI)时大 5倍以上 ;S87G无影响 ;I97L、S87G没有协同作用。人工合成该短肽在体外不能与HLA A 0 2 0 1轻、重链多肽形成稳定复合物。结论 HBV/C基因I97L和 (或 )S87G变异时 ,没有新的HLA A 0 2 0 1限制表位产生。

TIL识别的HLA-A2限制性人黑色素瘤特异抗原肽的研究

目的探讨TIL识别的人黑色素瘤HLA-A2限制性的肿瘤抗原肽特性。方法通过亲和层析柱从三种肿瘤细胞系(624-Mel、Chap-Mel和JY)中纯化HLA-A2蛋白和结合的多肽分子,经弱酸高温处理和离心超滤后,应用反相-高效液相色谱层析(RT-HPLC)分离各多肽组份,并将其各组份与T2细胞共同孵育、进行重建TIL识别的人黑色素瘤特异表位试验,鉴定肽分子生物活性,通过质谱分析所获活性肽分子特性,参照活性肽序列,制备人工合成肽加以进一步证实。结果从RT-HPLC层析的624-Mel的肽组份,经特异表位鉴定发现3个活性峰(P19、P25和P31)。其中P31,TIL杀伤率达67%,质谱分析表明肽分子量为948,氨基酸序列为H+Ala Lue Trp Lue Phe Phe Gly Val Lue OH-的9肽分子。经特异表位测定表明人工合成肽具有纯化活性肽的生物活性特征。结论分离鉴定的这一9肽分子是一种TIL识别的HLA-A2限制性肿瘤抗原肽,为肿瘤防治、合成肽疫苗的研究奠定了可靠的实验基础。

抗原NY-BR-1的HLA-A2限制性CTL表位的初步鉴定

目的 :鉴定乳腺癌分化肿瘤抗原NY BR 1的HLA A2限制性CTL表位。方法 :采用量化基序法初步预测NY BR 1的HLA A2限制性CTL表位 ;分子动力学方法进一步筛选量化基序法中评分最高的 3个表位肽 ;HLA A2亲合力鉴定预测的结果。结果 :分子动力学和HLA A2亲合力实验均证明 ,在量化基序法预测的 3个候选CTL表位中 ,NY BR 11 0 4 3 1 0 51 与HLA A2亲合力最佳。结论 :NY BR 11 0 4 3 1 0 51 可能为乳腺癌分化抗原NY BR 1的HLA A2限制性CTL表位。

MART-1HLA-A2限制性CTL表位的预测

目的 预测黑色素瘤分化抗原MART 1的HLA A2限制性细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)表位。方法 采用超基序与量化基序多项式方案相结合的办法 ,对目的抗原MART 1的HLA A2限制性CTL表位进行预测。结果 预测出了 6个九肽表位。结论 两种方法预测结果的一致性较好 ,所预测出的 6个MART 1的HLA A2限制性CTL表位经后续实验筛选、鉴定后 ,可望用于新型MART 1肿瘤治疗性多肽疫苗的设计研究 。